Producción de Riboflavina (Vitamina B2) por Ashbya gossypii ATCC 10895.

Extracción y Purificación de la Riboflavina: La riboflavina contenida en el producto seco, fue

extraída con butanol en embudo de decantación (Sebrell, Harris 1.972), posteriormente se llevó a un
rotavapor bajo vacío a 80°C. La purificación se realizó en una columna seca de silica gel utilizando
una mezcla de solventes formada por butanol/etanol/agua en proporción 7:2:1.

El empleo de la cromatografía en columna con sílica gel, no es el método más adecuado si se desea
obtener la vitamina altamente pura. La aplicación de la riboflavina para usos terapéuticos requiere
de un grado de pureza elevado y de la eliminación de contaminantes que pudieran actuar como
agentes pirogénicos o tóxicos. Aunque se está consciente de ambas limitaciones, decidimos emplear
este método por su sencillez.

http://www.saber.ula.ve/bitstream/handle/123456789/23791/articulo42-2.pdf?
sequence=1&isAllowed=y

3.5.3. Proceso fermentativo:

 Con los valores óptimos obtenidos en volúmenes de 50 ml se estudió la producción de la vitamina
eri un fermentador LKB de 1 O litros, en el medio de producción previamente esterilizado durante
45 minutos a 121 °C. La fermentación se inició inoculando 1 O litros con el cultivo de 1000 mi. La
incubación se realizó a 30°C con aireación (0.4 v.v.m) y sin agitación para evitar que la hélice
rompiera el micelio. Cada 24 horas se tomaron muestras, se autoclavaron y se filtraron. En cada
filtrado se determinó la concentración de riboflavina que se midio por espectrofotometría a 445 nm.
Posteriormente, en base a una curva de calibracióli se obtuvo su concentración. La concentración de
azúcares se determinó por el método de Antrona.(2)
3.6.1 Extracción:
Para la extracción y purificación de la ribotlavina contenida en el . ·:licelio se empleó 1 litro de
medio de· cultivo que se esterilizó en un autoclave a J 21 oc durante 30 minutos. El aceite de maíz
contenido en el filtrado se extrajo con 200 ml de hcxano El extracto se filtró en papel de filtro
Wathman N° 2. El fiJtrado se secó en estufa a 30°C durante 24 horas. ¡La riboflavina contenida en
el producto seco fue extraída con 500 mi de butano! (J4) en un embudo de decantación de 1000 ml.
Las fases butanólicas se mezclaron y se obtuvieron 450 ml. Está fase se llevó a un rotavapor bajo
vacío a 80°C, para concentrar la vitamina y recuperar el solvente.
3.6.2. preparación de la muestra (cabeza de la columna):
Una vez concentrada la vitan1ina B2 obtenida en bruto, se mezcló con sílica gel para columnas en
proporción 1 :8 (1. 1 grs de muestra más 8 grs de silica gel). Esta mezcla se llevó a sequedad total
en un rotavapor a 80°C hasta obtenerla en forma pulverulenta.
Cromatográfica en columna:
Se preparó, con 220 grs de sílica gel, una columna seca de 5 cm de ancho por 50 cm de largo.
Después de empacar, se dispuso sobre la parte superior la mezcla seca de sílica y vitamina B2
(cabeza de la columna ). Una mezcla de solvente formado por butanol/etanol/agua en proporción de
7:2:1 se hizo pasar a través de la columna desde la parte superior. Se dejó correr la muestra hasta la
mitad de la columna, siguiendo el curso de la capa de color amarillo. Después de localizar las
bandas se cortó con un bisturí la columna de plástico. Una pequeña porción de cada banda de !, •
silica que contiene la vitamina B2 se disolvió en metano!. ¡Con cada muestra así obtenida en
metano! se realizó una cromatografia en capa fina sobre un portaobjeto para agrupar las muestras
que presentaron características iguales en cuanto a la fluorescencia amarillo-verdosa observada con
una lampara de luz ultravioleta. Detectadas las bandas que contienen vitamina B2 , ésta se extrajo
con agua en un filtro de porcelana y el filtrado se concentró hasta sequedad en un rotavapor a 80°C
bajo vacío.
http://bdigital.ula.ve/storage/pdf/33523.pdf