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ÍNDICE

Introducción

4

Capítulo I Problemática Caracterización

6

Problema

7

Objetivos

8

Capítulo II Marco Teórico Los actinomicetos

9

Pectinas

11

Análisis físico-químico de la cáscara de naranja

13

Investigaciones referentes a la producción de pectinasas

14

Biorreactores

18

Enzimas pectinasas comerciales

19

Situación del mercado internacional de las enzimas

20

Capítulo III Materiales y métodos Materiales

22

Métodos

26

Capítulo IV Resultados

35

Conclusiones

43

Bibliografía

44

Agradecimiento:

A

toda mi familia por su

incondicional apoyo y

porque me enseñaron

que gracias al trabajo con

amor y voluntad se puede llegar al éxito.

INTRODUCCIÓN

Las enzimas pectinasas son un conjunto de enzimas que hidrolizan la pectina.

Éstas

presentan

una

extensa

aplicación

en

la

industria

alimentaria,

principalmente en la obtención y clarificación de jugos, vinos y cervezas

(Fogarty y Ward, 1974; Neubeck, 1975).

Las enzimas pectinasas extracelulares que hidrolizan la pectina pueden ser

producidas por diferentes microorganismos como hongos y bacterias; en esta

investigación trabajamos con una bacteria que en pruebas preliminares produjo

enzimas pectinolíticas.

Siendo el Perú un país rico en productos agrícolas conviene desarrollar un

bioproceso orientado al aprovechamiento integral de recursos provenientes de

3

la producción agrícola y agroindustrial, además de evitar la contaminación

ambiental, por los residuos provenientes de estas actividades. Uno de estos

residuos por aprovechar es la cáscara de naranja que, por su volumen, resulta

atractivo para la producción industrial de enzimas pectinasas, por lo que, en el

presente trabajo de investigación, se desarrollo un bioproceso a nivel de

laboratorio, para la producción de pectinasas por Actinomyces naeslundii.

4

CARACTERIZACIÓN:

Hoy en día vivimos

CAPÍTULO I

PROBLEMÁTICA

en una sociedad de consumo, término utilizado en la

economía y sociología, para designar al tipo de sociedad que se corresponde

con una etapa avanzada de desarrollo industrial capitalista y que se caracteriza

por

el

consumo

masivo

de

bienes

y servicios,

producción masiva de los mismos.

disponibles

gracias

a

la

Los agentes quimicos biológicos no pueden estar ajeno a estas circunstancias,

tal es asi que las enzimas que son generalmente usadas en la industria de

5

procesamiento de jugos, frutas y vinos; estan diseñadas para hidrolizar alguna

parte de la molécula de la pectina. Para nadie es un secreto encontrar y

comprar enzimas en nestra sociedad.

El Perú un país rico en productos agrícolas; por lo tanto conviene desarrollar un

bioproceso orientado al aprovechamiento integral de recursos provenientes de

la producción agrícola y agroindustrial, Uno de estos residuos por aprovechar

es la cáscara de naranja que, por su volumen, resulta atractivo para la

producción industrial. Razón por la cual nos vemos motivados a realizar un

proyecto

de

PECTINASAS

innovación

denominado

POR

ACTINOMYCETOS

PRODUCCIÓN

EN

CULTIVO

DE

ENZIMAS

SUMERGIDO

UTILIZANDO PECTINA Y CÁSCARA DE NARANJA”.

PROBLEMA:

Problema general:

¿Cómo producir enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido

utilizando pectina y cáscara de naranja?.

Problema específico:

¿Cómo evaluar los niveles de producción de pectinasas con los parámetros

establecidos, utilizando un medio natural a base de cáscara de naranja?.

6

OBJETIVOS:

Objetivo general:

Evaluar los parámetros pH, temperatura, concentración de nutrientes, aireación

y agitación para la producción de enzimas pectinasas en un medio sintético de

laboratorio.

Objetivo específico:

Evaluar

los

niveles

de

producción

de

pectinasas

con

los

parámetros

establecidos, utilizando un medio natural a base de cáscara de naranja.

7

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1 LOS ACTINOMYCETOS:

Los

actinomycetos

han

despertado

un

gran

interés

para

biotecnólogos,

genetistas

y

ecologistas,

por

su

habilidad

para

producir

metabolitos

secundarios. Muchos actinomycetos pueden crecer en los medios comunes

usados en los laboratorios tales como agar nutricio, agar tripticasa soya, agar

sangre y también en agar infusión cerebro corazón.

Los actinomycetos crecerán en caldos, pero necesitan ser cultivadas bajo

condiciones especiales. El crecimiento en un tubo con caldo sin movimiento se

8

da en la superficie, dejando el resto del caldo intacto. Los cultivos líquidos

requieren considerable agitación y aireación. La agitación puede estar entre

200 250 rpm. para dar la adecuada aireación y homogenización del medio. De

necesitar mayor mezclado, se puede colocar baffles en la parte interior del

recipiente. Conforme avanza el tiempo de cultivo, el microorganismo crecerá en

forma de pellet (Cross, 1980).

Los actinomycetos son un grupo de bacterias filamentosas, GRAM (+), las

células

que

se

van

a

formar

son

denominadas

conidias,

además

las

encontramos participando en la degradación de desechos orgánicos en los

suelos como el compostaje.

Vistos

al

microscopio

tiene

la

forma

de

un

hongo

pequeño

de

tamaño

bacteriano; la pared celular está constituida por una serie de ácidos murámicos

y diaminopiméricos, careciendo de pectidoglucanos, característica que ayuda a

reconocer a las bacterias. La composición de la membrana ayudó a excluir a los

actinomycetos

de

la

denominación

hongo,

por

encontrar

esteroles

en

la

membrana. En cuanto al citoplasma, se ha clasificado como microorganismo

procariote debido a que no posee un núcleo y que su cromatina se encuentra

libre en el citoplasma. Su información genética posee una inestabilidad muy

alta. Los actinomycetos generan metabolitos secundarios al final de la fase

logarítmica. En la naturaleza son los mayores productores de antibióticos,

seguidos por los hongos. Tienen la capacidad de degradar pesticidas

9

y

derivados

de

petróleo.

Se

han

encontrado

actinomycetos

termófilos

que

interviene en el proceso de compostaje, produciendo una serie de enzimas

como las celulasas y amilasas. Los actinomycetos son considerados como los

médicos del suelo.

En los actinomycetos podemos ver actualmente el gran potencial que tienen en

el campo agrícola, biomédico, en la salud y en la biorremediación (Franco,

2001).

2.2. PECTINAS:

Las

pectinas

o

sustancias

pécticas

son

polisacáridos

que

se

componen

principalmente de ácidos poligalacturónicos coloides (poliuró nidos derivados

del ácido galacturónico CHO(CHOH) 4 COOH. Se hallan en los tejidos de las

plantas. Las pectinas son útiles por su capacidad para formar geles o jaleas con

compuestos polihidroxilados, como los azúcares o con cantidades diminutas de

iones polivalentes. En el presente estudio. El vocablo “jalea” se usará para

designar al muy conocido producto semisólido formado por pectina, azúcar y

ácido en condiciones determinadas.

La sustancia que se había supuesto era la causa de que los jugos de fruta se

convirtieran en jalea, fue aislada por Braconnot en 1824, quien la denominó

pectina. Las extensas investigaciones realizadas en los cien años siguientes

esclarecieron las propiedades de las sustancias pécticas, pero poco hicieron

10

para aclarar su naturaleza química. Entre 1920 y 1940 quedó establecida la

producción de pectinas en escala comercial en cierto número de naciones y

aquéllas llegaron a formar parte importante en el comercio internacional (Kirk,

1961).

ESTRUCTURA DE LA MOLECULA DE PECTINA (CAMPOS D. 2001)

parte importante en el comercio internacional (Kirk, 1961). ESTRUCTURA DE LA MOLECULA DE PECTINA (CAMPOS D.

11

2.3. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO DE LA CÁSCARA DE NARANJA

CUADRO - 1

COMPOSICIÓN FÍSICO -QUÍMICA DE LA CÁSCARADE NARANJA

(Demain A. Y Solomon N., 1986)

 

Materia seca

90.00

Protein

6.00

Componentes principales

Carbohidratos

62.70

(%)

Grasas

3.40

Fibra

13.00

Cenizas

6.90

 

Calico

2.00

Minerales

Magnesio

0.16

(%)

Fósforo

0.10

Potasio

0.62

Azufre

0.06

 

Colina

770.00

Vitaminas

Niacina

22.00

(mg/Kg)

ac. Pantoténico

14.96

Riboflavin

22.20

 

Arginina

0.28

Aminoácidos

Cistina

0.11

(%)

Lisina

0.20

Metionina

0.11

Triptofano

0.06

12

2.4.

INVESTIGACIONES

PECTINASAS:

REFERENTES

A

LA

PRODUCCIÓN

DE

En la Fermentación en Sustrato Sólido (FSS), la concentración del sustrato es

mayor que en la Fermentación en Cultivo Sumergido (FCS), debido a que

contiene entre 1 a 10% de agua.(Laukevics, 1988).

En otra investigación, (Solís-Pereira & col., 1996), demostraron que en una

concentración de 5 g/L de glucosa en una FCS la producción de pectinasas por

Aspergillus niger fue reprimida, igualmente com o la producción de otras

enzimas

hidrolíticas,

tales

como

poligalacturonasas,

pectinesterasas

y

celulasas; pero en una FSS con concentración de glucosa de 5 g/L la síntesis

de pectinasas no es afectada.

En la FCS el medio es completamente simple, consistiendo en un producto de

la agricultura no refinado, el cual contiene todos los nutrientes necesarios para

el crecimiento microbiano. Los sustratos más empleados en FSS son productos

agrícolas (soya, arroz, trigo, maíz, etc), o subproductos agro industriales

(salvado de trigo, bagazo de caña, residuos de remolacha, bagazo de cítricos,

bagazo

de

manzana,

cáscaras

de

diversos

vegetales,

etc.).

Éstos,

generalmente, empleados en combinación y/o, complementados con fuentes de

carbono y energía fácilmente metabolizables (almidón, maltodextrinas, melazas,

etc.) y otros nutrientes (úrea, calcio, fosfatos, etc) (Agosin, 1995).

13

Estos sustratos son colocados en agua, aunque pueden requerir de algún

pretratamiento. El pretratamiento de estos sustratos (térmico principalmente)

tiene

un

doble

propósito;

esterilización

del

sustrato

y

cambios

en

las

propiedades fisicoquímicas del sustrato (gelatinización del almidón, aumento de

la

porosidad,

etc.),

que

influye

favorablemente

en

la

degradabilidad

y

accesibilidad de los componentes poliméricos (polisacáridos y proteínas) y

estructurales del sustrato (Milstein y Flowers, 1986).

Una

producción

de

pectinasa

usando

cáscara

de

limón

con

diferentes

pretratamientos,

fue

realizada

determinándose

pectin

esterasa

y

poligalacturonasa. Los resultados menos favorables fueron obtenidos usando

cáscara de limón seca; usando cáscara de limón lavada y no lavada los

resultados fueron similares para la poligalacturonasa, en tanto que el nivel de

pectin esterasa fue particularmente alto con cáscara de limón no lavada. Los

bajos niveles de actividad fueron obtenidos cuando las cáscaras se secaron a

una temperatura final de 120 º C, lo cual indica claramente la importancia de

este tratamiento con las cáscaras, cuando es usado para la producción de

pectinasas (Maldonado, 1986).

Por otro lado,

se ha probado sulfato de amonio para suplir la fuente de

nitrógeno, debido al menor costo que el fosfato de amonio. El ensayo dio lugar

a una reducción del 20% de actividad pectinasa (Saval y Huitron, 1983).

El pH óptimo de la enzima poligalacturonasa fue probada usando buffer acetato

14

para pH 2.5 - 4.5 obteniéndose una actividad pectinolítica máxima a un pH de

3.5 (El Sayed, 1994).

Las bacterias anaeróbicas productoras de pectinasas presentan un

buen

crecimiento a pH 7.0 y una temperatura de 45 ºC. La máxima actividad

poligalacturonasa fue de 4.7 U.I./mL hallada en un caldo de fermentación

(Shivakuman, 1995).

En otra investigación (Abdel - Fattah y Ismail, 1996) trabajaron sobre el efecto

de las reacciones al variar valores de pH y Temperatura de las preparaciones

enzimáticas, hallando valores óptimos de 4.5 y 50 º C, respectivamente.

La producción de pectinasa extracelular es inducida por sustancias pécticas o

por desechos agroindustriales tales como pulpa de limón o naranja, los cuales

tienen apreciables cantidades de pectina ,(Aguilar y Huitron, 1986).

Pectina y glucosa fueron usadas como comparación de fuente de carbono, los

resultados obtenidos con glucosa fueron pobres, considerando la naturaleza

inducible de las enzimas pectinolíticas (Kilara, 1982).

(Sincere, 1989), seleccionaron tres cepas productoras de

enzimas

pécticas (Talaromyces flavus, Penicillium charlessi

y Tubercularia vulgaris),

utilizando pellets de pulpa de cítricos se obtuvieron actividades pectinolíticas

más altas que las producidas por Aspergillus níger.

En otro estudio de producción de pectinasas bacterianas, utilizando pulpa de

café como sustrato, se encontró 0.76 U (unidades de actividad enzimática) para

15

pulpa de café húmedo (Cabello y col.,1982).

La presencia de pectina en la composición del medio de cultivo es un factor

importante, ya que influye sobre la diversidad y cantidad de enzimas pécticas,

sabiendo además que la producción de enzimas pectinasas es inducible y no

constitutivo (Trejo y col., 1991).

Moreno y col.,(1995) reportan un estudio de producción de pectinasa a partir de

fermentación

en

sustrato

sólido

utilizando

cáscara

de

yuca

y limón

con

Aspergillus niger ATCC 10864 obteniéndose una productividad volumétrica de

434.4 U.I./(L*h), mayor que otros autores, 39 U.I./(L*h) ( Abdel-Fattah y col.,

1977).

Con respecto a las desventajas que pueden haber en una FSS tenemos que es

un proceso más lento que una FCS, debido a la gruesa barrera de sólido;

también presenta problemas de disipación de calor limitado por la transferencia

de masa intrapartícula (Trejo y col.,1991).

2.5. BIORREACTORES:

El cultivo de bacterias, levaduras y hongos en un cultivo sumergido es una

práctica universal en la industria de fermentaciones, desde la década de los

40’s. La aplicación de energía a los sistemas de fermentación hace que los

procesos de transporte convectivos sean órdenes de magnitud más rápidos que

los procesos difusionales que controlan el transporte en el cultivo sólido. Esto

16

ha permitido el desarrollo de procesos de alta productividad que han hecho del

cultivo sumergido la técnica de más uso en la industria de las fermentaciones.

Aunque la agitación mecánica sigue siendo la forma más usada de aplicar

energía.

Independientemente del tipo de cultivo, existen tres consideraciones, además

de la homogenización y la transferencia de oxígeno, que son de importancia en

el diseño de biorreactores: La primera tiene que ver con la esterilidad. Llevar a

cabo un proceso en ausencia de contaminación es un requisito fundamental. El

diseño de tomas de muestras y sellos mecánicos, el acabado de la superficie

del tanque, así como de la conexión de válvulas y aditamentos, juega un rol

importante en un diseño exitoso. Un segundo aspecto de importancia es la

remoción de calor. En vista de que las temperaturas de fermentación son

moderadas (25 a 40 ºC) y que el cultivo de células es un proceso exotérmico, el

control de la temperatura en un biorreactor requiere de la remoción de

cantidades importantes de calor. Un tercer punto de fundamental importancia

son los aspectos mecánicos, la selección de reductores de velocidad y el diseño

de la flecha de agitación (Miranda y col., 1996).

17

2.6. ENZIMAS PECTINASAS COMERCIALES:

La moderna tecnología de los zumos de frutas exige una degradación rápida e

intensa de la pectina, con el fin de que el prensado, la clarificación y la filtración

puedan realizarse de una manera segura y económica.

PECTINEX es una preparación

purificada,

producida

por

una

cepa

de

Aspergillus níger. El producto contiene principalmente pectin-transeliminasa,

poligalacturonasa, pectinesterasa y hemicelulasas, siendo capaz de romper

sustancias pécticas vegetales.

PECTINEX

y

ULTRAZYM

son

productos

que

han

sido

obtenidos

como

resultado de una investigación y un desarrollo de varios años. Por su amplio

espectro de acción, satisfacen de manera ideal las diversas exigencias que se

imponen a su sistema óptimo de enzima en cada una de las etapas individuales

de producción. Por lo tanto, PECTINEX y ULTRAZYM

permiten asegurar

buenos resultados en todo el mundo, bajo las más diversas condiciones

tecnológicas.

Ventajas:

La utilización de PECTINEX y de ULTRAZYM garantizan:

Durante la acción de la enzima sobre la pulpa:

La mejora en la extracción del zumo, aumentando con ello el rendimiento

global del zumo.

18

La reducción de los tiempos de prensado, con incremento subsiguiente

de la producción.

La liberación de componentes fundamentales como color, aroma, etc.,

por descomposición específica de la pulpa.

Durante el tratamiento enzimático de los zumos:

El desdoblamiento rápido y completo de la pectina.

La floculación rápida y la

sedimentación

compacta

de

las

sustancias

enturbiadoras, con un mínimo de clarificantes.

La filtración óptima, con menor gasto de material filtrante.

La estabilidad segura de los zumos completamente

claros,

de

sus

concentrados y de sus diluidos. (Andersen, 1991).

2.7. SITUACIÓN DEL MERCADO INTERNACIONAL DE LAS ENZIMAS:

En el cuadro siguiente, se muestra la situación del mercado internacional, de

acuerdo con los datos publicados por (Eveleigh y col.,1990). Es impactante, por

un lado, el hecho de que más de 2000 enzimas registradas sólo 60 sean

producidas comercialmente y de éstas sólo cinco cubran más del 80% del

mercado (García y col., 1993).

Es innegable que la expansión del mercado de enzimas observado en los

últimos años en los países de latinoamericana, es un aliciente para la creación

19

de nuevas empresas nacionales o mixtas que produzcan enzimas a nivel

nacional o subregional (Illanes, 1994).

CUADRO - 2

PRODUCCIÓN MUNDIAL DE ENZIMAS (García y col.,1993)

Enzima

Tonelas / Año

% del Total

Proteasa fungal

13

0.95

Pectinasa

25

1.83

Amilasa fungal

25

1.83

Cuajo microbiano

25

1.83

Glucosa isomerasa

75

5.5

Amilasa bacteriana

325

23.85

Amiloglucosidasa

350

25.70

Proteasa bacteriana

525

38.51

TOTAL

1363

100.00

20

CAPÍTULO III

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1.

MATERIALES:

3.1.1.

Material Biológico:

En el presente trabajo, se utilizó el microorganismo Actinomyces naeslundii, el

cual fue aislado en el laboratorio de Farmacia del I.E.S.T.P. “Santa Lucía”, a

partir de una muestra de suelos naranjales del valle de Chanchamayo.

3.1.2. Medios de Cultivo:

a). Medios de cultivo complejos:

21

- Cultivo en sólido: Constituido por Agar Trypticasa Soya y Agar Trypticasa

Soya, suplementado con 1% de pectina cítrica.

- Cultivo en líquido: Constituido por Caldo Trypticasa Soya y Caldo Trypticasa.

Soya suplementado con 1% de pectina cítrica.

b). Medio de cultivo experimental:

Constituido por sales minerales y cáscara de naranja como única fuente de

carbono, variando sus concentraciones de acuerdo al siguiente cuadro:

COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL

 

NUTRIENTES

CONCENTRACIÓN MÍNIMA (g/L)

CONCENTRACIÓN MÁXIMA (g/L)

X

1

Cáscara de

2.000

16.700

 

naranja

X

2

(NH 4 ) 2 SO 4

1.000

5.000

X

3

Úrea

0.700

5.000

X

4

FeSO 4 .7H 2 O

0.013

0.080

X

5

CaC1 2

0.020

0.083

X

6

NaC1

1.000

5.000

X

7

MgSO 4 .7H 2 O

0.200

1.00

X

8

NaCO 3

0.800

4.000

22

3.1.3. Accesorios:

Mechero

Asa de Kolle Termómetro Cronómetro

Erlenmeyers de 250 mL

Beakers de 150, 250, 500, 1000 mL Pipetas de 1, 2, 5, 10, 25 mL Probetas

de 100, 250, 500, 1000 mL Baguetas

Tubos de ensayo de 15 * 150 mm.

Placas petri Embudos de vidrio Kitasato

Tips de 50, 1000, 5000 µL. Parafilm

Algodón

Pinzas Gradillas

Filtro gelman 0.2 µM

Bomba de aire de 500 mL / min (URANUS)

Reactivos:

Medio Agar Trypticasa Soya (TSA) Medio Caldo Trypticasa Soya (TSB) Úrea

Sulfato de magnesio Cloruro de calcio

Solución amortiguadora (buffer) de fosfato 0.05 M, pH 7

Ácido sulfúrico q.p. Hidróxido de sodio Alcohol etílico de 96 º Agar-agar

Solución amortiguadora (buffer) de acetato 0.05 M, pH 4.8

Solución de pectina al 1%

23

Reactivo de Ácido 3,5- dinitrosalicilico (DNS) (Miller, 1959) Estándar de

Ácido D-galacturónico para análisis (SIGMA)1 mg /mL Sulfato de amonio

Tartrato de sodio y potasio

Estándar de Albúmina sérica de bovino 10 mg / mL Pectina (sigma)

Pectina cítrica de grado alimentario Cáscaras de naranja

Sulfato ferroso Cloruro de sodio Rojo de rutenio

3.1.4. Equipos:

Autoclave Biorreactor de 1 litro

Espectrofotómetro de rango visible SPECTRONIC 20

Estufa con temperatura controlada a 37 º C MEMMERT S 30

Baño maría con temperatura controlada a 37 ºC INSTRUMENTAL. Horno a

180 º C

Centrífuga

Agitador a 200 r.p.m. Cocinilla Refrigeradora Balanza analítica Balanza de

platillos Bomba de vacío Vortex

Equipo de destilación

Micro pipetas de 50, 1000, 5000 µL

24

3.2. MÉTODOS:

3.2.1. Acondicionamiento del microorganismo (Cabello y col.,1982).

El

microorganismo

que

utilizamos

en

esta

investigación

fue

sembrado

periódicamente, tanto en un medio sólido como en el líquido, de la siguiente

manera:

-Se sembró una colonia de Actinomyces naeslundii en un tubo con Caldo

Trypticasa Soya, suplementado con 1% pectina cítrica, y luego se incubó

durante 5 días a 37 º C.

-A continuación, se realizó una siembra del medio líquido en Agar Trypticasa

Soya, suplementado con 1% pectina cítrica, y se realizó la incubación durante 3

días a 37 º C.

-Posteriormente, se repitieron los pasos anteriores por 60 días.

3.2.2.

Evaluación

preliminar

de

los

parámetros

pH,

temperatura

y

aireación-agitación

en

un

medio

sintético,

para

la

producción

de

pectinasas:

a) DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO ( Becker y col.,1999).

En

primer

lugar,

el

microorganismo

fue

Inoculado

en

caldos

de

TSB,

amortiguados a tres pH (5, 7 y 8.5); a continuación, se incubó en estufa a 37ºC

por 72 horas; y, finalmente, se midió la masa celular por espectrofotometría a

600 nm.

25

b) DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA (Becker y col.,1999).

En el presente caso, se siguió el siguiente procedimiento:

-Inoculación del microorganismo en caldos de TSB

-Incubación de los tubos los tubos a temperaturas de 28ºC, 37ºC y 45 ºC

durante 72 horas

-Medición de la masa celular, por espectrofotometría a 600 nm.

c) DETERMINACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN (Becker y col., 1999).

La aireación-agitación se evaluó a las 72 horas de incubación, a 37 ºC,

comparando el aumento de la masa microbiana por espectrofotometría, a 600

nm de los tubos con caldo control de TSB, en dos condiciones experimentales:

-Tubos con sello de parafina estéril y sin agitación (SIN aireación-agitación)

-Tubos sin sello de parafina estéril y con agitación (CON aireación-agitación)

3.2.3. Condiciones del proceso de biotransformación:

a) ACONDICIONAMIENTO DEL SUSTRATO: Se utilizó cáscara de naranja

como sustrato para la biotransformación, la cual tuvo el siguiente tratamiento:

La cáscara de naranja fue recolectada de comerciantes de jugo de naranja

cercanos a la UNMSM. Enseguida, se extrajo el aceite de la cáscara de naranja

utilizando un equipo de arrastre al vapor; a continuación, la cáscara fue secada

a 80 º C por 24 horas en estufa. Posteriormente, la cáscara de naranja fue

triturada en un molino manual de tornillo sin fin y tamizada a un tamaño de

26

partícula menor a 0.5 mm de diámetro.

b)

MANTENIMIENTO

DEL

MICROORGANISMO:

El

microorganismo

Actinomyces naeslundii se mantuvo por resiembras periódicas en el medio Agar

Trypticasa

Soya

(TSA),

suplementado

con

1

%

de

pectina

cítrica.

Las

condiciones de crecimiento del microorganismo fueron de 37ºC durante 24

horas.

c) PREPARACIÓN DEL INÓCULO: El inóculo se preparó a partir de un cultivo

de 24 horas, haciendo diluciones de éste en solución fisiológica estéril, hasta

obtener una suspensión de células de 3 x 10 9 u.f.c./mL. De aquí, se tomaron

alícuotas

de

45

mL,

que

se

transfirieron

contenidos fueron de 150 mL.

a

matraces

erlenmeyer

cuyos

d) DISEÑO DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL : El medio de cultivo

estuvo representado por nutrientes ubicados dentro de un rango mínimo-

máximo:

27

CUADRO - 3

COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL:

 

NUTRIENTES

CONCENTRACIÓN MÍNIMA (g/L)

CONCENTRACIÓN MÁXIMA (g/L)

X

1

Cáscara de

2.000

16.700

 

naranja

X

2

(NH 4 ) 2 SO 4

1.000

5.000

X

3

Úrea

0.700

5.000

X

4

FeSO 4 .7H 2 O

0.013

0.080

X

5

CaC1 2

0.020

0.083

X

6

NaC1

1.000

5.000

X

7

MgSO 4 .7H 2 O

0.200

1.00

X

8

NaCO 3

0.800

4.000

Estos componentes fueron evaluados en una plantilla estadística de PlacKett-

Burman,

de

donde

se

obtuvo

los

nutrientes

producción de enzimas pectinasas.

más

significativos

para

la

e) OBTENCIÓN DE PECTINASAS: La obtención del extracto enzimático crudo

fue realizada por centrifugación, a 5000 rpm por 20 minutos de las muestras

constituidas por 5mL de cultivo, tomadas cada 8 horas, durante 7 días.

3.2.4. Métodos de análisis:

a) DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA: La

Actividad enzimática del extracto obtenido luego de la biotransformación, fue

28

evaluada por la liberación de azúcares reductores de la pectina (1% p/v pectina

sigma); la cual fue medida colorimétricamente, con el reactivo ácido 3,5 -

dinitrosalicílico (DNS). Se realizó una curva estándar de ácido D-galacturónico

al 1% preparado en solución amortiguadora de acetato 0.1M y pH 4.8 (Miller y

col., 1959) teniendo en cuenta que una unidad enzimática se definió como la

cantidad de enzima que liberó 1µM de ácido D-galacturónico por minuto a 50ºC.

b) DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BIOMASA: Fue utilizada la

técnica de recuento en placa de células viables, para lo cual se tomaron

alícuotas del cultivo cada 8 horas (1 mL);luego, se realizó diluciones seriadas,

para colocar 0.1 mL de células diluidas en la superficie de una placa TSA,

extendiéndose éstas, con una asa de Drigalski, e incubadas, finalmente, a

37ºC.

3.2.5. Análisis estadístico:

a) ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN LA

PRODUCCIÓN DE PECTINASAS: En una primera etapa de análisis se utilizó el

diseño experimental de Plackett-Burman para identificar los nutrientes de mayor

influencia en la producción de pectinasas, esto permitió evaluar 8 variables en

12 experimentos con 2 réplicas, teniendo en cuenta una concentración alta (+1)

y una baja (-1) de cada uno de los nutrientes. La evaluación de los mismos, se

realizó en frascos erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenían 150 mL

de medio experimental.

29

CUADRO - 4

PLANTILLA DE PLACKETT BURMAN ( Ayala y Pardo,1995 )

   

VARIABLE

 

N

X1

X2

X3

X4

X5

X6

X7

X8

1

1

1

-1

1

1

-1

-1

-1

2

1

-1

1

1

-1

-1

1 1

 

3

-1

1

1

-1

-1

-1

-1

1

4

1

1

1

-1

-1

1

1 -1

 

5

1

1

-1

-1

1

-1

1 1

 

6

1

-1

-1

1

-1

1

-1

1

7

-1

-1

-1

-1

1

1

1 1

 

8

-1

-1

1

1

1

-1

1 -1

 

9

-1

1

-1

1

-1

1

1 -1

 
 

10 -1

1

 

1

-1

1

1

-1

-1

 

11 -1

1

1

1

1

1

-1

1

 

12 -1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

Donde:

X1= Cáscara de naranja.

X5= CaCl2

X2= (NH4)2SO4

X6= NaCl

X3= (NH2)2CO

X7= MgSO4

X4= FeSO4*7H2O

X8= Na2CO3

30

A. OPTIMIZACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE NUTRIENTES PARA LA

MÁXIMA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS:

Se utilizó el Diseño de Box Benhken, el cual sirvió para determinar las

concentraciones óptimas de cada variable independiente (X1= Cáscara de

naranja; X2= (NH4)2 SO4 y X4= FeSO4. 7H2O ), para la máxima producción de

pectinasas, diseño que fue complementado con la técnica de análisis de

respuesta superficial a las variables independientes anteriores, para luego

ajustarlas al modelo polinomial cuadrático siguiente:

luego ajustarlas al modelo polinomial cuadrático siguiente: Donde: Z = Variable dependiente (Producción de enzima) X1=

Donde:

Z = Variable dependiente (Producción de enzima)

X1= Cáscara de naranja.

X2= (NH4)2SO4. X4= FeSO4*7H2O.

b0 = Constante por determinar

b1, b2, b3 = Coeficientes lineales por determinar

b4, b5, b6, b7, b8, b9 = Coeficientes cuadráticos por determinar.

31

CUADRO - 5

PLANTILLA DE BOX BENHKEN (Robles y Col. 1995)

   

VARIABLES

N

X1

X2

X4

1

1

1

1

2

1

-1

-1

3

1

1

0

4

1

0

-1

5

1

0

-1

6

1

-1

0

7

-1

1

1

8

-1

1

-1

9

-1

0

0

10

-1

0

-1

11

-1

0

1

12

-1

1

0

13

0

1

-1

14

-1

-1

-1

15

0

0

0

16

0

0

0

Para la identificación de un valor óptimo, fue necesario estimar la curvatura de

las

variables

ensayadas,

determinándose

los

coeficientes

del

modelo

polinomial, usando la técnica de regresión múltiple, cuyos valores fueron

asignados

a

las

ecuaciones

XY

polinomiales,

para

generar

respuestas

predictivas (representadas en los gráficos de respuesta en superficie y de líneas

de contorno).

32

b. Biotransformación final en biorreactor.

Con las concentraciones óptimas obtenidas del experimento anterior, se realizó

un último experimento, en el cual fueron evaluados el crecimiento microbiano y

la actividad enzimática, utilizando para ello un inóculo en fase logarítmica con la

finalidad

de

aprovechar

microorganismo.

la

fuente

de

33

carbono

en

el

mantenimiento

del

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

4.1. EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS pH,

TEMPERATURA Y AIREACIÓN-AGITACIÓN EN UN MEDIO SINTÉTICO,

PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.

4.1.1 DETERMINACIÓN DEL Ph ÓPTIMO:

FIGURA

1.

EFECTO

MICROORGANISMO:

DEL

pH

SOBRE

34

EL

CRECIMIENTO

DEL

FIGURA 2. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO A DIFERENTES pH 35

FIGURA 2. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO A DIFERENTES pH

35
35

4.1.2 DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA:

La evaluación del crecimiento del microorganismo vs. Temperatura en caldo

TSB, determinó que la temperatura óptima fue de 37 ºC, luego de 72 horas de

incubación (Figura 3).

fue de 37 ºC, luego de 72 horas de incubación (Figura 3). 4.1.3. DETERMINACIÓN DE LA

4.1.3. DETERMINACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN:

En experimentos previos se determinó que la mayor concentración de biomasa

(D.O. 0.65) se obtuvo en un medio control con aireación-agitación a 300 rpm.

Estos resultados, presentaron la necesidad de fijar valores de agitación 300 rpm

36

y aireación 0.5 vvm, para el proceso de biotransformación sobre medio natural.

(Figura 4).

de biotransformación sobre medio natural. (Figura 4). CRECIMIENTO PECTINASAS: DEL MICROORGANISMO Y PRODUCCIÓN DE

CRECIMIENTO

PECTINASAS:

DEL

MICROORGANISMO

Y

PRODUCCIÓN

DE

En la Figura 5, se observa que la máxima producción de pectinasas es

alcanzada en la etapa estacionaria del crecimiento microbiano, es decir,

a las 64 horas.

37

4.2. PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN: ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN LA PRODUCCIÓN DE

4.2. PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN:

ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN LA

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PECTINASAS:

El análisis del diseño de Plackett Burman demostró que los nutrientes que más

influyeron sobre la producción de pectinasas fueron: Cáscara de naranja ,

(NH4)2SO4 y FeSO4*7H2O, seleccionándose éstos, para un análisis posterior

de optimización

4.2.1. OPTIMIZACIÓN DE LOS 3 NUTRIENTES SELECCIONADOS EN LA

ETAPA ANTERIOR:

Mediante la optimización de los 3 nutrientes más influyentes, utilizando el

diseño de Box Benhken, obtuvimos los siguientes resultados:

38

Cáscara de naranja ( 16.7 g/ L ), (NH4)2SO4 (5 g/ L ), FeSO4*7H2O (0.013 g/ L

) y una producción máxima predictiva de pectinasas de 0.71 U.I./mL

4.2.2. BIOTRANSFORMACIÓN FINAL EN BIORREACTOR:

La cinética microbiana, llevada a cabo con los resultados obtenidos del diseño

de Box Benhken, maximizó la respuesta entre las 60 y 80 horas, tiempo en el

que se logró una producción de 0.65 U.I./mL de la enzima.

CUADRO 6:

CONCENTRACIONES ÓPTIMAS A TRABAJAR EN BIORREACTOR

– 6: CONCENTRACIONES ÓPTIMAS A TRABAJAR EN BIORREACTOR Volumen del medio experimental : 1000 mL

Volumen del medio experimental

: 1000 mL

Concentración celular del inóculo

: 3 x 10 9 u.f.c / mL

Tiempo de biotransformación

: 120 horas

Volumen de inóculo

: 100 mL

39

Temperatura

: 37 ºC

Aireación

: 0.5 vvm.

Agitación

: 300 rpm.

pH

: 7.0

En el resultado del crecimiento de la población microbiana que se muestra en la

Figura 6, podemos notar que éste obtuvo un máximo valor entre las 60 y 80

horas de transcurrido el proceso de biotransformación.

En la misma figura, se muestra la producción de pectinasas, durante el proceso

de biotransformación, registrándose una alta producción de 0.65

U.I./mL a las 72 horas, valor muy cercano a lo pronosticado en las Curvas de

Superficie Respuesta 0.71 U.I./mL

40

FIGURA - 7

CINÉTICA DE

CRECIMIENTO

Y PRODUCCIÓN

DE

PECTINASAS

POR

ACTIONOMYCES NAESLUNDII EN UN BIORREACTOR DE 1 LITRO

FIGURA - 7 CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE PECTINASAS POR ACTIONOMYCES NAESLUNDII EN UN BIORREACTOR

41

CONCLUSIONES

Se obtuvo una actividad enzimática de 0.65 U.I./mL en cultivo sumergido en

medio óptimizado, compuesto por cáscara de naranja 16.5 g/L, (NH4) 2SO4

5 g/L y FeSO4*7H2O 0.013 g/L.

Las condiciones de crecimiento y producción de pectinasas por Actinomyces

naeslundii son: pH 7.0, 37 ºC, 300 rpm y 0.5 vvm de aireación.

42

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por

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44