Protocolo de Extracción de DNA plasmídico

1. Inocular 5 ml de medio LB con bacterias transformadas (Cepas de E. Coli. Con los códigos
191 y 214). A 37 °C por 16 hrs aprox.

2. Colocar 3 ml del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 ml; primero colocar 1.5 ml de
cultivo y se centrifugar por 2 min a 10000 rpm, decantar el sobrenadante y volver a colocar
1.5 ml de cultivo en el mismo tubo de polipropileno para posteriormente repetir las
condiciones de centrifugación y decantar sobrenadante.

3. Resuspender la pastilla en 250 μL de solución Alcalina I fría (Estabilización), mezclar

mediante pipeteo constante evitando los grumos. Incubar por 5 min a temperatura
ambiente.

4. Agregar 250 μL de la solución 2 (lisis y desestabilización del ADN) e invertir el tubo 5 veces,
incubar por 5 min a temperatura ambiente.

5. Agregar 250 ul de la solución 3 e invertir el tubo 5 veces, incubar en hielo durante 5 minutos.

6. Centrifugar a 12,000 RPM a 4°C por 30 min.

7. Recuperar el sobrenadante (aproximadamente 500-700 ul) y transferir a un tubo
previamente puesto a enfriar en hielo.
8. Agregar 750 ul de isopropanol e incubar 10 min a a -20°C.
9. Centrifugar a Max. Rev. de 15-20 min a 4°C.
10. Decantar y agregar 250 ul de Etanol al 70%.
11. Centrifugar a Max. Rev. por 10 minutos a 4°C.
12. Decantar el sobrenadante e inmediatamente invertir el tubo para secar la pastilla.
13. Resuspender en 50 de H2O desionizada estéril, guardar a -20 °C .

NOTA IMPORTANTE: ORGANIZARSE ENTRE USTEDES PARA TRAER DOS BOLSAS DE HIELO PARA
USO DE TODO EL GRUPO.