COLEGIO DE ESTUDIOS CIENTÍFICOS Y TECNOLÓGICOS DEL ESTADO DE

MICHOACÁN

BIOTECNOLOGÍA

Módulo III

Aplica técnicas de cultivo de tejidos vegetales

Submódulo I

Aplica diferentes técnicas de propagación in vitro

“Establecimiento del cultivo aséptico en azalea (Rhododendron catawbiense)”

Profesor:

Ing. Ramiro Christian Raya Sánchez

Alumnos:

Elizabeth Martínez Cruz Javier Ramos Carmona

Yazmín Hernández Rodríguez Leslie Guadalupe Ramos Anguiano

Ismael Ramos Vitela Paola Rodríguez Hernández

Dulce María Tenorio Meza Emmanuel Nuñez Ibarra

Cuarto semestre Proyecto Final

Grupo 402 - B

31 de Mayo del 2023

 Establecimiento del cultivo aséptico en Azalea

OBJETIVO:

Establecer y evaluar de manera exitosa un cultivo aséptico de la azalea (Rhododendron

catawbiense), utilizando técnicas de esterilización superficial y de tejidos, siembra en

medio de cultivo estéril y mantenimiento adecuado de condiciones ambientales y

nutrientes, con el objetivo de obtener plantas sanas y libres de contaminantes.

El objetivo principal es lograr establecer un cultivo aséptico exitoso de la azalea,

proporcionando información detallada sobre las técnicas utilizadas, los resultados

obtenidos y las recomendaciones para la propagación y conservación efectiva de esta

especie en entornos controlados.

INTRODUCCIÓN:

Entre las plantas leñosas ornamentales más difundidas se encuentran las del género

Rhododendron, a la cual pertenecen las azaleas y rododendros. Existe una gran

cantidad de genotipos de Rhododendron spp., los cuales destacan por sus hermosas

flores, agrupadas en inflorescencias de variados y vistosos colores. La propagación

tradicional de ellas se ha realizado básicamente a través de la propagación vegetativa,

mediante el enraizamiento de estacas. Sin embargo, esta técnica ha presentado

limitaciones debido al escaso material inicial a multiplicar y al bajo porcentaje de

enraizamiento de ellas. Debido a esto se han desarrollado otras alternativas de

multiplicación, tales como la micropropagación, a partir de yemas apicales, florales o de

tejido vegetativo como explantes foliares, siendo además una valiosa herramienta para

la eliminación de virus. El desarrollo de técnicas de cultivo in vitro podría ser el mejor

procedimiento para desarrollar tejidos para la preservación del germoplasma,

propagación rápida y el mejoramiento del cultivo, lo que ayudaría a incrementar la

productividad y rentabilidad, además de cubrir plenamente la demanda de su semilla.

La micropropagación es una solución a esta problemática, ya que con este método la

planta se desarrolla más rápido y los materiales vegetales que se obtienen se encuentran

controlados de plagas, enfermedades y efectos climáticos. Este método permite proveer

rápidamente el material vegetativo para nuevas plantaciones, considerando genotipos

seleccionados de acuerdo a sus propiedades como productividad, resistencia, etc.

JUSTIFICACIÓN:

El establecimiento de un cultivo aséptico de azalea representa una estrategia

prometedora para mejorar la propagación y conservación de esta planta de alto valor

ornamental. Mediante este reporte de práctica, se busca difundir los conocimientos y las

técnicas necesarias para implementar con éxito el cultivo aséptico de la azalea,

brindando así una herramienta de utilidad para la industria floricultora y la

preservación de esta fascinante especie.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:

● Bisturís

● Pinzas

● Recipientes para cultivos in vitro con las siguientes cualidades:

1. Poder disponer de él en forma estéril - Mantenimiento en esterilidad

durante el cultivo del explanto.

2. Posibilidad de reutilización

3. Transparencia del material, que permitirá visualizar el desarrollo del

explanto, y que pueda realizar fotosíntesis

 4. Capacidad de mantenerse en estado inerte (no intercambiar compuestos

de ningún tipo)

5. No deformación tras sucesivas esterilizaciones,

6. Resistencia a impactos

7. Permitir intercambiar gases con el exterior sin que se contamine

8. Simplicidad de su uso

9. Fácil disponibilidad

10. Bajo coste.

● Soportes para las cajas o ● Fosfato de potasio

gradillas ● Ácido bórico

● Autoclaves ● Molibdato de sodio

● Cabina de flujo laminar ● Sulfato ferroso

● Mechero de alcohol ● Etilendinitrilotetracetato

● Alcohol disódico (sal disódica)

● Algodón ● Tiamina

● Nitrato de amonio ● Azúcar

● Nitrato de potasio ● Hidróxido de sodio 1N

● Sulfato de magnesio ● Ácido clorhídrico 1N

● Sulfato manganoso ● Etanol

● Sulfato de zinc ● Agua Bidestilada

● Sulfato cúprico ● Agar para el cultivo de tejidos

● Cloruro de calcio vegetales.

● Yoduro de potasio ● Ácido naftalenacético (INA)

● Cloruro de cobalto ● Benciladenina (BA)

PROCEDIMIENTO:

A) MEDIO DE CULTIVO (COMPOSICIÓN QUÍMICA):

Nitrato de amonio Sulfato ferroso

Nitrato de potasio Etilendinitrilotetracetato disódico (sal

Sulfato de magnesio disódica)

Sulfato manganoso Tiamina

Sulfato de zinc Azúcar

Sulfato cúprico Hidróxido de sodio 1N

Cloruro de calcio Ácido clorhídrico 1N

Yoduro de potasio Etanol

Cloruro de cobalto Agua Bidestilada

Fosfato de potasio Agar para el cultivo de tejidos vegetales.

Ácido bórico Ácido naftalenacético (INA)

Molibdato de sodio Benciladenina (BA)

B) PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MS:

Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o 100 veces

(Soluciones Madre o Stock).

En la solución madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre que no se

produzcan problemas de precipitación. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en

forma de quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo.

1. Calcular las cantidades necesarias de los componentes del medio a partir del volumen

de medio a preparar.
2. Añadir unos 100 ml de agua destilada en el recipiente escogido para preparar el

medio.

3. Añadir el volumen necesario de las soluciones de macronutrientes, micronutrientes,

hierro, vitaminas y reguladores de crecimiento (en su caso).

4. Añadir la cantidad de sacarosa requerida y agitar hasta disolución completa. 5.

Ajustar al volumen final con agua destilada.

6. Ajustar el pH a 5.7 con la ayuda de soluciones 0.1 M de HCl o OHNa.

7. Añadir el gelificante

8. Disolver el gelificante con calor (agitador magnético con calefacción, autoclave, horno

microondas).

9. Dosificar en el recipiente de cultivo (tubos, cajas magenta, baby foods…) y rotularlos

adecuadamente.

10. Esterilizar el medio y su recipiente en autoclave a 121 ºC (15 p.s.i). durante 15

minutos.

11. Guardar el material utilizado hasta el momento de su utilización.

C) ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La esterilización de los medios de cultivo es un paso crucial en la propagación de

plantas in vitro, incluyendo la azalea. La propagación in vitro implica el cultivo de

plantas en un medio estéril, libre de microorganismos y contaminantes, para asegurar

un crecimiento saludable de las plantas. Generalmente la esterilización del medio de

cultivo, cristalería e instrumentos se lleva a cabo en autoclave. El tiempo de

esterilización empleado es de 15 minutos a una presión de 15 lb. /pul (1 kg. /cm ) y una
2 2

temperatura de 120-121 C.
o

D) SELECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL (LAVADO, AGENTE

DESINFECTANTE, SOLUCIÓN Y TIEMPO DE EXPOSICIÓN)

Los explantes, se recolectan desde las estacas en todas las épocas de ingreso de material.

Para la desinfección de ellos se usó un método estándar consistente en un lavado y una

desinfección superficial de las estacas con agua corriente con un detergente comercial

(Quix M.R.), luego con agua destilada, solución fungicida-bactericida (Captan 2,7 g/L y

Agrept 0,5 g/L) por aproximadamente 2 horas. Finalmente se desinfectaron con etanol

(70%), por 5 segundos y luego una solución de hipoclorito de sodio al 1% (50 mL de

cloro comercial, 200 mL de agua destilada estéril más 2 gotas de detergente Quix M.R.)

por 10 minutos, para finalmente realizar tres enjuagues con agua destilada estéril. Este

método estándar sufrió algunos cambios, debido a las diferentes reacciones observadas

en los explantes por ello se variaron los tiempos de desinfección, cambios en la

concentración de los productos (NaOCl) y por último la incorporación de otros

productos desinfectantes (Benomilo 1g/L) y de sustancias antioxidantes (ácido cítrico 0,2

g/L y de ácido ascórbico 0,2 g/L).

E) OBTENCIÓN DE LOS EXPLANTES

1. Selección de la planta madre: Seleccionar una planta sana y libre de enfermedades

para obtener los explantes.

2. Preparación del material: Esterilizar todo el material de trabajo, incluyendo las

herramientas, el medio de cultivo y el área de trabajo, para evitar la contaminación

microbiana.
3. Obtención de los explantes: Cortar pequeñas porciones de tejido vegetal de la planta

madre, como hojas, brotes o tallos, utilizando una cuchilla estéril.

F) TRANSFERENCIA DE LOS EXPLANTES A LOS MEDIOS DE CULTIVO

Utiliza pinzas estériles para transferir los explantes desinfectados al medio de cultivo

MS estéril. Coloca los explantes en posición vertical u horizontal, según sea necesario,

asegurándose de que estén completamente sumergidos en el medio.

G) CONDICIONES DE INCUBACIÓN (INTENSIDAD LUMINOSA,

FOTOPERIODO, TEMPERATURA)

Temperatura: La temperatura de incubación puede variar dependiendo de la fase de

cultivo. Para la etapa de establecimiento, se suele mantener a una temperatura más alta,

alrededor de 25-27 °C, para promover la inducción de callo y la multiplicación celular.

Posteriormente, durante la fase de enraizamiento y brotación, se puede reducir la

temperatura a alrededor de 22-24 °C para estimular un crecimiento óptimo.

Fotoperíodo: La azalea es una planta que responde bien a la luz, por lo que se

recomienda un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Esta relación de

luz y oscuridad se puede lograr utilizando luces artificiales o colocando los explantes en

un ambiente con luz natural y controlada.

Intensidad lumínica: La intensidad lumínica adecuada puede influir en el crecimiento y

desarrollo de los explantes. Se recomienda proporcionar una intensidad lumínica media

a alta, alrededor de 3000-5000 lux, para favorecer una fotosíntesis eficiente y el

desarrollo de brotes y raíces saludables.

Humedad relativa: La humedad relativa debe mantenerse alta durante el proceso de

incubación para evitar una excesiva pérdida de agua por los explantes. Se sugiere

mantener una humedad relativa alrededor del 70-80% para proporcionar un ambiente

húmedo que favorezca el enraizamiento y el crecimiento adecuado de los explantes.

BIBLIOGRAFÍA

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Cárdenas, R. G. (1 de 1 de 2006). FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS. Obtenido de

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Sanfeliu, A. P. L. M. J. S. R. (s. f.). T3: Equipos. http://cv.udl.cat/cursos/76304/t3/t3.htm

Probiotek. (2019, 17 julio). Murashige & Skoog (MS) Medium | Probiotek. Probiotek |
Productos y Equipos Biotecnológicos.
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0400004#:~:text=El%20medio%20MS%20es%20considerado,4%2D%20(1.0%2
0mM)