CULTIVOS DE LINFOCITOS

POKER FACE ERICC KARTMAN

Cultivo Celular
Tomar en condiciones de esterilidad mediante puncin venosa perifrica 2ml de sangre en un tubo vacutainer con heparina. Mezclar suavemente la heparina con la sangre para evitar la coagulacin.

Cultivo Celular
Sembrar colocando en el frasco de Roux 4 ml de medio de cultivo McCoy 5A y 1ml de sangre.

Cultivo Celular
Aadir 0.2ml de fitohemaglutinina M utilizando una jeringa del no. 20 (4 gotas) Agregar 0.1 ml de la solucin de antibiticos. Incubar 72hrs a 37C Agregar 0.2ml de solucin de colchicina

Cultivo Celular
Incubar de 1-2hrs a 37C Verter el contenido de los frascos de cultivo en tubos para centrfuga de 15ml y centrifugar a 1000rpm durante 10 min. Descartar con cuidado el sobrenadante Desintegrar el botn suavemente y resuspender las clulas en 4ml de solucin hipotnica de KCl 0.075M

Cultivo Celular
Incubar a 37C durante 20-30min Descartar cuidadosamente el sobrenadante Agregar solucin fijadora de Carnoy hasta completar 4ml y resuspender hasta homogenizar Dejar en temperatura ambiente 5min. Centrifugar a 1000rpm durante 10 min. Descartar cuidadosamente el sobrenadante Repetir 2 veces el proceso de fijacin Dejar en solucin fijadora y refrigeracin por 24hrs Centrifugar a 1000rpm durante 10 min. Eliminar el sobrenadante Agregar solucin fijadora de acuerdo con el botn obtenido Hacer las preparaciones sobre portaobjetos previamente sumergidos en etanol al 70%, dejando caer 2 gotas de la suspensin celular desde una altura suficiente para lograr una dispersin adecuada de los cromosomas. Dejar secar al are. Colorear con Giemsa y realizar tcnicas de bandas cromosmicas. Observacin al microscopio.