EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR MINEPREP

Con las nuevas células E. coli transformadas, se llevará a cabo una extracción por miniprep de
ADN plasmídico.

- Cultivo en caldo LB

Procedimiento:

1.- Seleccionar colonias de E. coli aisladas.

2.- Con un palillo estéril, picar superficialmente las bacterias seleccionadas.

3.- Agregar 2 ml de caldo LB en tubos de 15 ml estériles y colocar el palillo en su interior.

4.- Incubar a 37°C con agitación durante 18 hrs.

- Extracción por miniprep

Procedimiento:

1.- Centrifugar el caldo a 4000 rpm por 8 minutos.

2.- Eliminar sobrenadante y el palillo.

3.- Añadir 100 ul de solución Birborn I y resuspender el pellet.

4.- Agregar 200 ul de solución Birborn II y homogenizar suavemente para no generar espuma.

5.- Adicionar 150 ul de solución Birborn III y homogenizar suavemente.

6.- Reposar en hielo por 5 minutos.

7.- Centrifugar a 4000 rpm por 15 minutos.

8.- Transferir el sobrenadante a un tubo de 1.5 ml, agregar 10 ul de RNAasa y reposar por 20
minutos a 37°C.

9.- Agregar 45 ul de acetato de sodio 3M Y 900 ul de etanol absoluto (HPLC).

10.- Reposar en hielo por 15 minutos y centrifugar a 13000 rpm por 10 minutos.

11.- Eliminar el sobrenadante y agregar 500 ul de etanol HPLC al 70%.

12.- Eliminar el sobrenadante y centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos.

13.- Eliminar el sobrenadante y secar en centrivap a 37°C por 20 minutos.

14° Resuspender con buffer TE (50 ul) y medir concentración en nanodrop.

BUSCAR COMO FUNCIONA SYPRO