GENERACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES

-Desarrollo.

1.- Tomar una asada de células viables e inocular 50 ml de caldo LB. Incubar a 37°C ON (over
nigth), con agitación a 140 rpm.

2.- Medir densidad óptica del pre inóculo y diluir en 250 ml de medio YEN-B, de modo que la
OD (optical density) diluida sea de 0.1.

3.- Crecer las células a 37°C con 140 rpm de agitación. Revisar cada hora hasta obtener una OD
entre 0.5-0.9 a 600 nm.

4.- Al alcanzar la OD deseada, transferir el cultivo a hielo 15 minutos y transferir a tubos falcon
fríos.

5.- Centrifugar a 4°C a 4000 rpm por 30 minutos. Eliminar el sobrenadante.

6.- Lavar la pastilla con agua miliQ estéril, centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos a 4°C y
eliminar el sobrenadante.

7.- Repetir el lavado con 5 ml de agua estéril fría, centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos a 4°C
y eliminar el sobrenadante.

8.- Resuspender la pastilla en 2 ml de glicerol al 10% frio, concentrar 2 tubos de 50 ml.

9.- Eliminar el sobrenadante con ayuda de micropipetas, añadir 2 ml de glicerol al 10% y

centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos a 4°C (antes de eso concentrar en 1 tubo).

10.- Añadir 1 ml de glicerol al 10% frio y alícuotar 60 ul en tubos de 1.5 ml.

11.- Congelar a -80°C lo más rápido posible.