1.

Objetivo

Realizar eficazmente la determinación del Grupo Sanguíneo RH (D)

2. Alcance

Pacientes ambulatorios, urgencias y hospitaliza

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 dos del Laboratorio.

3. Definiciones

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  Aglutinación El anticuerpo al fijarse sobre los hematíes favorece su aglutinación. Estos
anticuerpos que reaccionan en medio salino se conocen como anticuerpos
"completos" o aglutinantes
 Anticuerpo Los anticuerpos son proteínas plasmáticas que se han generado en el
organismo como respuesta a la entrada de un antígeno. Pertenecen al grupo de las
globulinas, se hallan situadas en la fracción denominada gamma y debido a su relación
directa con la inmunidad se conocen con el nombre de Inmunoglobulinas (Igs).
 Anticuerpo monoclonal Al anticuerpo que es específico de un antígeno y que es
producido por un hibridoma de célula B (una línea celular derivada por la fusión de
una sola célula B normal con una línea tumoral de células B inmortales). Los
anticuerpos monoclonales se usan extensamente en investigación y en el diagnóstico
clínico y el tratamiento.
 Antisuero Al suero que contiene anticuerpos específicos de ese antígeno.
 Especificidad A la característica que presentan los anticuerpos de reaccionar
únicamente con su antígeno correspondiente
 Avidez Al tiempo que tarda en reaccionar un anticuerpo con su antígeno
correspondiente.
 RHT Reacción hemolítica Transfusional
 EHRN Enfermedad hemolítica del recién nacido
 Antígeno Sustancia capaz de provocar una reacción o respuesta inmunitaria, tras su
unión específica provoca una respuesta inmune.
 Epítopo Porción específica de un antígeno macromolecular al cual se une un
anticuerpo.

4. Responsabilidades

 Jefe de Laboratorio: La implementación de la técnica

 Químico(a): El cumplimiento de lo establecido en la técnica

 Coordinador de Calidad: Velar por el cumplimiento de lo establecido en este

documento mediante inspecciones y auditoria

5. Descripción
Fue Levine en 1939 el primero que detectó un anticuerpo que aglutinaba el 85% de las distintas
sangres humanas, en el suero de una mujer, madre de un niño afecto de EHRN; posteriormente en
1940 Landsteiner y Wiener, a través de experimentos de inmunización en conejos y cobayas con
hematíes de monos Macacus rhesus aislaron un anticuerpo que, convenientemente diluido,
aglutinaba también el 85% de las sangres humanas.
Los sujetos cuyos hematíes aglutinaban con el suero anti-Rhesus fueron denominados Rh-
positivos, y el 15% restante, Rh-negativos; si bien dichas denominaciones se refieren a la presencia
o ausencia del antígeno “D” en los hematíes. El sistema Rh es en realidad un sistema muy

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complejo, el segundo en importancia en Medicina Transfusional, y el que está compuesto de un
mayor número de antígenos.

El grupo Rh comprende unos 55 antígenos individuales de los que rutinariamente, se identifican

cinco: D, C, c, E, y e (Tabla 1), cuyas denominaciones varían en función de la nomenclatura elegida
(ISBT, Fisher-Race, Wiener). El primer antígeno del sistema Rh en ser definido fue el Rho, o
“D”. Este antígeno puede expresarse o estar ausente, dando lugar al llamado fenotipo Rh-positivo
(D-positivo) y Rh-negativo (D-negativo), respectivamente; ningún antígeno antitético al D se ha
documentado, sin embargo, el símbolo “d” se usa comúnmente para denotar la ausencia del
antígeno D.

Tabla 1 Principales
antígenos del
sistema Rh con sus
respectivas
nomenclaturas
ISBT Fisher-Race Wiener Rosenfield
001 D Rho Rh1
002 C rh´ Rh2
003 E rh´´ Rh3
004 c hr´ Rh4
005 e hr´´ Rh5
006 f (ce) hr Rh6
007 Ce rh₁ Rh7
008 Cʷ rhʷᴵ Rh8
009 Cˣ rhˣ Rh9
010 V (ceˢ ) hrᵛ Rh10
011 Eʷ rhʷ² Rh11
012 G Rhᴳ Rh12

Con posterioridad y durante la década de los años 40 se fueron identificando cuatro antígenos
adicionales: C, E, c, y e. De tal manera que éstos antígenos junto al D, son los más importantes en
medicina transfusional, ya que se ven implicados en el 99% de los casos de situaciones clínicas
relevantes. La distinta presencia de unos u otros antígenos, determina los llamados complejos
génicos o haplotipos del sistema Rh (Tabla 2).

Tabla 2 Complejos
génicos del sistema Rh
Fisher-Race Wiener Antígenos presentes
CDe R1 D, C, e
cDE R2 D, c, E
CDE Rz D, C, E

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 cDe Ro D, c, e
Cde r' C, e
cdE r" c, E
CdE ry C, E
cde r c, e

Dos genes homólogos localizados en el cromosoma 1 codifican los polipéptidos no glicosilados que
expresan los antígenos del sistema Rh. El gen RhD, determina la presencia de una proteína que
confiere la actividad D en la membrana eritrocitaria, lo que hace que los hematíes sean Rh
“positivos”; en las personas Rh “negativas” éste gen está ausente. El gen RhCE, determina los
antígenos C, c, E, y e, mediante sus alelos correspondientes: RhCe, RhCE, RhcE, y Rhce.
El fenotipo del sistema Rh, se realiza determinando la presencia o ausencia de los cinco antígenos
principales: D, C, c, E, y e. Una vez determinados se obtiene el fenotipo existente y el probable
genotipo

Existen diversas variaciones antigénicas del antígeno D, debido a la ya mencionada complejidad

del sistema Rh, y en especial a su estructura de “mosaico” con más de 35 componentes; de forma
didáctica la más importante es D débil.
La importancia práctica del D débil radica en que puede sensibilizar a un receptor D negativo. Por
consiguiente, es necesaria la realización de técnicas más apropiadas para la detección de
individuos D débil, al objeto de evitar la transfusión de sangre erróneamente clasificada como Rh
negativa; por lo que a efectos transfusionales las unidades de sangre D débil deben considerarse
con Rh-positivas y transfundirse sólo a pacientes D-positivos; y los receptores D débil deben
considerarse como Rh-negativos.

La mayoría de los glóbulos rojos D + muestran una clara aglutinación macroscópica después de la
centrifugación con reactivo anti-D y pueden ser fácilmente clasificados como D +. Glóbulos rojos
que no son inmediatamente o directamente aglutinados no pueden ser fácilmente clasificados.
Para algunos glóbulos rojos D +, la demostración del antígeno D requiere incubación con el
reactivo anti-D o adición de globulina antihumana (AHG), después de la incubación con anti-D
(prueba indirecta de antiglobulina). Estas celdas son consideradas D +.
En el pasado, los glóbulos rojos que requerían pasos adicionales para la demostración de D fueron
clasificados como Du. El término Du ya no es considerado apropiado; glóbulos rojos que portar
formas débiles de D se clasifican como D + y deben describirse como "D débil".
Mejora de reactivos policlonales y el uso más generalizado de reactivo anti-D monoclonal han
resultado en la detección de rutina de glóbulos rojos D + que tendrían sido considerado D débil
cuando se prueba con reactivos policlonales menos sensibles. Adicionalmente, monoclonal anti-D
puede reaccionar por directa aglutinación con epítopes de D que tenían anteriormente se requería
una prueba más sensible métodos o, ocasionalmente, pueden dejar de reaccionar con algunos
epítopes del antígeno D A la inversa, algo de anti-D monoclonal puede reaccionar mediante
prueba directa con epítopes D raros que no fueron detectados con reactivos policlonales (por
ejemplo, DHAR y Crawford). Es importante tomar en cuenta de que los reactivos anti-D difieren
entre los fabricantes y de conocer las características del producto que se está utilizando.

Anticuerpos del sistema Rh

Todos los anticuerpos frente a antígenos del sistema Rh deben ser considerados potencialmente
capaces de causar RHT y EHRN. Cuando un anticuerpo frente al sistema Rh es reactivo en fase de

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antiglobulina (la mayoría de los mismos), unidades de sangre carentes del antígeno
correspondiente deben seleccionarse y cruzarse.
Son habitualmente de clase IgG, y la mayoría no fijan el complemento.
El anti-D puede causar RHT severas si se transfunden hematíes D-positivos, y EHRN severa en un
feto D-positivo. Es el anticuerpo inmune más común en el suero humano; el anti-D es
generalmente una IgG y reacciona mejor en fase de antiglobulina y enzimática. Unidades de
sangre D negativas se deben utilizar para la transfusión ante su presencia. Dado que el antígeno D
tiene una estructura de “mosaico” con más de 35 componentes, en raras ocasiones personas D+
pueden carecer de algún componente, y desarrollar un anti-D sólo frente a dicho componente, por
lo que deben ser transfundidas con unidades D-negativas.

5.1 Fundamento
El test se basa en el test de hemaglutinación para detectar los antígenos eritrocitarios
correspondientes. Los anticuerpos de tipo IgM contenidos en los Reactivos se unen al antígeno
correspondiente sobre los eritrocitos, provocando una reacción antígeno-anticuerpo que se
traduce en una aglutinación visible de los eritrocitos.

5.2 Tipo de muestra

Muestras de sangre total recogidas con anticoagulante K2EDTA
 Se recomienda el almacenamiento refrigerado (2 °C–8 °C):
 Si las muestras se han almacenado refrigeradas, deje que alcancen la temperatura
ambiente antes de mezclarlas y analizarlas

5.3 Contenedor y aditivos

 Tubo con anticoagulante K2EDTA
 Microtubos con anticoagulante K2EDTA
(Puede utilizarse otro aditivo/anticoagulante bajo algunas circunstancias y con previa autorización)

5.4 Equipo y reactivos

 Solución salina isotónica (0.85 - 0.9% NCL)
 Tubo de ensayos para pruebas.
 Centrifuga
 Pipetas (volumen de dispensación: 40-50µl)
 Reactivo Anti-D
 Glóbulos rojos sensibilizados al 3%
 Reactivo anti globulina humana, anti-IgG o poliespecífico

5.5 Controles ambientales y de seguridad

Las condiciones del entorno requeridas para el procedimiento son:

 Temperatura: 15 °C–30 °C
 Humedad relativa: < 80% (no-condensante)

Deberá considerar todos los componentes o superficies del sistema que han entrado en contacto
con materiales de origen humano como potencialmente infecciosos; utilice siempre guantes, batas
de laboratorio y gafas de protección.

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 5.6 Procedimiento de calibración

No Aplica

5.7 Pasos del procedimiento

Test en tubo
5.7.1 Suspender al 3-5% los eritrocitos que se desean analizar en solución salina
isotónica
5.7.2 Colocar dos tubos de 10 x 75 mm en una gradilla
5.7.3 Al primer tubo debidamente rotulado adicionar una gota de reactivo
D(Rho)
5.7.4 Al segundo tubo agregar 2 gotas de control albuminoso (AT)
5.7.5 Adicionar a ambos tubos una gota de la suspensión del punto 5.7.1 y
homogenizar
5.7.6 Centrifugar 20 segundos a 800 - 1000 x g
5.7.7 Verificar la aglutinación agitando suavemente
5.7.8 En caso de resultados negativos, débiles o dudosos, incubar el tubo
durante 15 minutos a temperatura ambiente
5.7.9 Centrifugar 20 segundos a 800 -1000 x g.
5.7.10 Verificar la aglutinación agitando suavemente
5.7.11 En caso de obtener un resultado D negativo las técnicas para demostrar D
débil son requeridas por los estándares de AABB solo para donantes de
sangre o para analizar sangre de recién nacidos de mujeres Rh-negativas

5.7.2 Prueba para D Débil

Algunos glóbulos rojos expresan el antígeno D tan débilmente que la mayoría de los reactivos anti-
D no aglutina directamente las células. La Expresión Débil D puede ser reconocida de manera
confiable mediante un procedimiento indirecto de antiglobulina después incubación de los
glóbulos rojos de prueba con anti-D.

5.7.12 Si la prueba directa original con anti-D era realizada en tubo de prueba, el
mismo tubo puede usarse para la prueba D débil.
5.7.13 Mezcle e incube ambos tubos de acuerdo a las instrucciones del
fabricante del reactivo. Por lo general, esto es de 15 a 30 minutos a 37 C
5.7.14 Centrifugar 20 segundos a 3000 rpm.
5.7.15 Resuspenda suavemente los botones de la celda y examine los tubos para
ver si hay aglutinación.
5.7.16 Si los glóbulos rojos de prueba son fuertemente aglutinados en el tubo
anti-D registre la prueba muestrear como D + y no proceder con la fase de
antiglobulina de la prueba.
5.7.17 Si las células de prueba no están aglutinadas o los resultados son dudosos,
lavar las células tres veces con grandes volúmenes de solución salina.
5.7.18 Agregue el reactivo antiglobulina, de acuerdo a las instrucciones del
fabricante.
5.7.19 Mezcle suavemente y centrifugue Centrifugar 20 segundos a rpm.

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 5.7.20 Suavemente resuspenda cada botón de la celda, examinar los tubos para
determinar la aglutinación y calificar y registrar el resultado de la prueba.

5.7.3 Interpretación
5.7.3.1 Aglutinación débil en el tubo anti-D y ninguno en el tubo de control negativo
constituye un resultado positivo de la prueba. Si se realizar la prueba para D
débil, y el resultado es claramente positivo, el grupo sanguíneo debe
clasificarse como D +. Es incorrecto informar tales glóbulos rojos como "D-, D
débil" o "D-, Du".

5.7.3.2 Ausencia de aglutinación en el tubo con anti-D es un resultado negativo, lo

que indica que las celdas no expresan D y debe clasificarse como D-.
5.7.3.3 Si hay aglutinación en cualquier fase en el tubo de control, no hay una
interpretación válida de la prueba D débil puede ser hecho.

5.8 Reporte de Resultados

Los resultados se registran en F-LAB-012.R0 BITACORA DE HEMATOLOGIA.
Al final de cada corrida, se validan los resultados de los pacientes usando la G-LAB-029.R0 Guía
Rápida para validación de Resultados
5.9 Control de calidad
Para todos los análisis se deberá efectuar paralelamente un control

5.1.1 Registro
Para confirmar la reactividad o especificidad de los reactivos monoclonales cada uno debe ser
probado con células eritrocitarias antígeno RH positivas y negativas, respectivamente y ser
registrado en el xxxx Registro Control de Calidad grupo Sanguíneo; cada reactivo es satisfactorio
para su uso si reacciona solo con las células eritrocitarias antígeno positivas.

5.2 PARAMÉTROS, LINEALIDAD DE LA PRUEBA Y MAGNITUDES

No Aplica

5.3 INTERFERENCIAS

 Contaminación bacteriana o química de las muestras.

 Hemólisis.
 Preparación de la solución de eritrocitos inadecuada.
 Centrifugada la muestra inadecuada.

5.4 CARACTERISTICAS DE DESEMPEÑO

No aplica

5.5 VALORES DE REFERENCIA

No aplica

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6. BIBLIOGRAFIA

 Administración de sangre y hemoderivados. Compendio de medicina transfusional

Escuela Valenciana de Estudios de la Salud
 NORMA Oficial Mexicana NOM-253-SSA1-2012, Para la disposición de sangre humana y
sus componentes con fines terapéuticos
 PROY-NORMA Oficial Mexicana NOM-222-SSA1-2002, Que establece las especificaciones
sanitarias de los reactivos: hemoclasificadores para determinar grupos de sistema ABO,
Anti Rh para identificar el antígeno D y antiglobulina humana para la prueba de Coombs
 Technical Manual, 17th ed., Sect. 1, American Association of Blood Banks

7. CONTROL DE CAMBIOS Y MEJORAS

.
No. Revisión Punto modificado Fecha de modificación

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