TEMA 10 - Metabolismo Del DNA. Replicación

TEMA 10.
Metabolismo del DNA: Replicación

Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular Dra. Rosario Blanco Portales
Dra. Rosario Blanco Portales
Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10
El DNA como portador de la información genética

Dogma central de la genética molecular
Resumen de la transmisión de la información genética
Actualización debido al progreso en el conocimiento de los procesos de transmisión

de la información genética.

Dogma central de la genética molecular
Resumen de la transmisión de la información genética
Conjunto de procesos metabólicos del DNA
Replicación
DNA´
recombinación (errores)
DNA
mutación
DNA´ Reparación
➢ Cada célula de todos los organismos lleva una copia de toda la información genética
que necesita y se denomina GENOMA
➢ Una fracción del genoma de un organismo es capaz de transcribirse. Las zonas

transcribibles se denominan GENES
FUNCION

El DNA es un polímero de nucleótidos unidos por enlaces covalentes
3´-5´fosfodiéster
Modelo Watson y Crick

✓ Es una molécula helicoidal
✓ Está formado por dos cadenas opuestas enrolladas a lo largo
de un eje
✓ El eje azúcar-fosfato se sitúa en el exterior y las bases se
proyectan hacia el interior
✓ Las bases son casi perpendiculares al eje de la hélice.
✓ Existen un surco mayor y menor que permite el acceso a las
bases
Complementariedad de las bases nitrogenadas

El DNA es un polímero de nucleótidos unidos

por enlaces covalentes 3´-5´fosfodiéster
El esqueleto lineal está formado por unidades

alternas de fosfato y pentosa del cual
sobresalen lateralmente las bases T
Replicación y división celular

La replicación se produce de
forma coordinada con la división
celular
La división celular no se produce

hasta que no acaba la replicación
Ocurre la síntesis del ADN

REPLICACIÓN
Replicación del ADN

La REPLICACIÓN es el proceso mediante el cual a partir de una molécula de ADN parental se sintetiza otra originándose
dos moléculas hijas de secuencia idéntica a la molécula de ADN original
Las dos hebras no se separan completamente sino que la molécula se desenrolla y se va abriendo a medida que se produce su replicación
➢ La Replicación es un proceso semiconservador
Existían tres posibles mecanismos

para la replicación:
✓ Mecanismo conservador
✓ Mecanismo dispersante
✓ Mecanismo semiconservador
Se demostró experimentalmente
que el correcto era el mecanismo
semiconservador
Replicación del ADN Experimento de Meselson y Stahl (1957)

➢ La Replicación es un proceso semiconservador
15N: isótopo infrecuente

14N: isótopo habitual

➢ La Replicación es un proceso
semiconservador
Experimento de Meselson y Stahl (1957)
RESULTADO del experimento


➢ La Replicación es un proceso simultáneo, secuencial y bidireccional
✓ La síntesis del ADN no comienza al azar sino

en puntos concretos denominados orígenes
de replicación.
✓ La síntesis de las dos hebras es simultánea.
✓ La separación de las dos hebras es

bidireccional
✓ Debido a a que las hebras son antiparalelas,

su separación y el avance de la horquilla de
replicación progresa en sentido opuesto
Procariotas: replicación monofocal (ori c)

Eucariotas: replicación multifocal
Enzimología de la Replicación
La reacción la lleva a cabo una DNA polimerasa
✓ Cebador. Pequeño fragmento iniciador que aporta un extremo 3´-OH libre (RNA)
Requerimientos de ✓ Sustratos. Los cuatro dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
la síntesis de DNA ✓ Cofactor. Mg2+
✓ Molde. Molécula de DNA que se usa de plantilla para la incorporación dNTPs
La replicación comienza con la adición de un dNTP complementario a la hebra molde al lado del cebador de
RNA en posición 3´ y la formación de un nuevo enlace fosfodiéster.
La síntesis transcurre siempre en sentido 5´ 3´.

Enzimología de la Replicación
La replicación comienza con la adición de

un dNTP complementario a la hebra
molde al lado del cebador de RNA en
posición 3´ y la formación de un nuevo
enlace fosfodiéster.
Son enzimas dirigidas por un molde
La ruptura del enlace fosfoanhidro del

dNTP y de la hidrólisis del PPi
proporciona la energía necesaria para
impulsar la reacción
La síntesis transcurre siempre en sentido 5´ 3´.

La reacción la lleva a cabo una DNA polimerasa
Enzimología de la Replicación. DNA polimerasas en procariotas

Las ADN polimerasas catalizan la formación de cadenas de polinucleótidos mediante la adición sucesiva de
nucleótidos. Son enzimas dirigidas por un molde
La primera DNA polimerasa identificada fue la DNApol-I de E. coli
(Kornberg, 1955)
Posteriormente se identificaron la DNApol-II y DNApol-III
✓ DNApol-III realiza la mayor parte de la replicación
✓ DNApol-I y DNApol-II se encargan de funciones auxiliares
DNA polimerasa in vitro 1 error/104-105 nt

Actividad exonucleasa 3´-5´ correctora Actividad exonucleasa 5´-3´
Mejora la fidelidad del proceso de replicación 102 y 103 veces

Enzimología de la Replicación. DNA polimerasa I de E. coli

La primera DNA polimerasa identificada fue la DNApol-I de E. coli (Kornberg, 1955)
Está compuesta por una subunidad grande (Klenow) que posee la actividad
Tiene:
polimerasa y la actividad exonucleasa 3´-5´ y una subunidad pequeña que posee la
✓ Actividad polimerasa actividad 5´- 3´
✓ Actividad exonucleasa 3´-5´
✓ Actividad exonucleasa 5´-3´

Todas las ADN polimerasas presentan características estructurales comunes
Estructura del fragmento Klenow de la DNApol-I Contiene tres dominios: dedos, pulgar y palma
o El dominio de los dedos y el pulgar envuelven a la molécula de ADN.
o La palma contiene el centro activo de la polimerasa.
En la palma de las DNA-polimerasas se

encuentran 2 iones Mg2+ que intervienen en la
reacción
Un ión Mg2+ se coordina con el 3´-OH del cebador

y el otro se une al dNTP.
El grupo hidroxilo ataca al grupo P del dNTP para
formar el nuevo enlace fosfodiéster
El dominio exonucleasa 3´-5´ participa en la

detección y corrección de errores durante la
polimerización

El proceso de replicación tiene una alta fidelidad
o Formación de puentes de H
La fidelidad viene determinada por la alta especificidad de la replicación que depende de
o Complementariedad de bases
Existen mecanismos adicionales que incrementan la fidelidad
“Regla” de espaciamiento adecuado en el centro activo

Las ADN polimerasas donan dos puentes de hidrógeno a
parejas de bases del surco menor. Los aceptores se localizan
siempre en estas posiciones en todos los pares de bases de
Watson y Crick

El proceso de replicación tiene una alta fidelidad
o Formación de puentes de H
La fidelidad viene determinada por la alta especificidad de la replicación que depende de
o Complementariedad de bases
Existen mecanismos adicionales que incrementan la fidelidad

Selectividad de la forma
La unión de un nucleósido trifosfato al centro
activo de una ADN polimerasa desencadena un
cambio conformacional: el dominio de los
dedos gira para formar una cavidad rígida en la
cual sólo podrá acomodarse un par de bases
con la forma apropiada.
Enzimología de la Replicación. DNAs polimerasas eucarióticas

Son diferentes a las procariotas aunque presentan cierta similitud
✓ DNApol-α
Actividad primasa: inicia la síntesis de un ARN
cebador
Actividad polimerasa: elongación inicial a
partir del cebador
✓ DNApol-δ y Ɛ
Actividad polimerasa: responsables de la
mayor parte de la elongación de ambas hebras
Actividad 3´-exonucleasa: eliminan bases
erróneas
✓ DNApol-β
Actividad polimerasa: responsable de la
reparación de errores o daños del DNA. No
interviene en la replicación.
INICIO DE LA REPLICACIÓN: El origen de replicación en E. coli
¿En qué lugar de la molécula comienza la replicación?
En E. coli comienza en el origen de replicación denominado locus ori C
245 pb
Consenso TTATCCACA
✓ 4 repeticiones de una secuencia que sirven de unión para la proteína de iniciación dnaA
✓ Varias secuencias de 13 pb ricas en A-T dispuestas en tándem
INICIO DE LA REPLICACIÓN El origen de replicación en E. coli

245 pb
(a) Unión al origen
Consenso TTATCCACA
a. La proteína dnaA se une a las 4 secuencias repetidas y el ADN (b) Desnaturalización

de las zonas ricas en
se enrolla sobre ellas.
AT
b. Las regiones ricas en AT se desnaturalizan secuencialmente.
c. La proteína dnaB con actividad helicasa se unen y relajan el
ADN para la síntesis posterior
(c) Unión de la
helicasa dnaB
Primasa (DnaG ) Proteínas SSB Burbuja de
(síntesis de cebadores RNA para (proteínas de unión replicación
comienzo de la elongación) a cadena sencilla)
El origen de replicación en Eucariotas

En eucariotas, la replicación es multifocal
con múltiples orígenes de replicación
Aquella región del ADN que se replica a
partir de un mismo origen de replicación
se denomina REPLICÓN
✓ DNApol-α
Actividad primasa: inicia la síntesis de un ARN cebador
Actividad polimerasa: elongación inicial a partir del cebador
Inicio de la replicación
El complejo multiproteico formado por todas las proteínas que participan en el
enrollamiento/desenrollamiento del DNA junto con las DNA polimerasas se denomina REPLISOMA
✓ Helicasas.
Se unen al ADN y actúan separando sus dos hebras en un proceso que requiere el
consumo de ATP.
✓ Proteínas de unión a hebra sencilla.
Se unen a las hebras de ADN de cadena sencilla para evitar que se puedan volver a
emparejar.
o Procariotas: proteínas SSB (single strand binding protein)
o Eucariotas: proteína de replicación A (RPA).
✓ Topoisomerasas.
Eliminan los superenrollamientos producidos por el avance de la helicasa sin
modificar la estructura del ADN.
✓ Primasa.
Sintetiza el cebador de ARN a partir del que la polimerasa llevará a cabo la
elongación de la hebra nueva.
o Procariotas: La primasa es una proteína independiente (dnaG) que forma parte
de un complejo proteico denominado primosoma
o Eucariotas: la actividad primasa reside en la DNApol-α (DNApol-α/prim)
Elongación de la replicación
Todas las DNA polimerasas sintetizan ADN en dirección 5`-3`
Este problema se soluciona sintetizando de forma
Hebra conductora continua una de las hebras (hebra líder) y la otra
(síntesis continua)
(hebra retardada) en forma de pequeños
fragmentos llamados fragmentos de Okazaki
A medida que la replicación prosigue, una ligasa se
encarga de unir covalentemente estos fragmentos
Hebra retardada
y dar lugar a la hebra retardada
(síntesis discontinua)
Los fragmentos de Okazaki se

generan a partir de cebadores
sintetizados por la primasa
5´
3´
Enlace fosfodiéster
La ADN Polimerasa I participa en la eliminación de los

ARN cebadores de los fragmentos de Okazaki.
La ADN ligasa participa con posterioridad uniendo los
fragmentos resultantes de ADN
La ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster

entre el grupo 3´-OH del extremo de un fragmento y el grupo
P en posición 5´ del extremo de otro fragmento.
La energía utilizada procede de la hidrólisis de ATP

La replicación necesita polimerasas con un alto nivel de progresividad
La progresividad hace referencia a la capacidad del enzima de catalizar muchas reacciones consecutivas
sin desprenderse de la cadena de ADN
La DNA-polimerasa III es una holoenzima que ha evolucionado para sujetarse a su molde y no

desprenderse de él hasta haberlo replicado por completo
✓ Es un dímero asimétrico
✓ La subunidad α es la polimerasa
✓ La subunidad ε es la exonucleasa correctora 3´-5´
✓ La progresividad la aportan β2
10 tipos de cadenas polipeptídicas

~ 900 Kd
La DNA-polimerasa III es una holoenzima que ha evolucionado para sujetarse a su molde y no

desprenderse de él hasta haberlo replicado por completo
La subunidad β2 tiene forma de anillo con un orifico en el centro donde acomoda al

dúplex de ADN y puede deslizarse sobre él (1000 nt/seg)
Ambas hebras se sintetizan de forma coordinada
Síntesis de la hebra guía

Ambas hebras se sintetizan de forma coordinada
Síntesis de la hebra retardada
Se forma un bucle para orientar la hebra retardada

de manera que la polimerasa pueda actuar en sentido
5´-3´
La polimerasa abandona la hebra retardada cada

1000 nt.
Entonces, se forma un nuevo bucle, la primasa

sintetiza un nuevo cebador y comienza la síntesis de
un nuevo fragmento de Okazaki
La Replicación en procariotas
Modelo de la horquilla de replicación de E. coli
1. Una helicasa, una primasa y la ADNpol-III llevan a

cabo la síntesis coordinada de las dos hebras
2. Formación del primosoma. Unión de la PRIMASA

(RNA polimerasa) que sintetiza el ARN cebador (5 nt).
3. La topoisomerasa se sitúa en la cabeza de la horquilla

relajando la molécula antes de su apertura.
4. La DNApol-I elimina los cebadores de ARN y rellena

los huecos.
1. La ligasa une los fragmentos de Okazaki sintetizados a

partir de la cadena retardada
La Replicación en eucariotas
Modelo de la horquilla
de replicación en
Eucariotas
✓ DNApol-α
Actividad primasa: inicia la síntesis de un ARN
cebador
Actividad polimerasa: elongación inicial a partir
del cebador
✓ DNApol-δ y Ɛ
Actividad polimerasa: responsables de la mayor
parte de la elongación de ambas hebras
Actividad 3´-exonucleasa: eliminan bases erróneas
Aunque no aparecen en este modelo, también participan las

Topoisomerasas para controlar los superenrollamientos y la Ligasa I para
unir los fragmentos de Okazaki
La Replicación en eucariotas
Terminación de la replicación en procariotas
La Topoisomerasa IV separa las cadenas mediante rotura transitoria del

cromosoma
Terminación de la replicación en eucariotas

La terminación de la elongación en la replicación de dos replicones previsiblemente se producirá cuando sus horquillas de
replicación se encuentren
Todos los cebadores intermedios son

eliminados por FEN1 y Rnasa H1. Los
fragmentos se unen mediante la
ligasa

La terminación de la elongación en la replicación de dos replicones previsiblemente se producirá cuando sus horquillas
de replicación se encuentren
Cuando se replica un cromosoma lineal, los

cebadores intermedios y de los extremos son
eliminados por nucleasas.
Los huecos internos se pueden rellenar pero
los extremos no
La secuencia del extremo de los cromosomas se denomina

telómero
Propiedades
Existen evidencias que sugieren que la
hebra sencilla forma un bucle hacia atrás
✓ Su secuencia tiene cientos de repeticiones de una
para crear un dúplex con una de las
secuencia de 6 nucleótidos
secuencias repetidas
✓ Una de las hebras es más larga y enriquecida en G

Los telómeros se replican por las TELOMERASAS, que
son las encargadas de sintetizar las secuencias
repetidas de los extremos del cromosoma
La TELOMERASA es una transcriptasa inversa

especializada que lleva su propio molde de ARN
La enzima contiene una molécula de ARN que actúa de molde
para la elongación de la hebra enriquecida en G.
La longitud depende de la especie (9-28 nt)
Mutaciones del ADN

Las mutaciones implican cambios en la secuencia de bases del ADN que hay que reparar
Tipos de mutaciones
✓ Sustitución de un par de bases por otro

Es frecuente
La sustitución de una purina por otra o de una pirimidina por otra: transición
La sustitución de una purina por una pirimidina o viceversa: transversión
✓ Eliminación o deleción de uno o varios pares de bases

✓ Inserción de uno o varios pares de bases
Mutaciones del ADN

Mutágenos
✓ Análogos de bases (5-bromouracilo es un análogo de la timina, produce transiciones)
✓ Mutágenos que producen modificación química de las bases (ácido nitroso, produce transiciones)
✓ Mutágenos aromáticos que se intercalan en el ADN (acridina, produce inserción o eliminación)
✓ Luz UV, que produce dímeros de pirimidina
El ac. nitroso transforma la adenina en hipoxantina que empareja con la citosina

Reparación del ADN

Las mutaciones implican cambios en la secuencia de bases del ADN que hay que reparar
✓ Reparación directa
Tres tipos de reparaciones
✓ Reparación por escisión de bases
✓ Reparación por escisión de nucleótidos
En la reparación directa, la región dañada se corrige in situ

En la reparación por escisión de nucleótidos, se elimina un fragmento de ADN en torno al lugar dañado y se reemplaza
En la reparación por escisión de bases, la base dañada se retira y se reemplaza
Reparación por escisión de bases
Reparación directa
Reparación por escisión de nucleótidos

Reparación del ADN

Ejemplos de reparaciones
Reparación por escisión
Sustitución de U

TEMA 10 - Metabolismo Del DNA. Replicación

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

TEMA 10 - Metabolismo Del DNA. Replicación

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

TEMA 10.

Metabolismo del DNA: Replicación

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

El DNA como portador de la información genética

Actualización debido al progreso en el conocimiento de los procesos de transmisión

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

El DNA como portador de la información genética

Conjunto de procesos metabólicos del DNA

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

El DNA como portador de la información genética

➢ Una fracción del genoma de un organismo es capaz de transcribirse. Las zonas

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

El DNA como portador de la información genética

Modelo Watson y Crick

Complementariedad de las bases nitrogenadas

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

El DNA como portador de la información genética

El DNA es un polímero de nucleótidos unidos

El esqueleto lineal está formado por unidades

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

Replicación y división celular

La división celular no se produce

Ocurre la síntesis del ADN

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

Replicación del ADN

➢ La Replicación es un proceso semiconservador

Existían tres posibles mecanismos

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

Replicación del ADN Experimento de Meselson y Stahl (1957)

15N: isótopo infrecuente

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

Replicación del ADN

RESULTADO del experimento

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

Replicación del ADN

✓ La síntesis del ADN no comienza al azar sino

✓ La síntesis de las dos hebras es simultánea.

✓ La separación de las dos hebras es

✓ Debido a a que las hebras son antiparalelas,

Procariotas: replicación monofocal (ori c)

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

La síntesis transcurre siempre en sentido 5´ 3´.

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

La replicación comienza con la adición de

Son enzimas dirigidas por un molde

La ruptura del enlace fosfoanhidro del

La síntesis transcurre siempre en sentido 5´ 3´.

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

Enzimología de la Replicación. DNA polimerasas en procariotas

DNA polimerasa in vitro 1 error/104-105 nt

Mejora la fidelidad del proceso de replicación 102 y 103 veces

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

Enzimología de la Replicación. DNA polimerasa I de E. coli

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

Enzimología de la Replicación. DNA polimerasa I de E. coli

En la palma de las DNA-polimerasas se

Un ión Mg2+ se coordina con el 3´-OH del cebador

El dominio exonucleasa 3´-5´ participa en la

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10

Enzimología de la Replicación. DNA polimerasa I de E. coli

“Regla” de espaciamiento adecuado en el centro activo

Metabolismo del DNA. Replicación Tema 10