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UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA
FISIOLOGÍA Y GENÉTICA MICROBIANA

PRÁCTICA N° 1.

EXTRACCION DE ADN PROCARIOTICO

1. OBTETIVOS

1.1.Objetivo general
 Realizar la extracción de ADN de dos cepas bacterianas
1.2.Objetivos específicos
 Comparar varias técnicas de extracción de ADN procariotico
 Realizar un procedimiento modelo para la obtención de ADN en bacterias

2. INTRODUCCIÓN

Se realizará el aislamiento de ADN genómico a partir de bacterias Gram positivas y Gram

negativos. El ADN obtenido se puede utilizar para estudios de diferentes técnicas de biología
molecular como: PCR, RFLPs, RAPDs, etc. Para la extracción del ADN genómico, las
bacterias son lisadas a 80ºC en presencia de un detergente iónico. La pared de bacterias
grampositivas es debilitada previamente con lisozima. Enseguida se remueven las proteínas
contaminantes por medio de una alta concentración salina y finalmente se recupera el ADN
genómico de alta calidad a partir de 1 ml de cultivo bacteriano, con la ventaja de no utilizar
solventes orgánicos tóxicos. La lisozima se debe almacenar a -20ºC. El tampón de lisis
usualmente forma un precipitado al ser almacenado a 4ºC, se debe calentar por unos minutos
a 37ºC en baño de maría hasta que desaparezca el precipitado por completo.

3. MARCO TEÓRICO

La extracción de ADN de células es sencilla y se realiza en tres pasos

1. Se Utiliza un detergente (por ejemplo el SDS) que lisa las células y libera el contenido
celular incluyendo el ADN.
2. Este es seguido por un paso de calentamiento (aproximadamente 65-70 o C) que
desnaturalizan las proteínas, incluyendo el las ADNasas que podrían destruir el ADN
y otros componentes celulares. Temperaturas superiores a 80 oC podrían
desnaturalizar el ADN. Una proteasa también puede ser adicionada para remover las
proteínas.
3. Finalmente el ADN es precipitado en alcohol frio y se puede observar como una
mota de algodón.
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4. MATERIALES
4.1 ADN bacteriano

Isopropanol. Grado biología molecular a analítico

Etanol al 70%. Preparado a partir de etanol absoluto grado reactivo
Hielo
Micro centrifuga
Baño de calentamiento a 37ºC
Baño de calentamiento a 80ºC
Vortex
Tubos eppendorf de 1,5 ml para Micro centrifuga
Micro pipetas
Kit de extraccion de ADN procariota
Puntas para micro pipeta

4.2 ADN humano

Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA, heparina o citrato para obtención de sangre total
(5 ml por mesa)
Tubos Falcon de 15 mL y Eppendorf estériles de 1.5 mL
Micro pipetas
Puntas estériles
Vortex
Centrifuga con rotor para tubos de 15 mL y Micro centrifuga para viales de 1.5 mL
Guantes
Agua desionizada estéril
Baño de agua a 37º C
Isopropanol
Etanol 70%
Cloruro de amonio
Bicarbonato de potasio
EDTA
SDS
Acetato de amonio

4.3 Electroforesis em gel de agarosa

 Agarosa al 2%
 Agua desionizada grado I (MQ) estéril (H2O dd)
 Tampón de electroforesis:
TBE 10x se toma 10.8 g de Tris base, 5.5 g de ácido bórico y 0.5 M EDTA pH 8.0,
4 ml y completar con agua desionizada a 100 ml.
 HydraGreen
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 Tampón de carga (Buffer de carga 6X basado en glicerol= glicerol 50%, EDTA 1

mM pH 8.0, azul de bromofenol 0.25%, xylene cyanole 0.25%)
 Muestras de DNA diluidas en buffer TE (Tris-HCl 10mM EDTA 1 mM)

5. PROCEDIMIENTO
5.1 ADN bacteriano Gram Positiva
1. Transferir 1 ml de cultivo bacteriano (de aproximadamente 16 horas) a un
tubo Eppendorf.
2. Centrifugar a 12000 RPM durante 5 minutos.
3. Desechar el sobrenadante y añadir 1 ml de solución de lavado.
4. Centrifugar a 12000 RPM durante 1 minuto.
5. Desechar el sobrenadante dejando un volumen de 20 µl aproximadamente.
6. Para bacterias gramnegativas continuar con el paso No. 12. Para bacterias
grampositivas seguir con el paso No. 7.
7. Agregar 480 µl de EDTA 50 mM. Resuspenda muy bien.
8. Añadir 60 µl de lisozima (10mg/ml). Mezclar suavemente.
9. Incubar a 37ºC durante 1 hora.
10. Centrifugar a 12000 RPM durante 2 minutos.
11. Desechar el sobrenadante dejando un volumen de 20 µl aproximadamente.
12. Resuspender muy bien las células con el vortex.
13. Agregar 500 µl de solución de lisis. Mezclar suavemente por inversión.
14. Incubar a 80ºC por 5 minutos.
15. Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego añadir 3 µl de RNasa. Mezclar por
inversión 2 a 5 veces. El paso 15 y 16 se omitirá en esta práctica.
16. Incubar a 37ºC por 1 hora.
17. Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego añadir 500 µl de la solución de
precipitación de proteínas.
18. Mezclar muy bien con el vortex durante 20 segundos.
19. Incubar en hielo por 5 minutos.
20. Centrifugar a 14000 RPM durante 10 minutos.
21. Transferir 1 ml del sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo, teniendo cuidado de
no tocar el precipitado.
22. Añadir 600 µl de isopropanol. Mezclar muy bien por inversión.
23. Centrifugar a 14000 RPM por 5 minutos.
24. Desechar el sobrenadante.
25. Lavar 2 veces con 250 µl de etanol al 70%. Centrifugar cada vez a 14000
RPM por 2 minutos.
26. Desechar el sobrenadante y dejar secar al aire durante 20 minutos.
27. Resuspender el ADN en una cantidad adecuada (50-100 µl) de solución de
resuspensión (TE).
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5.2 ADN bacteriano Gram negativa

1. Transferir 1 ml de cultivo bacteriano (de aproximadamente 16 horas) a un

tubo Eppendorf.
2. Centrifugar a 12000 RPM durante 5 minutos.
3. Desechar el sobrenadante y añadir 1 ml de solución de lavado.
4. Centrifugar a 12000 RPM durante 1 minuto.
5. Desechar el sobrenadante dejando un volumen de 20 µl aproximadamente.
6. Resuspender muy bien las células con el vortex.
7. Agregar 500 µl de solución de lisis. Mezclar suavemente por inversión.
8. Incubar a 80ºC por 5 minutos.
9. Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego añadir 3 µl de RNasa. Mezclar por
inversión 2 a 5 veces. El paso 15 y 16 se omitirá en esta práctica.
10. Incubar a 37ºC por 1 hora.
11. Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego añadir 500 µl de la solución de
precipitación de proteínas.
12. Mezclar muy bien con el vortex durante 20 segundos.
13. Incubar en hielo por 5 minutos.
14. Centrifugar a 14000 RPM durante 10 minutos.
15. Transferir 1 ml del sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo, teniendo cuidado de
no tocar el precipitado.
16. Añadir 600 µl de isopropanol. Mezclar muy bien por inversión.
17. Centrifugar a 14000 RPM por 5 minutos.
18. Desechar el sobrenadante.
19. Lavar 2 veces con 250 µl de etanol al 70%. Centrifugar cada vez a 14000 RPM por
2 minutos.
20. Desechar el sobrenadante y dejar secar al aire durante 20 minutos.
21. Resuspender el ADN en una cantidad adecuada (50-100 µl) de solución de
resuspensión (TE

5.3 ADN humano

• Si se requiere utilizar volúmenes pequeños de muestra seguir el protocolo descrito

en el anexo Master pure DNA purificación Kit for Blood. Si no es ese el caso realizar el
siguiente protocolo:
1. En un tubo de 15 mL, medir 4 mL de Buffer de lisis de glóbulos rojos y sobre este
adicionar con una pipeta de Pasteur 1 mL de sangre total. Con la misma pipeta mezclar muy
bien y con mucha suavidad hasta lograr una completa homogenización.
2. Por inversión agitar muy suavemente durante 7 minutos a temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 3000 R.P.M. durante 8 minutos.
4. Descartar el sobrenadante y conservar el pellet.
5. Mezclar con una pipeta Pasteur muy suavemente el pellet en el líquido residual.
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6. Adicionar 2.5 ml de Buffer de lisis celular y mezclar varias veces, hasta homogenizar.
Dejar al menos 20 minutos a temperatura ambiente. (En este paso se puede suspender el
procedimiento, dejando los tubos a 4ºC).
7. Adicionar 800 µl de solución precipitante de proteínas. Mezclar fuerte, hasta observar
grumos de las proteínas precipitadas.
8. Centrifugar a 4000 R.P.M. durante 10 minutos.
9. Verter todo el sobrenadante sobre un tubo de 15 mL que contenga 2,4 mL de
isopropanol frío (alcohol isopropílico), dejar en reposo al menos unos 5 minutos.
10. Mezclar cuidadosamente por inversión hasta precipitar el ADN.
11. Envolver el ADN en una pipeta y pasarlo rápidamente por etanol al 70% frío, dejar
secar a temperatura ambiente y resuspender finalmente en buffer TE (Tris-HCL 10 mM
EDTA 1mM) de 50-500 µl, dependiendo de la cantidad de ADN recuperado. Nota: El ADN
se puede recuperar tomándolo con pipeta Pasteur y centrifugando a 10.000 rpm por 5 min y
lavar con 200 µl etanol al 70%.

Preparación del gel

• Preparar la agarosa al 2% en TBE 1X en un Erlenmeyer que sea de tamaño 2 veces mayor

que la cantidad de agarosa a preparar (50 ml). Deje que la agarosa se hidrate y marque el nivel
del líquido en el recipiente. Caliente la mezcla hasta que aparezcan burbujas, agite suavemente
para resuspender la agarosa aun no disuelta; caliente de nuevo, hasta que se disuelva
completamente y reponga el volumen perdido.

• Permita el enfriamiento de la agarosa a una temperatura aproximada de 50-60oC, adicione

3ul de syber Green (1 ul por cada 10 ml de agarosa).

• Vierta la solución de agarosa en el molde previamente preparado, coloque el peine apropiado

para formar los pozos donde será colocada la muestra y deje solidificar. Para una resolución
óptima los geles deben tener un grosor entre 5 y 6 mm; los geles demasiado gruesos hacen que
las bandas de ADN se visualicen tenues y difusas.

• Una vez solidificada la agarosa (aprox. 30 min.), retire cuidadosamente el peine, introduzca
el gel en el aparato de electroforesis y adicione suficiente tampón TBE 0.5% a los compartimentos
de la cámara de electroforesis para sumergir el gel entre 3 a 5 mm. Si se adiciona menos tampón,
el gel puede secarse durante la corrida electroforética, y si se adiciona mucho tampón, se
disminuye la movilidad del ADN, se promueve la distorsión de las bandas y produce
calentamiento excesivo del sistema.

6.2 Corrido electroforético

• Prepare las muestras de ADN así: 8 µl de ADN más 2 µl de tampón de carga 2X. De igual
manera proceda con el patrón de peso molecular, si este está a una concentración de 100 ng/µL:
3 µl de patrón más 2 µl de tampón de carga 2X y 5ul de agua de.

• Haga un esquema del gel, localizando cada una de las muestras. La cantidad de ADN que
puede ser cargada en un gel depende de varios factores: volumen del pozo; tamaño de los
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fragmentos que se quieren visualizar (la capacidad del gel disminuye a medida que aumenta el
tamaño de los fragmentos); distribución del tamaño de los fragmentos, y gradiente del voltaje
(voltajes altos son apropiados para fragmentos <1 Kb, mientras que voltajes bajos son mejores
para fragmentos >1 Kb). La menor cantidad de ADN que puede ser visualizada confiablemente
en un gel coloreado; sin embargo, la cantidad de ADN que produce bandas claras y nítidas, es
alrededor de 100 ng.

• Conecte la cámara de electroforesis a una fuente de poder y realice el corrido a un gradiente

de voltaje de 5-10 V/cm. (La distancia que debe considerarse para determinar el gradiente de
voltaje es la distancia entre los electrodos y no la longitud del gel).

Recomendaciones:

 Si el voltaje es demasiado alto, la banda de ADN se puede convertir en una línea delgada,
especialmente para fragmentos > 12-15 Kb; en este caso, se recomienda una
electroforesis con un gradiente de voltaje de 1-2V/cm.
 Cuando el voltaje es demasiado bajo se reduce la movilidad de los fragmentos pequeños
de ADN (< que 1kb), lo que hace que las bandas se difundan y pierdan nitidez.
 No olvide que la electroforesis es en sentido negativo a positivo, por lo que el origen de
siembra del gel debe estar cerca al electrodo negativo
 La electroforesis debe hacerse hasta que la banda de interés haya migrado un 40-60% de
la mitad de la longitud del gel. Las bandas del ADN pierden resolución en el tercio
inferior del gel debido a que se difunden y dispersan.

Visualización de las bandas de ADN

• El ADN teñido con syber Green es detectado con radiación ultravioleta; a una longitud de
onda de 245 nm la luz UV es absorbida directamente por el ADN y transmitida al colorante; a
302 y 306 nm la luz UV es absorbida directamente por el colorante. En ambos casos la energía
es re-emitida a una longitud de onda de 590nm, en la región rojo naranja del espectro visible.
• Para visualizar las bandas de ADN separadas en el gel, páselo directamente al
transiluminador con luz UV.

¡CUIDADO! LA LUZ UV PRODUCE QUEMADURAS EN LA RETINA Y EN LA PIEL. Evite

la exposición directa de los ojos y la piel a la luz UV, ya que se puede producir una quemadura
de primer grado. (Se ha asociado con cáncer de piel)

• Los resultados se pueden registrar, tomando una fotografía al gel, con una cámara instantánea,
o mediante un sistema computarizado de análisis de imágenes. Calcule el peso molecular
mediante el cálculo de una regresión de log 10 de un marcador conocido versus la distancia de
migración de cada uno de los fragmentos o mediante comparación con cada una de las bandas
del patrón

6. RESULTADOS
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7. REFERENCIAS

1. Revista Nature Protocols años 2009- 2018

2. Catálogos y fichas técnicas 2018 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega,
Quiagen, Corpogen, Bioline, etc.
3. David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology.
Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986
4. Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons,
1988
5. Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2 nd edition, Col
Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
6. Catálogos de los Kit de Promega, Corpogen, Dnazol y Probes

Anexo

PREPARACION DE REACTIVOS

Se utilizaran kit comerciales según disponibilidad en el laboratorio Central para extracción

de ADN a partir de sangre periférica y a partir de cultivo celular. También se puede utilizar
el protocolo Salting out preparando los siguientes reactivos:
 Buffer de lisis de glóbulos rojos (100 mL):
0.83 g de Cloruro de Amonio
0.1 g de Bicarbonato de Potasio
0.2 mL de EDTA 0.5 M pH 8.0
80 mL de agua destilada estéril
Mezclar en un Erlenmeyer con magneto hasta homogenización completa.
Completar a 100 ml con agua destilada estéril.
Autoclavar.
Almacenar a 4ºC.
 Buffer de lisis celular (100 ml):
5 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0
20 ml de SDS 10%
60 ml de agua destilada estéril
Mezclar cuidadosamente (evitando la formación de espuma) en un erlenmeyer hasta
homogenización completa.
Completar a 100 ml en una probeta con agua destilada estéril.
No Autoclavar.
Almacenar a temperatura ambiente
 Solución precipitante de proteínas (50 ml):
38,54 g de Acetato de Amonio
10 ml de agua destilada estéril
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Mezclar en un Erlenmeyer usando magneto hasta completa homogenización. Puede

requerir calentamiento ligero.
Completar a 50 ml con agua destilada estéril.
Autoclavar
Almacenar a 4ºC.
 Solución de rehidratación 10 ml
TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM)
Preparar TRIS 1 M pH 8.0 100ml
PM 121.1g
EDTA 0.5 M pH 8.0 100ml
Y a partir de estos hacer la mezcla TE y dilución correspondientes
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INFORME LABORATORIO

Nombre: __________________________ Grupo _____________

____________________________
____________________________

Con su grupo de trabajo responda los siguientes interrogantes

1. Elabore un esquema detallado del protocolo que le correspondió realizar para la

extracción de ADN
2. Por qué es mejor realizar la extracción con isopropanol frio
3. Que precauciones se deben tener para evitar la degradación del ADN en muestras
biológicas?
4. En la extracción de ADN se emplea un buffer de lisis que contiene principalmente
EDTA y SDS. ¿Cuál es la función de estos dos reactivos dentro de este contexto?
5. En la remoción de proteínas se utilizan enzimas, mencione cuáles y cómo actúan.
6. En que consiste el reactivo Tris y para que se usa?