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LABORATORIO # 1 PARA LOS CURSOS DE BIOTECNOLOGA

Y BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA 2017-4


GRUPO 2

Atento saludo estimados estudiantes:

Ustedes han sido citados para desarrollar las sesiones de laboratorio de los cursos
de Biotecnologa y Biotecnologa alimentaria de forma unificada en el CEAD
Duitama.

De acuerdo a lo anterior, se ha conformado un solo grupo de laboratorio de 15


estudiantes entre de los cursos de Biotecnologa y Biotecnologa alimentaria.

Las sesiones y las temticas ( han sido modificadas de acuerdo a la disponibilidad


de reactivos y equipos ) de laboratorio son:

Fecha hora Practica Materiales indispensables


que deben traer lso
estudiantes
Prctica 1. determinacin de la Alimentos de panadera
curva de crecimiento de contaminados con hongos de
06 DE organismos unicelulares la clase de penicillium (color
OCTUBRE 8:00 a.m a Prctica 2. Aislamiento de verde)
DE 2017 5:00 p.m microorganismos productores 100 gramos de papa blanca
de amilasa parte I. limpia sin pelar.
Practica 3. Elaboracin curva Ver :
patrn para la cuantificacin de Otros materiales que deben
azcares reductores por el traer los estudiantes, pgina
mtodo de DNS. 2.
8:00 a.m a Prctica 4. Prctica 4. Para esta prctica se requiere
12 DE 5:00 p.m Extraccin de los extractos 10 g de granos en remojo por
OCTUBRE enzimticos, parte II. 24 horas de: trigo, cebada,
DE 2017 4.1 aislamiento de amilasas arroz, lenteja.
vegetales Ver :
4.2 aislamiento de amilasas Otros materiales que deben
fngicas: traer los estudiantes, pgina
Practica 5. Cuantificacin de 2.
azcares reductores a partir de
la actividad amilsica fngica y
vegetal.

Nota: Cada estudiante debe tener presente que en la UNAD Duitama no se dispone
del servicio de restaurante, as que cada uno de Ustedes debe organizarsen en la
parte de la toma de almuerzo. No se dispone de tiempo para el desplazamiento a
Duitama ni para ir al servicio de alimentacin del SENA. Se les ofrece el servicio de
horno microondas.
Otros materiales que deben traer los estudiantes:

Se recomienda que por ser el primer dia, los estudiantes se presenten con
todos los materiales si les es posible, ponerse de acuerdo entre s, pero
se requieren en la primera sesin:

- 50 gramos de levadura granulada (no sirve molida ni hmeda).


- Guantes desechables de nitrilo(varios pares).
- 500 ml de alcohol antisptico.
- marcador tipo sharpie. Gasa y tijeras
- hisopos o bastoncillos de algodn estriles
- Gorro desechable. Tapabocas
- Toalla de manos.
- 100 ml de hipoclorito de sodio (blanqueador casero).
- papel milimetrado (3 hojas), regla
- gafas de seguridad
- bata blanca ( no se acepta de otro color)
- algodn (una bolsa), cinta de enmascarar, dos pliegos de papel peridico.

Calificacin:

La fecha para la presentacin del informe ser asignada en el laboratorio.


El valor de las cinco sesiones de laboratorios se trabajara en la escala de 0-5.0
representados en porcentajes as:

1. Evaluacin del marco terico asignado: que reemplaza al preinforme.


Valor: 20%
2. Informe de laboratorio en la fecha asignada: los cuales se calificarn de acuerdo a
la rbrica. Ver anexo 2.
Valor: 65%.
3. Puntualidad, desempeo y desenvolvimiento durante la sesin de laboratorio. Valor
15%.

Cada estudiante de forma individual, repasar y alistar los siguientes temas y


presentar una evaluacin al inicio del laboratorio: Consulte el documento de
biotecnologa que se adjunta , opcionalmente, puede consultar otras fuentes
bibliogrficas como biologas, microbiolgicas y bioqumicas que se
encuentren en el entorno de evaluacin y seguimiento del curso.

Fecha Practica Tema


Prctica 1. determinacin de la curva de crecimiento de Nutricin microbiana. Crecimiento
organismos unicelulares microbiano. Curvas de crecimiento
06 DE microbiano
OCTUBRE Prctica 2. Aislamiento de microorganismos Definicin de enzima, aspectos generales
productores de amilasa parte I. de la cintica enzimtica. Amilasa.
Practica 3. Elaboracin curva patrn para la Que es la glucosa. Que son los azucares
cuantificacin de azcares reductores por el mtodo reductores. En que consiste el mtodo
de DNS. DNS.
Prctica 4. Aislamiento de amilasas a partir de granos - Composicin qumica del almidn.
12 DE parte II: Hidrlisis enzimtica del almidn.
OCTUBRE Practica 5. Cuantificacin de azcares reductores a Productos de la hidrolisis enzimtica del
partir de la actividad amilsica fngica y vegetal. almidn.
PRACTICA 1. DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE
ORGANISMOS UNICELULARES
(Adaptacin guas #1 de cursos de biotecnologa y biotecnologa alimentaria)

Prepare 1L de una solucin al 5% de hipoclorito de sodio y realice una


limpieza profunda al mesn donde realizar la siembra de levadura. Prepare
previamente un mechero de alcohol para esterilizar el ambiente. Por favor
llevar recipiente plstico para el almacenamiento de la solucin.

Objetivos: Determinacin de la curva de crecimiento de organismos unicelulares


(bacterias y levaduras), determinando los parmetros principales que la caracterizan.

1. Activacin de lavadura, cultivo madre:

Medio de activacin de levadura: preparar 200 ml:


Sacarosa 20 g/L,
Extracto de levadura 1 g/L,
KH2PO4 1 g/L
agua estril o de bolsa.
Esterilizar en autoclave a 120 o C por 15 minutos.

Activacin de la levadura: una vez el medio este frio, pesar 15 gramos de levadura
granulada (no sirve molida ni hmeda). Mezclar bien, colocar tapn de gasa o
vinipel. Colocar a incubar a 28C- 30 C por 2 horas. Nota: se debe preparar entre
las 7:00 - 8: a.m del mismo dia por el monitor de laboratorios. Asegurar que la
incubadora o el bao termosttico tienen la temperatura adecuada para el
crecimiento. Se debe realizar una limpieza y desinfeccin previamente con
hipoclorito al equipo para evitar contaminacin de la levadura.

2. Preparacin de medios de activacin de levadura:

Cada grupo debe preparar 100 mL de uno de los siguientes medios, use un
Erlenmeyers y tapn de gasa estril.

1. Medio de fermentacin estril Sacarosa.


Sacarosa 20 g/L,
Extracto de levadura 1 g/L,
KH2PO4 1 g/L
Esterilizar en autoclave a 120 o C por 15 minutos.

2. Medio de fermentacin estril glucosa.


Glucosa 20 g/L,
Extracto de levadura 1 g/L,
KH2PO4 1 g/L
Esterilizar en autoclave a 120 o C por 15 minutos.

3. Medio de fermentacin estril de almidn de papa.


Almidn de papa rayado 20 g/L,
Extracto de levadura 1 g/L,
KH2PO4 1 g/L
Esterilizar en autoclave a 120 o C por 15 minutos

4. Medio de fermentacin estril sin fuente de carbono .


Extracto de levadura 1 g/L,
KH2PO4 1 g/L
Esterilizar en autoclave a 120 o C por 15 minutos.

.
3. Crecimiento Microbiano:

3.1 Pese cada uno de los tubos taparosca, no destapar y tomarlos con guantes.
Anotar el peso de cada tubo.

3.2 Tome los tubos de ensayo estriles con tapa rosca y mrquelos de las
siguiente forma (use pipetas estriles y mecheros).

Tubo Horas de Procedimiento


incubacin.
blanco 0.0 Adicione 10 mL del medio de cultivo sin inocular. Colquelo
en un bao de hielo.
Tome con una pipeta estril, 20 mL del medio de levadura y adicinelo al resto del
medio de cultivo, agite bien.
Tubo Horas de Procedimiento
incubacin
1 0.0 Adicione 10 mL del medio de cultivo, tapar bien el tubo.
Almacenar en bao de hielo a 4 C hasta el final del
crecimiento (minuto 300).
2 Adicione en cada tubo 10 mL del medio de cultivo, tapar
bien el tubo. Incubar entre a 28C- 30 C por el tiempo
3 1.0
requerido.
4 1
5 2.0 Al final de la incubacin, pesar el tubo, registrar el peso.

6 3.0 Almacenar en bao de hielo a 4 C hasta el final del


7 4.0 crecimiento (minuto 300).

3.3 Determinacin de la biomasa por gravimetra

Registre los datos en la siguiente tabla:

TIEMPO (X)

Peso tubo vaco

Peso (Y)

Peso (Y) neto

Grafique los resultados: total grficas, 4 (por cada medio de


incubacin).
Grafique biomasa en Y, tiempo en X. Analice el comportamiento de
la grfica e indique las fases de crecimiento microbiano que identifica.
Compare los resultados los resultados por cada medio de cultivo
empelado y establezca diferencias o similitudes.

3.4 Determinacin del crecimiento por espectrofotometra:


Calibrar el equipo a 0.0 de Absorbancia con el medio de cultivo del tubo blanco.

1. Registre los datos en la siguiente tabla:

TIEMPO (X)

ABSORBANCIA (Y)

600 nm

Grafique los resultados: total grficas, 4 (por cada medio de incubacin).

Realice una grfica con produccin de biomasa (Nmero de clulas por unidad
de tiempo) en unidades de Absorbancia vs tiempo de incubacin. Analice el
comportamiento de la grfica e indique las fases de crecimiento microbiano
que identifica. Compare los resultados los resultados por cada medio de
cultivo empelado y establezca diferencias o similitudes.

Nota: cada grupo reporta los datos y el comportamiento grfico de los cuatro
medios empleados: En total son 8 grficas a reportar con su respectivo
anlisis.

PRACTICA 2. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE


AMILASA

Prepare 1L de una solucin al 5% de hipoclorito de sodio y realice una


limpieza profunda al mesn donde realizar la siembra de levadura. Prepare
previamente un mechero de alcohol para esterilizar el ambiente. Por favor
llevar recipiente plstico para el almacenamiento de la solucin.

2.1 OBTENCION DE LOS MICROORGANISMOS


Se lleva a cabo de la descomposicin de alimentos de panadera. El alimento se
expone al ambiente clido por periodos de tiempo de 10 a 20 das.

2.2 purificacin de las cepas


2.3 preparacin del medio vegetativo PDA con antibitico
Este medio es especfico para hongos. El medio se sebe preparar para la cantidad
requerida.
Papas peladas y cocinadas: 70 g
Glucosa 4.5 g
Agar 7 g
Agua destilada 100 mL
Una vez el medio ha esterilizado adicionar 1 ml de solucin de antibitico sobre cada
medio cuando tenga una temperatura de 37C.

Solucin de penicilina: 60mg (100. 000 unidades) en 750 ml agua estril.


Solucin de estreptomicina o cloranfenicol: disolver 1 gramo en 750 ml de agua estril.
2.4 Procedimiento:
En vasos de precipitado se colocan las papas peladas se hierven en 50 ml de agua
destilada hasta que estn cocidas. Posteriormente el jugo se filtra mediante de
lienzo o tela, se agrega el agar y la glucosa y se enrasa con agua destilada hasta
obtener un volumen total de medio de 100 mL.
Hacer un tapn con algodn o gasa y cubrir la boca del erlenmeyer, marcar y colocar
dentro de la autoclave hasta alcanzar los parmetros requeridos (Se esteriliza en
autoclave a 15 p.s.i. por 20 minutos a 121 C.)
Una vez finalizada la esterilizacin se sirve en los diferentes placas de petri, (4 cajas
grandes aproximadamente 30 ml, y en una pequea para control de esterilidad,
teniendo siempre el mechero prendido para dar un ambiente asptico.

Siembra: Con la ayuda de un asa o aguja utilizando las tcnicas de placa estriada y
en condiciones de asepsia sembrar las mejores cepas de hongos, tome cepas que han
crecido en el alimento, marcar y rotular. Incubar a 28C hasta esporulacin (5 - 8 das).

PRACTICA 3. ELABORACIN CURVA PATRN PARA LA CUANTIFICACIN DE


AZCARES REDUCTORES POR EL MTODO DE DNS.

DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES POR EL MTODO DE DNS


3,5-CIDO DINITROSALISILICO (Miller, G. 1959).

El mtodo elegido est basado en la medida de la cantidad de azcares reductores


(glucosa +fructosa) liberados durante la hidrlisis de la sacarosa, catalizada por las
invertasa. Para ello se utilizar el reactivo 3,5-dinitrosalicilato. En presencia de
azcares reductores el 3,5-dinitrosalicilato es reducido a 3,5-diaminosalicilato. Este
compuesto presenta un mximo de absorcin a 540 nm y, por lo tanto, el valor de la
absorbancia a dicha longitud de onda ser proporcional a la concentracin de
azcares reductores (glucosa + fructosa) presentes en el medio

Reactivos
- 100 ml de solucin de hidrxido de calcio 5%.
- 1000 ml de agua destilada hirviendo
- 1.25 grs de DNS
- 37.5 grs de tartrato de sodio y potasio
- 2 gramos de NaOH y disolverlos en 125 ml de agua destilada
- 100 ml Patrn de glucosa 1.0 g/L
- Muestras problema
- Papel milimetrado

Preparacin de reactivos:

Preparacin reactivo DNS (hacerlo en la oscuridad): Preparar una solucin de


NaOH (2 gramos de NaOH y disolverlos en 125 ml de agua destilada) y adicionar
1.25 grs de DNS + 37.5 grs de tartrato de sodio y potasio, disolver delicadamente
hasta completa disolucin. S se desea preparar menos reactivo, hacer los
clculos para preparar 100 mL.

En un baln aforado de 250 ml, verter lentamente y con agua destilada aforar hasta
la marca. Mezclar bien y envasar el reactivo en un frasco oscuro mbar. Marcar con
el nombre, fecha de elaboracin. Dejar almacenado en la oscuridad.
Preparacin patrn de glucosa: En un baln aforado, preparar 100 ml de un patrn
de glucosa 1g/L. Pesar la cantidad requerida y almacenar en refrigeracin, Marcar
con el nombre, fecha de elaboracin.

Procedimiento:

Elaboracin de la curva patrn

A partir de la solucin de 1 g/L de glucosa se preparan 7 tubos con diferentes


concentraciones, tal como se indica en la tabla 1: Previamente se debe tener agua
en ebullicin para el bao mara.

Se debe presentar de la siguiente forma:

Concentracin
de glucosa
Tubo Absorbancia (Eje X)
(mg/L)* (Eje
X)

0 (blanco)

En todos los tubos se debe


1 restar la Absorbancia del
blanco

De cada tuvo

Tapar los tubos con papel aluminio. Calentamiento a 100C * 5 min+ bao
ml de del Volumen

Dejar en reposo 15 min y leer a 540 nm como longitud de onda. Llevar a


ml agua Volumen
tubo solucin de final tomar: mL de DNS
destilada final (ml)
glucosa 1 g/L

0 1 ml +agitar
0 10 10 1 ml
(blanco) completamente.

1 ml +agitar
1 1.5 8.5 10 1 ml
completamente. 10 ml Agua destilada +agitar completamente.

1 ml +agitar
2 2 8 10 1 ml
completamente. 0.0 de absorbancia con agua destilada.

1 ml +agitar
3 3 7 10 1 ml
completamente.

1 ml +agitar
4 5 5 10 1 ml
completamente.

1 ml +agitar
5 7 3 10 1 ml
completamente.

1 ml +agitar
6 8 2 10 1 ml
completamente.
de hielo.

1 ml +agitar
7 10 0 10 1 ml
completamente.

*Concentracin de glucosa (mg/L): Se debe calcular la concentracin de glucosa


que hay en los tubos 1 al 6, teniendo en cuenta que parte de 100 ml a 1g/L de
glucosa, adems se debe tener en cuenta que los tubos del 1-6 se diluyen a 10 ml
con agua destilada .

Una vez determinada la concentracin de glucosa en cada tubo, se debe graficar en


Excel usando el grfico de dispersin ( y la ecuacin de la recta) , los siguientes
valores:

tubo Concentracin de Absorbancias


glucosa (mg/L)*
Eje y.
Eje X

La ecuacin generada es la que se usa para determinar la concentracin de


azcares reductores en las muestras problema, as:

Y = a*x+b

Dnde:
Y= las absorbancias de la muestra problema.
a= pendiente de la recta, se obtiene de la recta
b= es el corte en el eje y, se obtiene de la recta
x= es la concentracin de azcares reductores e la muestra expresada en mg/L.

PRCTICA 4. EXTRACCION DE LOS EXTRACTOS ENZIMATICOS- parte II

4.1 aislamiento de amilasas vegetales

Para esta prctica se requiere 10 g de granos en remojo por 24 horas de: trigo,
cebada, arroz, lenteja.

Prepare 30 ml de un macerado acuoso as: con 10 g de semillas de cebada


germinada ms 30 ml de agua, el agua debe estar caliente (50 grados). Aada
5 gotas de glicerina para extraer lo ms posible los enzimas. Filtre el extracto y
deje reposar de 15 - 20 min. Marque como extracto enzimtico amilasas
vegetales, indique el nombre del cereal incube a 37 C por 60 min.

4.2 aislamiento de amilasas fngicas:

Prueba cualitativa: tomar una de las placas, vierta con mucho cuidado la
dilucin de yodo (lugol) sobre las placas inoculadas hasta cubrir
completamente la superficie del agar. Las zonas en que todava quede almidn
se teirn de un color entre azul y negro. S los microorganismos han
degradado el almidn aparecern zonas de color marrn claro

Despus de considerar los sustratos enzimticos que dieron positivos para las
pruebas anteriores se procede a realizar la extraccin de los extractos.
Utilizar los elementos de seguridad, trabajar con el mechero prendido, Ojo!!!!
Es importante el uso de guantes y tapabocas industrial

Previamente tenga agua estril caliente a 37C (200 ml): Coloque toda la
biomasa de la cajas de Petri en vasos de precipitado de 100 ml. adicione 50
mL de agua. Agite bien. Filtre sobre tela y luego sobre papel filtro y recoja el
filtrado sobre un bao de hielo. Se requieren 30 mL de extracto. Marque
como extracto enzimtico amilasas fngicas incube a 37 C 60 min.

Importante: Deseche los residuos esterilizndolos en autoclave.

PRACTICA 5. CUANTIFICACIN DE AZCARES REDUCTORES A PARTIR DE LA


ACTIVIDAD AMILSICA FNGICA Y VEGETAL.

5.1 Preparacin del sustrato:

En un baln aforado, preparar 200 mL de un patrn de almidn 1g/L. pesar la


cantidad requerida, disolverla en 50 mL y hervir durante 2 minutos enfriar y adicionar
5.0 mL de Cloruro de potasio 1.0 %. Luego llevar al baln aforado y enrasar con
agua destilada hasta la marca. Una vez frio, filtrar.

Tomar dos Erlenmeyers estriles de 100 mL cada uno y dividir el sustrato y


marcarlos as:

Solucin de reaccin 1 ( amilasa vegetal) Solucin de reaccin 2 ( amilasa fngica)

Incube a 37 C 60 min. Incube a 37 C 60 min.

5.2 Cuantificacin de azcares reductores

Cuando los extractos enzimticos y el sustrato estn a la misma temperatura


realizar:

Tubo Horas de Procedimiento


incubacin.
blanco 0.0 Adicione 10 mL del sustrato sin inocular. Colquelo en un
bao de hielo. Realcelo por duplicado.
Ahora, con pipetas estriles y sobre cada sustrato:

Solucin de reaccin 1 ( amilasa vegetal) Solucin de reaccin 2 ( amilasa fngica)

Adicionar 15 mL del extracto enzimtico Adicionar 15 mL del extracto enzimtico


amilasas fngicas. amilasas vegetales

Agitar bien por 5 minutos, tapar con vinilpel o gaza. Incube y mantenga a 37 C .

Tome los tubos de ensayo estriles y mrquelos de las siguiente forma (use pipetas
estriles y mecheros). Use tapones de algodn o papel aluminio.
Tubo Horas de Procedimiento
incubacin
1 0.0 Adicione 10 mL de cada solucin de reaccin (1 y 2), siempre
teniendo la precaucin de agitar bin el erlenmeyer, tapar
2
bien el tubo. Almacenar en bao de hielo a 4 C hasta el final
3 1.0 del crecimiento.
4 1
Tener presente que este procedimiento se hace por duplicado
5 2 dado que se tiene dos medios de reaccin.
6 3.0 Los medios de reaccin siempre deben permanecer a 37 C.

5.3 Determinacin de azcares reductores en las muestras:

Preparar un blanco as: 1 ml de agua destilada + 1 ml de DNS y se somete a lo


dems tratamientos:

Con los tubos del paso 5.2 tomar 1 mL de cada uno de ellos y en otros tubos de
ensayo, realizar:

Ser necesario realizar diluciones seriadas a partir de


esta cantidad de muestra, si la absorbencia es mayor
de 2.0: 10-1, 10-2, 10-3.

Tomar de la
aluminio. Calentamiento a 100C

ml de DNS

Dejar en reposo 15 min y leer a


540 nm como longitud de onda.
muestra
10 ml Agua destilada +agitar
Tapar los tubos con papel

* 5 min+ bao de hielo.

1ml 1 ml +agitar completamente.


completamente.

1ml 1 ml +agitar completamente.

1ml 1 ml +agitar completamente.

1ml 1 ml +agitar completamente.

Registrar los resultados en la siguiente tabla:


tubo Absorbancias tubo Absorbancias

0 0
Solucin de 1 Solucin de 1
reaccin 1 reaccin 1
( amilasa 2 2
( amilasa
vegetal) fngica )
3 3

4 4

5 5

6 6

Con la ecuacin de la recta elaborada en la prctica 3, se debe calcular la cantidad


inicial de azcares reductores en mg/L. Tenga en cuenta el volumen total de cada
tubo. En los clculos tener en cuenta las diluciones realizadas, si se hicieron.