CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA VETERINARIA

Carrera: MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

SEMESTRE 5º “B”

NOMBRE DEL ALUMNO: _______________________________________

PROFESORES: D. EN C RODOLFO GONZÁLEZ SEGOVIA

APOYO TÉCNICO: T.L.Q BERTHA OROZCO LÓPEZ

SEMESTRE: ENERO-JUNIO 2021

ACTUALIZADO: ACADEMIA MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

FECHA DE ACTUALIZACIÓN: DICIEMBRE 2020

PROFESORES: D. EN C. RODOLFO GONZÁLEZ SEGOVIA

APOYO TÉCNICO: T.L.Q BERTHA OROZCO LÓPEZ

MATERIA: MICROBIOLOGÍA VETERINARIA

CENTRO
CENTRO DE CIENCIAS BASICAS
ACADÉMICO:
DEPARTAMENTO
MICROBIOLOGIA
ACADÉMICO:
PROGRAMA
MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
EDUCATIVO:
CLAVE
AÑO DEL PLAN DE
2015 SEMESTRE: 5º “B" DE LA 23327
ESTUDIOS:
MATERIA:
PERIODO EN
MICROBIOLOGÍA Y
ÁREA ACADÉMICA: QUE SE ENERO-JUNIO 2021
PARASITOLOGIA
IMPARTE:

DESCRIPCION DEL CURSO:

El curso consta de una sesión de laboratorio por semana que se llevará a cabo los
lunes de 12 a 14 horas. Este se desarrollará por exposición oral por parte del profesor y
preguntas dirigidas a los alumnos de acuerdo al protocolo de cada práctica indicado en el
manual, el cual deberá ser leído con anterioridad. La participación del estudiante deberá
ser activa durante todo el curso.
Para ingresar a cada sesión se dará un límite máximo de 10 minutos de tolerancia
y, será necesario llevar bata blanca para ingresar. Una vez que se pasa lista no se
otorgan retardos.
Se realizarán reportes de prácticas que deberán ser entregados en tiempo y forma,
según indique el profesor.

OBJETIVO GENERAL
 Que el alumno conozca y realice las técnicas básicas en el laboratorio de
Microbiología que le permitan el dado momento el aislamiento e identificación de
microorganismos de importancia en la medicina veterinaria.

RELACIÓN DE PRÁCTICAS:
NOTA. Este programa podrá sufrir algunos cambios, los cuales siempre se
notificarán con una semana de anticipación.

FECHA
NÚMERO Y NOMBRE DE LA PRÁCTICA

25- ENERO Presentación. Lineamientos Generales: Reglamento, Criterios de

Evaluación, Organización del grupo.
8- FEBRERO 1 Uso y manejo del microscopio
15- FEBRERO 2.1Frotis y tinción simple
22- FEBRERO 2.2 Tinción de Gram

1
 1- MARZO 2.3 Tinción de Ziehl-Neelsen
8- MARZO 3.Tinciones Especiales
22- MARZO 4. Técnicas de Siembra y Medios de cultivo
29- MARZO 5. Pruebas Bioquímicas
5- ABRIL PRIMER EXAMEN PARCIAL
12- ABRIL 6. Determinación de cocos Gram positivos
3- MAYO 7. El soma o cuerpo de los hongos
17- MAYO 8. Agentes antimicrobianos
24- MAYO 9. Pruebas de sensibilidad a agentes quimioterapéuticos
31- MAYO 10 Análisis Bacteriológico de leche
Periodo de EXAMEN FINAL TEÓRICO-PRÁCTICO ACUMULATIVO
exámenes

EVALUACION DEL CURSO:

 Aplicación de examen diagnóstico al inicio del curso en la parte teórica, que no tendrá valor
curricular, pero deberán presentarlo todos y cada uno de los estudiantes.

 Para acreditar la materia se tomarán los siguientes rubros son:

Valor Valor
total
TEORÍA
- 4 Evaluaciones 16.8% c/u 67.2%
- Actividades de integración teórica 7.8% 7.8%
LABORATORIO
- 2 Evaluaciones 11.0% c/u 22.0%
- Reportes y Actividades de integración de 3% 3%
laboratorio
TOTAL 100%

* En caso de regresar a clases presenciales, las evaluaciones se harán mediante la

aplicación de exámenes.
** En caso de que el curso de desarrolle en su totalidad en línea, el maestro utilizará el
método de evaluación que considere más adecuado y que indicará a los alumnos el día
de la presentación del programa.

NOTA IMPORTANTE: EL TOTAL DE INASISTENCIAS a la materia incluirá tanto

las de las sesiones teóricas como las de las prácticas. En caso de inasistencias a
una sesión práctica o teórica, se asignarán tantas faltas como horas dure la
sesión, además la justificación deberá hacerse en la primera sesión que el
alumno se incorpore al curso tras su falta. En caso de las sesiones virtuales,
estas se llevarán a cabo en el horario marcado.

LINEAMIENTOS DE TRABAJO DURANTE LAS SESIONES TEÓRICAS Y

PRÁCTICAS DEL CURSO
 Al inicio de la clase el profesor podrá realizar a algunos alumnos elegidos al azar preguntas
relacionadas con el conocimiento aprendido en las clases anteriores. Si el alumno no sabe
contestar adecuadamente, se le considerará como parte de su calificación en las actividades

2
 de integración teórica, o en su caso como parte de calificación en reporte o actividades de
laboratorio.
 No está permitido que los alumnos usen celulares o grabadoras, ni la realización de
grabaciones de audio o video en el salón durante las clases. El uso de tabletas o
computadoras está autorizado únicamente para tomar notas durante las clases.

3
 REGLAMENTO DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA

1. Los alumnos deberán presentarse al laboratorio adecuadamente preparados, habiendo

consultado previamente en su manual la práctica correspondiente. El alumno deberá leer
con detenimiento la técnica a seguir y elaborará un esquema a manera de diagrama con
los pasos a seguir, presentándolo al profesor al inicio de la sección, contará como
participación.
2. Los alumnos deberán usar bata de preferencia blanca y de manga larga para ingresar al
laboratorio.
3. Ser puntuales a la hora de ingreso al laboratorio
4. Seguir los lineamientos señalados por el profesor
5. Está prohibido ingerir alimentos y fumar dentro del laboratorio.
6. Mantener orden dentro del laboratorio.
7. Conservar limpio el laboratorio y las mesas de trabajo.
8. Desechar el material Biológico bajo las normas establecidas por la institución para los
residuos peligrosos Biológicos e infecciosos. (En caso de no saber cómo manejar un
producto Biológico preguntar al personal del laboratorio)
9. Notificar a los técnicos y/o profesor del laboratorio en caso de derrames de materiales
biológicos o reactivos, para que ellos tomen las medidas necesarias para llevar a cabo la
descontaminación.
10. Notificar a los técnicos y/o profesor del laboratorio en caso de daño y/o mal funcionamiento
de algún aparato, encontrado al inicio de su uso o generado durante el mismo.
11. Manejar adecuadamente todo el material y equipo que se utilice en el laboratorio.
12. El material y/o equipo dañado por negligencia tendrá que ser repuesto por el responsable
del daño.
13. Lavarse las manos con agua y jabón al término de la práctica

4
 PRACTICA No 1. USO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

Objetivos:
1. Identificar las partes del microscopio.
2. Manejar adecuadamente el microscopio empleando los objetivos de seco débil y seco fuerte.

Fundamento:
El microscopio, el instrumento más frecuentemente utilizado y el más útil en un laboratorio
de Microbiología, proporciona la amplificación o agrandamiento aparente que nos permite ver
organismos y estructuras invisibles a simple vista.
Las dos categorías de microscopio disponibles son los microscopios ópticos y los
microscopios electrónicos. Difieren en el principio básico en que se funda su amplificación.
Dos técnicas generales son las que se emplean para proporcionar material o muestras
para la observación microscópica. Una es la suspensión de los organismos en un líquido. La
otra utiliza películas o frotis secos fijados y teñidos de la muestra.

Material y reactivos:
1. Microscopio óptico
2. Laminillas portaobjetos y cubreobjetos
3. Frascos con agua estancada
4. Frotis teñidos
5. Gotero

Metodología:
1. Limpiar las lentes con papel seda.
2. Colocar el objetivo seco débil en posición debajo del tubo del cuerpo del microscopio.
3. Colocar la fuente de luz y encender.
4. Colocar en el centro de una laminilla portaobjetos una gota de agua de charco y cúbrala con la
laminilla cubreobjetos.
5. Poner la preparación sobre la plantilla del microscopio y asegurarla con las pinzas.
6. Acomodar la porción de la preparación que se va a examinar en la apertura central de la platina.
7. Bajar el objetivo seco débil con la ayuda del tornillo macrométrico aproximadamente 2 cm por
encima de la preparación.
8. Elevar el condensador y hacer los ajustes necesarios con la palanca del diafragma. Enfocar con el
tornillo micrométrico.
9. Hacer esquemas de lo observado.
10. Para cambiar el objetivo (a seco fuerte). Simplemente gire el revólver. Hacer esquemas de lo
observado.
11. Para usar el objetivo de inmersión, primero debe enfocarse la preparación teñida con el objetivo
seco fuerte, y luego colocar una gota de aceite de inmersión y entonces hacer girar el objetivo de
inmersión que debe tocar el aceite.
12. Al terminar de usarse deben limpiarse los lentes con papel seda, volver al objetivo seco débil,
desconectarse y cubrirse con su funda.

Resultados
Realizar esquemas de lo observado.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1. En el microscopio óptico ¿dónde existen lentes?

2. ¿Cuántos objetivos tiene el microscopio que usted utilizo y cuál es la aplicación de cada uno de
ellos?

5
3. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión cuando se utiliza el objetivo de inmersión?
4. ¿Cuáles son los aumentos obtenidos con el microscopio que uso y como los determino?
5. En un diagrama de un microscopio, indicar cada una de sus parte

6
 PRACTICA No 2. FROTIS Y TINCIONES BÁSICAS
2.1. FROTIS Y TINCION SIMPLE

Objetivos:

1. Conocer la importancia del proceso de tinción de microorganismos.

2. Comprender la secuencia metodológica que se deben seguir para la preparación de una
muestra bacteriológica teñida.
3. Realizar la tinción de una muestra bacteriana.

Fundamento:

Las tinciones consisten en preparados acuosos u orgánicos de colorantes o grupos de

colorantes que imparten una variedad de colores a los microorganismos, tejidos vegetales y
animales y otras sustancias de importancia biológica. Los colorantes pueden usarse como
tinciones directas de materiales biológicos, como indicadores de desviaciones de pH en medios de
cultivo, como indicadores de óxido-reducción para demostrar la presencia o ausencia de
condiciones anaerobias y para demostrar funciones fisiológicas de microorganismos mediante las
técnicas denominadas supravitales.

Materiales y reactivos:

1. Microscopio
2. Portaobjetos
3. Aceite de inmersión
4. Asa bacteriológica
5. Mechero
6. Colorante: Azul de metileno, Cristal violeta o safranina
7. Cultivos bacterianos (Staphylococcus sp y Escherichia coli).

Metodología:

1. Coloque en el centro del portaobjetos una gota pequeña de solución salina.

2. Usando el asa bacteriológica tome una muestra del cultivo bacteriano y dispérsela
perfectamente sobre la gota de solución salina en una área aproximada de 1 cm 2.

Nota : El asa bacteriológica debe ser esterilizada a la flama del mechero antes y después
de tomar la muestra bacteriana, teniendo precaución de enfriarla antes de tomar
la muestra.
3. Deje secar perfectamente la muestra.
4. Fijar la muestra mediante la aplicación de calor, haciendo pasar la preparación en 3 o 4
ocasiones a través de la flama del mechero.
5. Colocar el portaobjetos sobre la bandeja de coloración.
6. Agregar la solución colorante directamente sobre el frotis, dejándola reaccionar de 30
segundos a 1 minuto.
7. Eliminar el exceso de colorante mediante un lavado con agua de la llave teniendo precaución
de no aplicar directamente sobre el frotis.
8. Permitir el secado de la preparación.
9. Observar al microscopio con los objetivos de 40X y 100X.

Resultados
Realizar esquemas de lo observado.

Discusión:

7
Conclusiones:

Cuestionario:

1. ¿Qué tipo de información podemos obtener mediante una tinción simple?

2. ¿Qué ventajas tiene una preparación teñida sobre una preparación en fresco?
3. Investiga el nombre de 3 colorantes usados en la tinción de muestras bacteriológicas
(diferentes a los que se mencionaron en esta práctica).

2.2 TINCION DIFERENCIAL DE GRAM

Objetivos:

1. Realizar correctamente un frotis y teñirlo por el método de Gram.

2. Explicar la utilidad e importancia de la tinción de Gram.

Fundamento

La tinción de Gram, descubierta hace poco más de 100 años por Hans Christian Gram, es
una de las tinciones diferenciales de mayor importancia en los laboratorios de bacteriología. El
cristal violeta (violeta de genciana) sirve como tinción primaria, uniéndose a la pared celular
bacteriana después del tratamiento con una solución débil de yodo, lo cual sirve como mordiente
para la unión del colorante. Algunas especies bacteriana, debido a la naturaleza química de su
pared celular, tienen la capacidad de retener el cristal violeta aún después del tratamiento con un
decolorante orgánico, como la mezcla de partes iguales de alcohol etílico al 95 % y acetona. Las
bacterias que retienen el colorante se ven azul/negro cuando se observan con el microscopio y se
denominan grampositivas. Ciertas bacterias pierden la tinción primaria con cristal violeta cuando
son tratadas con el decolorante, quizá debido al alto contenido lipídico de su pared celular. Estas
bacterias decoloradas captan la contra tinción con safranina y se ven de color rojo cuando se
observan con el microscopio y se denominan gramnegativas.

Material y reactivos:

1. Microscopio
2. Portaobjetos
3. Aceite de inmersión
4. Asa bacteriológica
5. Mechero
6. Reactivos para la coloración de Gram: Cristal violeta, Yodo de Gram, alcohol acetona y
safranina
7. Cultivos bacterianos (Staphylococcus sp y Escherichia coli).

Metodología:

1. Prepare un frotis bacteriano de los cultivos proporcionados de la siguiente manera: cerca de

uno de los extremos del portaobjetos prepare un pequeño frotis de E. coli, en el otro extremo
del portaobjetos prepare otro de Staphylococcus sp.
2. Fijar al calor.
3. Colocar el portaobjetos sobre la bandeja de coloración.
4. Agregar cristal violeta, dejándolo por un minuto.
5. Descartar el exceso de colorante y lavar con agua brevemente y con suavidad.
6. Aplicar el Yodo de Gram, dejándolo reaccionar por un minuto.
7. Descartar el reactivo y lavar con agua.

8
8. Agregar con mucho cuidado, gota a gota, la solución decolorante (alcohol-acetona) hasta que
las gotas de la solución ya no arrastren color.
9. Lavar con agua.
10. Finalmente cubra el portaobjetos con la solución de safranina (colorante de contraste)
dejándola reaccionar de 30 segundos.
11. Lavar con agua.
12. Secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
13. Hacer esquemas de lo observado para cada una de las cepas proporcionadas.

Resultados:
Realizar esquemas de lo observado.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1. ¿Qué es una tinción diferencial?

2. ¿Qué ventajas tiene esta sobre la tinción simple?
3. ¿Por qué en la tinción de Gram se tiñen unas bacterias de color violeta y otras de color rojo?
4. ¿Cuál es el papel del Yodo en la tinción de Gram?
5. ¿Señale en qué casos se prefiere utilizar tinción simple y en cuales tinciones diferenciales?
6. ¿Qué función tiene la safranina en la tinción de Gram?

2.3 TINCION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

Objetivos:
1. Que el alumno comprenda el fundamento de la tinción de Ziehl-Neelsen.
2. Realice la coloración de una muestra usando esta técnica de tinción.
3. Señale la importancia de la tinción de Ziehl-Neelsen

Fundamento:
Esta técnica de tinción es conocida también como “Tinción Ácido Alcohol Resistente” debe su
nombre a la naturaleza ácida del decolorante empleado. Existe un grupo de microorganismos capaces de
retener el colorante primario (Carbolfucshina) debido a que este colorante es más solubles en las
sustancias lipídicas presentes en estos microorganismos que en la solución decolorante. Otra
característica de esta tinción es el empleo de color como agente intensificador de la Carbolfucshina
fenicada.

Materiales y reactivos:
1. Muestra de leche bronca en frasco estéril.
2. Asa bacteriológica
3. Mechero
4. Rejilla para coloración
5. Laminillas portaobjetos
6. Microscopio óptico compuesto
7. Reactivos para la coloración: Carbolfucshina, azul de metileno y alcohol ácido.
8. Preparaciones fijas de Mycobacterium tuberculosis.

Metodología:

9
A) Tinción

1. Prepare un frotis delgado de leche y fíjelo al calor.

2. Coloque el frotis en la rejilla de coloración y añada carbolfucshina, cubriendo todo el frotis.
3. Flamee el frotis con el colorante (por la parte de debajo de la laminilla) hasta que comience a
desprender vapores, retire la flama y repita hasta completar 5 minutos. Tenga PRECAUCION de que
no hierva y también que no se seque. Si esto último ocurre agregué más colorante.
4. Pasados los 5 minutos de vaporización, permita que se enfrié la laminilla y proceda a lavar con agua
de la llave el exceso de colorante.
5. Decolore con alcohol acidulado, gota a gota, hasta que ya no arrastre colorante.
6. Lavar inmediatamente con agua de la llave.
7. Cubrir su frotis con azul de metileno durante 1 minuto.
8. Lavar con agua, secar y observar al microscopio con aceite de inmersión.
9. Determinar si hay organismos ácido-alcohol-resistentes y hacer esquemas.

Resultados

Observar la preparación fija de Mycobacterium tuberculosis y hacer esquema.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1. ¿Cuál es el principio de la coloración de las bacterias ácido-alcohol-resistentes?

2. ¿Por qué se usa azul de metileno en esta técnica de tinción? ¿Podría ser sustituido por otro
colorante? Explique.
3. ¿Qué importancia tendrá realizar la tinción de Ziehl-Neelsen en la leche?
4. ¿Por qué es necesario calentar, cuando el frotis está cubierto con carbolfucshina?

10
 PRACTICA No 3. TINCIONES ESPECIALES
3.1 TINCIÓN NEGATIVA: DEMOSTRACIÓN DE LA CÁPSULA BACTERIANA

Objetivos:

1. Reconozca la presencia de la cápsula en las bacterias.

2. Practique otra técnica de coloración.
3. Discuta la importancia de la cápsula desde el punto de vista médico e industrial .

Fundamento
Algunas bacterias están rodeadas por una sustancias viscosa que forman una cubierta o
envoltura alrededor de la célula. Esta estructura se denomina cápsula o capa mucosa.
No todas las especies bacterianas producen fácilmente cápsulas detectables y el volumen de
ésta, se encuentra notablemente condicionado por el medio donde la bacteria se cultiva.
El tratar de visualizar, la cápsula es un problema algo difícil ya que se compone de material
soluble en agua, además está compuesta de sustancias no iónicas generalmente polisacárido.
Como se sabe, las técnicas de tinción se basan en una interacción química entre componentes
ionizados. De hecho el mejor modo de visualizar las cápsulas, consiste en usar el microscopio de
fase para observar los organismos en un medio que proporcione un fondo adecuado. En los la-
boratorios, donde no se cuenta con este equipo, es posible duplicar los resultados mediante un
método no específico muy simple denominado TINCION NEGATIVA.

Materiales y reactivos:

 Cultivos de 24 horas de Klebsiella pseumoniae o de Aerobacter aerogenes, en caldo glucosa.

 Tinta china o nigrosina
 Cristal violeta
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Mechero
 Microscopio
 Bandeja de coloración

Metodología:

1. Coloque una gota de tinta china en un porta objetos bien limpio y sin grasa, cerca de uno de
los bordes.
2. Coloque una asada del cultivo sobre la tinta china.
3. Mezclar bien con el asa y luego extender la mezcla a lo largo del porta objetos. utilizando la
técnica descrita por su profesor.
4. Dejar secar.
5. Cubrir con Cristal violeta durante 1 minuto, luego enjuagar con cuidado y secar.

Resultados:
Observar el frotis teñido y esquematizar lo observado (La cápsula se aprecia como un halo
alrededor del organismo).

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1. ¿Qué función desempeñan las cápsulas en la infectividad de un microorganismo?

2. ¿Qué problemas a nivel industrial pueden causar bacterias capsuladas?
3. Investiga el nombre de por lo menos 3 bacterias formadoras de cápsula (distintas a las que se

11
 mencionaron en la práctica).

3.2 TINCION DE SHEAFFER-FULTON: DEMOSTRACIÓN DE ENDOESPORA

Objetivos:
1. Conozca otros métodos de tinción empleadas para el estudio anatómico de las bacterias.
2. Demuestre la técnica para la diferenciación de esporas y células vegetativas.
3. Determine la ubicación intracelular de las esporas de ciertos organismos y lo use para
fines taxonómicos.

Fundamento:
Algunas bacterias tienen la facultad de producir cuerpos ovales de pared gruesa, llamada
ENDOESPORAS o más comúnmente conocidos como ESPORAS. La espora bacteriana se
caracterizan por su resistencia a las altas temperaturas, la radiación, la desecación y la
desinfección química; por lo que contribuye a la supervivencia de los microorganismos que las
producen.

Materiales y reactivos:

1. Cultivo de 48 a 72 horas en agar inclinado de Bacillus subtilis

2. Cultivo de 48 a 72 horas en caldo tioglicolato de Clostridium sp.
3. Porta objetos
4. Verde de Malaquita (solución acuosa al 5%)
5. Safranina (solución acuosa al 0.5%). NOTA: ¡no es la misma que la safranina de Gram!
6. Cristal violeta
7. Asa bacteriológica
8. Bandeja de coloración
9. Mechero

Metodología:

A. TINCION SIMPLE

1. Divida el portaobjetos en dos, con un lápiz graso.

2. En cada mitad coloque una asada del respectivo cultivo haciendo un frotis de la manera habitual.
3. Bañe la lámina con cristal violeta dejándolo reaccionar por 3 a 5 minutos.
4. Lave el exceso de colorante con agua.
5. Examínelo con el objetivo de inmersión.
6. Dibuje un campo, muestre las endosporas.

B. METODO DE SCHAEFFER-FULTON

1. Prepare un frotis al igual que en el método A.

2. Báñelo con verde de malaquita, déjelo reaccionar por un minuto.
3. Caliente la preparación hasta que el colorante empiece a emitir vapores, hasta por 5 minutos.
Reponer el colorante evaporado dejar enfriar durante cinco minutos.
4. Lave el frotis con agua durante medio minuto.
5. Agregue solución de safranina al 0.5% y déjela reaccionar por medio minuto.
6. Lave con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersión.
7. Haga dibujos de lo observado. Las esporas son verdes y las Células vegetativas u restos de
células rojas.

Resultados
Observar el frotis teñido y esquematizar lo observado.

Discusión:

12
Conclusiones:

Cuestionario:

1.- Enliste tres organismos, fuera de los proporcionados que formen esporas.
2.- ¿En qué forma las esporas pueden aumentar la infectividad?
3.- ¿Cuál fue el primer microorganismo patógeno que se demostró formador de esporas?
4.- ¿Por qué se calienta la preparación con el colorante verde de malaquita?
5.- ¿Por qué es importante el conocimiento de la presencia de esporas?

13
 PRACTICA No 4. TÉCNICAS DE SIEMBRA Y MEDIOS DE CULTIVO
4.1 TÉCNICAS DE SIEMBRA MICROBIOLÓGICA

Objetivos:

1. Conocer la aplicación de las diversas técnicas de siembra de siembra (picadura, estrías,

agitación, etc.)
2. Realizar la siembra de un microorganismo mediante la aplicación correcta de distintas técnicas
de siembra.
3. Realizar el aislamiento de un microorganismo a partir de un mezcla de ellos.
4. Diferenciar las características coloniales de crecimiento.

Fundamento:
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que
permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones
experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el
laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente
determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este
procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros
microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren
y contaminen los cultivos en estudio.

Materiales y reactivos:

1. Mechero
2. Asa bacteriológica
3. Medios de cultivo:
 Tubo con caldo nutritivo
 Tubo con agar inclinado
 Tubo con agar semisólido
 Caja petri con agar nutritivo
4. Cultivo de bacterias en medio líquido

Metodología:

A) INOCULACION EN CALDOS

1. Coloque frente a usted el mechero bunsen y ponga todo el material a ocupar en posición
adecuada para que se pueda alcanzar sin dificultad y sin peligro de quemarse.
2. Tomar con una mano el tubo que contenga el cultivo y con la otra mano el asa de inoculación,
flamear el asa completamente al rojo vivo.
3. Quitar el tapón del tubo de cultivo, con el dedo meñique de la misma mano con la que se tiene
el asa, teniendo cuidado de no acercar demasiado los tapones al mechero.
4. Flamear los bordes de los tubos (antes y después de insertar el asa de inoculación), tomar una
asada (con el asa previamente enfriada), del cultivo que se desea inocular, flamear los bordes
del tubo y tapar.
5. Tomar el tubo con el caldo nutritivo estéril, quitar tapón, flamear los bordes del tubo e introducir
el asa con el microorganismo a inocular, AGITAR el asa dentro del caldo nutritivo.
6. Retirar el asa de inoculación del tubo, tocando la superficie interna del tubo para eliminar
cualquier exceso de inoculo.
7. Flamear de nuevo los bordes del tubo y volver a colocar el tapón.
8. Flamear de nuevo el asa de inoculación al rojo vivo.
9. Marcar los tubos con los datos correspondientes.
10. Incubar los tubos a 37 °C durante 24 horas.

Resultados: Hacer observaciones y realizar esquemas.

14
B) INOCULACION EN AGAR INCLINADO (Siembra por estrías)

1. Efectuar los pasos preliminares (flamear el asa de inoculación, quitar los tapones y flamear los
bordes de los tubos).
2. Insertar el asa de inoculación (recta) dentro del tubo que contiene el cultivo y tomar una asada
de este.
3. Flamear los bordes del tubo de cultivo y colocar el tapón.
4. Inocular el tubo con agar inclinado, deslizando suavemente el asa de inoculación sobre la
superficie del agar.
5. Esterilizar el asa.
6. Marcar los tubos.
7. Incubar a 37 °C durante 24 horas.

Resultados: Hacer observaciones y realizar esquemas.

C) INOCULACION EN AGAR PROFUNDO (Siembra por picadura)

1. Proceder como en el paso anterior, pero ahora utilizando el asa recta, teniendo cuidado de no
agrandar el área de inoculación, sacando el asa por el mismo sitio de inoculación.
2. Flamear el borde de los tubos y colocar el tapón.
3. Marcar los tubos.
4. Incubar a 37 °C durante 24 horas.

Resultados: Hacer observaciones y realizar esquemas.

D) TECNICA DE ESTRIADA EN PLACA (Dilución por estrías)

1. Siguiendo las condiciones de asepsia, tomar una asada y sembrar la caja con agar nutritivo,
como se indica a continuación.
2. Tomar con la mano izquierda la caja Petri, de manera que la base de la caja repose sobre la
palma de la mano izquierda y la tapa pueda manipularse hacia arriba y abajo con el dedo
pulgar y el dedo medio.
3. Levantar la cubierta de la caja Petri y colocar el inoculo en el borde del agar opuesto a usted.
Hacer estrías cerradas con el inoculo de lado a lado, trazando líneas paralelas que cubran
aproximadamente una cuarta parte de la caja.
4. Bajar la tapa de la caja y flamear el asa de inoculación.
5. Girar la caja de Petri un cuarto de vuelta, eleve la tapa y enfríe el asa de inoculación, tocando
la superficie del conjunto de estrías recién hechas.
6. Tocar dos o tres veces la superficie del conjunto de estrías, con el asa y hacer un nuevo
grupos de estrías (teniendo cuidado de no cruzar las estrías originales).
7. Repetir los pasos 4, 5 y 6.
8. Marcar las cajas e incubar a 37 °C (las cajas invertidas) durante 24 horas.
9. Después de incubar examine las cajas.

Resultados: Hacer dibujos de lo observado, reportando características coloniales de

crecimiento y realizar tinción de Gram a las colonias observadas. Anotar resultados.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1. ¿Por qué se flamean los bordes antes y después de realizar la siembra?

15
 2. ¿Por qué se debe flamear el asa bacteriológica al rojo vivo cada vez que se va a realizar una
siembra?
3. Generalmente a que temperatura deben inocularse los tubos y las cajas inoculadas
4. Explique los fines que se persiguen en cada una de las técnicas de siembra
5. ¿Qué condiciones deben tener los medios de cultivo y el material de laboratorio empleado
para la siembra?
6. ¿Por qué deben evitarse corrientes de aire, reírse, hablar, etc. al efectuar la siembra?

4.2 MEDIOS DE CULTIVOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

Objetivos:

1. Explicar en qué consiste un medio selectivo y medio diferencial.

2. Podrá aplicar el uso de medios selectivos y diferenciales para aislar una bacteria a partir de un
cultivo mixto.

Fundamento:
El conocimiento de los requerimientos nutricionales de los microorganismos tiene una
importante aplicaciones en el laboratorio. En muchas ocasiones se requiere el aislamiento e
identificación de un solo tipo de microorganismo de entre una mezcla de diversos organismos que
componen la flora de ese sustrato. A simple vista parece muy difícil, pero los conocimientos sobre
los requerimientos nutricionales y fisiológicos de una bacteria nos permiten restringir la búsqueda
considerable. El procedimiento usual consiste en usar un medio selectivo y de un medio diferencial.

Materiales y reactivos:

1. Agar Sal Manitol rojo de fenol o agar S110

2. Agar EMB (Eosina azul de metileno)
3. Asa bacteriológica
4. Mechero
5. Cultivos de Staphylococcus sp, Escherichia coli y Salmonella sp.

Metodología:

1. Con un marcador divida en dos secciones, sus cajas petri con los medios de cultivo
señalados (Por la parte posterior de la caja)
2. Con el asa previamente esterilizada y enfriada inocule la mitad de la caja con medio de agar
110 con la cepa de Staphylococcus y la otra mitad con E. coli.
3. Repita la misma operación para la caja con EMB.
4. Incube a 37 C por 24 a 48 horas.

Resultados: Observe el crecimiento de cada cultivo en cada una de las cajas y realice los
esquemas correspondientes.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1.- Qué es un medio de cultivo bacteriano?

2.- El medio de EMB ¿es diferencial o es selectivo?. Explique por qué.
3.- El medio de Agar S110 es selectivo. Explique químicamente sus propiedades para serlo.
4.- ¿El medio agar sal manitol rojo de fenol es diferencial ? ¿Por qué?
5.- Que otros medio selectivos conoce. Enumere cinco.

16
 PRACTICA No 5.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

Objetivos:

1. El alumno será capaz de identificar un microorganismo problema, haciendo uso de tablas que
indican principalmente la acción enzimática sobre los sustratos (pruebas bioquímicas).
2. Conocerá algunos de los medios de cultivo usados para la identificación bacteriana.
3. Explicará el fundamento y uso de las principales pruebas bioquímicas.

Fundamento:
A estas alturas el estudiante deberá tener una idea clara de que existen muchas maneras
de caracterizar a los microorganismos. Por supuesto tal procedimiento requiere de algo de
conocimiento sobre la clasificación de los microorganismos, diferenciación morfológica, modos de
reproducción, ya que para algunos son idénticos o similares. Debido a esto desde hace ya tiempo
que los microbiólogos han visto forzados a emplear una clasificación de tipo “claves” donde para
diferenciar un grupo de organismos de otro se emplean factores bioquímicos observables.
Con las pruebas bioquímicas se estudian un gran número de características metabólicas
como, por ejemplo: asimilación de carbono, nitrógeno, fermentación, cuadros de deficiencia
bioquímica, capacidad para crecer a diferentes presiones osmóticas, licuefacción de la gelatina,
hidrólisis de almidón, formación de esteres, etc. Acciones realizadas por la presencia o ausencia
de enzimas (endoenzimas y exoenzimas) en los microorganismos.
De esta forma las pruebas bioquímicas nos sirven para la identificación de determinado
grupo bacteriano mediante sus reacciones químicas al estar presente en un sustrato y con la
ayuda de indicadores de pH.

Materiales y reactivos:

1. Mechero
2. Asa bacteriológica recta
3. Medios de cultivo para pruebas bioquímicas: MIO, LIA, TSI
4. Cultivo de bacterias puras
5. Reactivo de Kovac

Metodología:

NOTA: Evite al máximo la contaminación de la cepa, ya que de esto depende los resultados que
obtenga. Flamee el asa y los bordes de los tubos antes de la toma de muestra y después de la
inoculación. Además asegúrese de trabajar cerca del mechero.

1. Con una asa estéril recta, se toma una colonia aislada del cultivo. Con esta colonia se trabaja
toda la batería de pruebas bioquímicas.

 El medio MIO (Movilidad-Indol-Ornitina). Es un medio semisólido, se inocula por picadura.

 Medio LIA (lisina-Hierro-Agar). Medio sólido inclinado, se siembra por picadura medio
centímetro antes del fondo y siembra por estría en el pico de flauta (superficie).
 Medio TSI (Triple Azucar-Hierro). Medio sólido inclinado, se siembra por picadura y estría
en la superficie.

2. Incubar los tubos 24 horas a 37 °C. Observar y anotar los resultados.

INTERPRETACIÓN:

17
1. Medio MIO es un medio semisólido y permite observar movilidad, producción de Indol a partir
del triptofano y la descarboxilación del aminoácido Ornitina . Emplea como indicador de pH el
púrpura de bromocresol.

 La descarboxilación de la ornitina. Se produce por la presencia de la enzima ornitina

descarboxilasa, dando como producto final putrecina más dióxido de carbono. Lo que ocasiona
un vire en el pH hacia la alcalinidad (K), desarrollando un tono púrpura más intenso. La
reacción es anaerobia lo que significa que ocurre en el fondo del tubo. Se reporta como
descarboxilación de la ornitina positivo. Cuando no se presenta la enzima, se fermenta la
glucosa como fuente de energía, ocasionando un vire de pH hacia la acidez, se produce un
color amarillo. Descarboxilación de la ornitina negativo.

 Movilidad. Si una bacteria es móvil se observa turbidez a través de todo el medio. Se reporta
como movilidad positiva. Si la bacteria es inmóvil se observa crecimiento únicamente en el
trayecto de la picadura. Se reporta como movilidad negativa.

 La producción de indol. Ocurre tras el desdoblamiento del aminoácido triptofano realizado

por la enzima triptofanasa. El indol es un gas incoloro. Su presencia se denota mediante el
empleo del reactivo de Kovac (p-dimetilaminobenzaldheido) que forma una quinona de color
rojo en la parte superior del medio de cultivo (anillo). Se reporta como indol positivo. Si la
bacteria no presenta la enzima triptofanasa no se desdobla el triptofano, por lo tanto no hay
producción de indol. Al añadir el reactivo de Kovac no existe la formación del anillo rojo, el
color del reactivo permanece amarillo. Se reporta como indol negativo.

2. Medio LIA. Es un medio sólido inclinado. Permite observar la descarboxilación del aminoácido
lisina para formar amina y producir alcalinidad en el medio. Contiene sales de hierro y amonio
para la detección de ácido sulfhídrico y glucosa. Emplea como indicador de pH el púrpura de
bromocresol.

 Descarboxilación de lisina. Ocurre por la enzima lisindescarboxilasa dando origen a la

cadaverina y bióxido de carbono. Produciendo un vire de pH hacia la alcalinidad (K). Esta
reacción es anaerobea (fondo del tubo). Se reporta como descarboxilación de lisina positiva,
fondo alcalino. Si la bacteria no es capaz de descarboxilar la lisina, ocurre una reacción
llamada desaminación, produciendo putrecina y amonio lo que ocasiona lo que ocasiona un
viraje de color de púrpura a rojo-café. Esta reacción es aerobia (superficie del tubo. Se reporta
como descarboxilación de lisina negativa superficie roja (R).

Nota: Si una bacteria descarboxila, no puede desaminar la lisina.

 Fermentación de glucosa. Cuando la bacteria no es capaz de descarboxilar, utiliza la glucosa

como fuente de carbono. Lo que ocasiona un vire de pH hacia la acidez. Esta reacción ocurre
en el fondo del tubo (A). Si puede desaminar (K). Superficie roja/fondo ácido (R/A).
 Producción de ácido sulfhídrico. Este proceso es realizado si la bacteria es capaz de liberar
azufre de aminoácidos u otros compuestos que contienen azufre (por ejemplo tiosulfato),
mediante sistemas enzimáticos. Ocurre un acople del sulfuro (S –2) con un ion Hidrogeno (H+)
para formar H2S, que al unirse al hierro producen sulfuro de hierro insoluble que se observa
como un precipitado negro lo cual es reportado como producción de ácido sulfhídrico positiva.
Si no se observa la producción del precipitado negro se reporta como producción de ácido
sulfhídrico negativo.

Nota: En ocasiones se llega a enmascarar las reacción de descarboxilación, si esto

ocurre la reacción de descarboxilación se considera positiva, reporte como alcalina (K).

3. Medio TSI. En el medio TSI se puede observar la capacidad de atacar (fermentar) hidratos de
carbono (lactosa, sacarosa y glucosa), además se puede denotar la producción de ácido

18
 sulfhídrico y la producción de gas (bacterias aerogénicas). La fermentación de carbohidratos
sigue el ciclo de Krebs desencadenando en la producción de ácido pirúvico y ácido láctico. El
medio contiene tres carbohidratos (glucosa, lactosa y sacarosa), citrato férrico, peptonas,
tiosulfato de sodio y como indicador de pH el rojo de fenol.

 Fermentación de glucosa. Es una reacción anaerobia, por lo tanto ocurre en el fondo del
tubo. Se produce un vire de pH hacia la acidez, cambiando el color de anaranjado a amarillo
claro en el fondo (A). Se reporta como fermentación de la glucosa positivo, fondo ácido (A).
 Fermentación de sacarosa y lactosa. Ocurre en la superficie del tubo, lo que indica que es
una reacción anaerobia. La reacción de fermentación vira el pH del medio hacia la acidez el
medio toma una coloración amarilla en la superficie (A). Se reporta como fermentación de
lactosa y sacarosa positivo, superficie ácida (A).

Notas:
a) Si una bacteria no fermenta glucosa (tampoco puede fermentar lactosa nisacarosa).
b) Algunas bacterias pueden fermentar glucosa sin fermentar lactosa o sacarosa. Lo que
ocasiona que el medio de cultivo se observe amarillo en el fondo (ácido) y rojo en la
superficie (K/A). Se reporta como fermentación de glucosa positiva, lactosa y sacarosa
negativo (K/A).
c) La superficie roja indica utilización de peptonas como fuente de carbonos, el pH es
alcalino(K)

 Producción de gas. Se caracteriza por la formación de burbujas a través del medio o por el
desprendimiento del mismo del fondo del tubo. Ocurre por la presencia de enzimas capaces de
degradar ácido fórmico que deriva del ácido pirúvico durante la fermentación de carbohidratos
produciendo CO2 y H+. Se reporta como gas positivo.

Nota: la presencia de ácido sulfhídrico en el medio TSI ocurre como en el medio LIA, si
enmascara las reacciones de fermentación, se consideran positivas y se reportan como
reacciones ácidas (A).

Resultados: De acuerdo a las reacciones observadas en todos sus medios y con la ayuda de la
tabla anexa reporte el nombre de la bacteria, reacciones observadas en todos los medios.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1. ¿Qué es una prueba bioquímica?

2. ¿Cuál es el fin de realizar pruebas bioquímicas?
3. ¿Qué prueba bioquímica nos sirve para observar la capacidad de una bacteria de
descarboxilar o desaminar un aminoácido?
4. ¿Qué azucares son fermentables en el TSI y que otros datos nos puede proporcionar este
medio?
5. ¿Qué medios nos permiten determinar si una bacteria es capaz de producir ácido sulfhídrico?

Ejemplo de algoritmo para la identificación presuntiva de enterobacterias y especies

relacionadas.a

19
a
En la tabla Salmonella enterididis corresponde a la especie S. enterica con varios serotipos
Salmonella serotipo Enteritidis (S. Enteritidis) y serotipo Typhi (S. Typhy). Nótese que el segundo
nombre se escribe con mayúscula, y no corresponde a nombre científico sino al serotipo.

20
 PRÁCTICA No 6
DETERMINACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS

Objetivo:
1. Aislar e identificar estreptococos y estafilococos de un exudado faríngeo.
2. Conocer la metodología de laboratorio que permite la identificación de estos
microorganismos.

Fundamento:
El exudado está enfocado a la búsqueda de Streptococcus pyogenes y Staphylococcus
aureus. El primero involucrado en patologías tales como artritis, fiebre reumática y
glomerulonefritis, mientras que S. aureus se asocia altamente con problemas de faringitis aguda y
síndrome de choque tóxico.
Los laboratorios deben estar preparados para manejar solicitudes de recuperación e
identificación de especies bacterianas de material faríngeo en caso de enfermedades como
inflamación de la garganta del tipo estreptococico y diftérico, para el descubrimiento de focos de
infección como la escarlatina, fiebre reumática, glomerulonefritis aguda y también en la detección
de portadores de organismos como estreptococos beta hemolíticos del grupo A, estafilococos
coagulasa positivos, bacilos diftéricos y haemophilus.
Se considera flora normal: Estreptococo alfa hemolítico, enterobacterias, Staphylococcus
epidermis, levaduras y Neisseria sp. Entre otros microorganismos. Mientras que como patógenos
potenciales: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Neisseria miningitiditis y
gonoeehoeae, Klepsiella pneumoniae y Candida albicans entre otros microorganismos.
La identificación de especies incluidas en los géneros Streptococcus y Staphylococcus,
resultan relevantes en la medicina veterinaria debido a su relación con distintas patologías tales
como infecciones de vías respiratorias altas e infección de glándulas mamarias (mastitis) en
diversos animales.

Materiales y reactivos:

1. Mechero
2. Hisopo estéril
3. Asa bacteriológica recta
4. Medios de cultivo (Placa de agar sangre y agar sal manitol)
5. Peróxido de hidrogeno (30%)
6. Pruebas demostrativas de optoquina, bacitracina, CAMP y coagulasa

NOTA: En caso de disponer de una muestra de leche de un animal con mastitis la identificación de
cocos gram positivos se realizará adicionalmente en este tipo muestra.

Metodología:

1. Con un hisopo estéril tomar material directamente de la garganta haciendo presión sobre
regiones inflamadas y ulceradas.
2. Con este hisopo inocular las placas de agar sangre y agar manitol-sal.
3. Aislar en los cuatro cuadrantes por el método de estrías.
4. Incubar 24 a 48 hrs. A 37 C. El medio agar sangre incubarlo en la cámara de CO2.
5. Observar la caja agar sangre, buscando colonias beta-hemolíticas con características de
estreptococos y estafilococos. Proceder a efectuar la prueba de catalasa y coagulasa para las
colonias sospechosas de ser estafilococos. Si se confirma se realiza la prueba de la coagulasa,
en caso de sospechar de estreptococos proceder con las siguientes pruebas:

A) Prueba de sensibilidad a la bacitracina:

Inocular un cuadrante de una placa de agar sangre con las colonias que presente beta
hemolisis, trazando estrías repetidamente sobre la superficie. Colocar un disco de bacitracina en
centro del inoculo e incubar en ambiente de CO2 durante 24 hrs. a 37 C y observar la presencia de

21
una zona de inhibición del desarrollo bacteriano alrededor del disco . De observarse este fenómeno
muy posiblemente se trata de un estreptococo del grupo A de Lancefield (Streptococcus
pyogenes).

B) Prueba de sensibilidad a la optoquina:

Inocular un cuadrante de una placa de agar sangre con las colonias que presente alfa
hemolisis, trazando estrías repetidamente sobre la superficie. Colocar un disco de optoquina en
centro del inoculo e incubar en ambiente de CO2 durante 24 hrs. a 37 C y observar la presencia de
una zona de inhibición del desarrollo bacteriano alrededor del disco (las zonas  14 mm son
positivas). De observarse este fenómeno muy posiblemente se trata de Streptococcus pneumonie.

C) Prueba de CAMP:
1. Se realiza una siembra única de los estreptococos (a ser identificados) perpendicularmente a
una siembra de Staphylococcus aureus productora de - lisina. Las dos líneas de siembra no
deben tocarse.
2. La placa se incuban en atmósfera ambiental.
3. Se considera un resultado positivo la aparición de una zona de lisis aumentada en forma de
cabeza flecha en la unión de las dos líneas de siembra.

D) Determinación de catalasa:
1. Transferir células desde el centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos
de vidrio con una aguja de inoculación.
2. Agregar una o dos gotas de peróxido de hidrogeno al 3%
3. El resultado se considera positivo cuando existe una rápida aparición de burbujas de gas o
efervescencia.

E) Determinación de coagulasa:
i) Coagulasa ligada (Prueba en portaobjetos):

1. Se coloca una gota de solución salina fisiológica sobre un portaobjetos de vidrios.

2. Con cuidado se emulsifica una suspensión del microorganismo a estudiar sobre la gota
usando una asa estéril.
3. Se coloca una gota de plasma al lado de la suspensión bacteriana y se mezclan.
4. Se mueve el portaobjetos hacia atrás y adelante observando la inmediata formación de un
precipitado granular de coágulos blancos para un resultado positivo.

ii) Coagulasa libre (Prueba en tubo)

1. En forma aséptica se colocan 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo.

2. Se agregan 0.5 ml de caldo de cultivo puro de 18 a 24 hrs. del microorganismo en estudio
(Infusión cerebro corazón).
3. Se mezcla con suavidad rotando el tubo, con la precaución de no revolver o sacudir la muestra.
4. Se incuba a 37 C aproximadamente 3 horas, la prueba se considera positiva si cualquier
grado de coagulación aparece en el tubo.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1. ¿Cuál es el objetivo de inocular los cultivos de estreptococos en un frasco con vela encendida?
2. ¿A qué se debe la zona de hemolisis que se observa rodeando a las colonias de
estreptococos?
3. ¿Qué otras pruebas son útiles para identificar: S. pyogenes, S. pneumoniae, S. agalactiae?
4. ¿Qué pruebas son útiles para la identificación de enterococos?

22
23
 PRACTICA No 7
EL SOMA O CUERPO DE LOS HONGOS: ESTRUCTURAS ESPECIALES DEL MICELIO E
HIFAS

OBJETIVOS
1. Que el alumno conozca que es el micelio, hifas cenocíticas, hifas septadas, y los diferentes
tejidos (prosénquima y seudoparénquima) que forman los hongos.
2. Que el alumno observe y dibuje como son los rizoides, estolones, conidióforos, esterigmas,
conidios, esporangióforos, columella, esporangios, esporangiosporas, rizomorfos y
levaduras.

INTRODUCCIÓN
Los hongos verdaderos (Quitridiomicetos, zigomicetos, ascomicetos y basidiomicetos)
pertenecen al Reino Fungi, son organismo eucariota, que se reproducen sexual y asexualmente,
que tienen un cuerpo, generalmente filamentoso, paredes celulares compuestas por quitina y
glucanos, membrana celular con ergosterol. Pueden ser uni o pluricelulares. La unidad estructural
de la mayoría de los hongos es la Hifa, que en conjunto conforman el micelio.

MATERIALES
 Cultivos de Rhizopus stolonifer, Penicillium spp. y Aspergillus spp.
 Cultivo de levadura
 Muestras de escamas de uñas
 Microscopio.
 Mechero.
 Portaobjetos.
 Cubreobjetos.
 Aguja de disección.
 Navaja de afeitar.
 Hidróxido de potasio al 25%.
 Solución de azul de algodón lactofenol.

MÉTODO
1. Para observar los rizoides, estolones, esporangióforos, esporangios y esporangiosporas de
Rhizopus stolonifer puede utilizar el microscopio estereoscópico. Observar estas estructuras
adheridas al cristal de las cajas Petri o en el medio de cultivo. Hacer dibujos de lo que se
observe el microscopio.
2. Para observar estructuras fúngicas con más detalle (al microscopio compuesto) de Rhizopus
stolonifer, Aspergillus spp. y Penicillium spp. Con el auxilio de una aguja de disección,
previamente esterilizada al mechero y en condiciones asépticas, tomar un fragmento del medio
de cultivo con las estructuras del hongo a estudiar, de aproximadamente 3 x 3 x 2 mm,
colocarlo sobre el portaobjetos, agregar una gota de azul de algodón y lactofenol, cubrir con un
cubreobjetos y calentarlo CON CUIDADO como lo indicará el profesor, para permitir que
salgan las burbujas de aire y para aclarar el micelio y las estructuras. Dejar enfriar 30
segundos y luego observarlo al microscopio. Realizar esquemas de lo observado.
3. Para observar las levaduras. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada y en
condiciones asépticas, tomar una muestra de levaduras del cultivo líquido, realizar un frotis en
el portaobjetos (si la levadura procede de un medio de cultivo sólido debe de realizarse el frotis
agregando al portaobjetos una gota de solución salina), fijarlas al calor y teñirlas con cristal
violeta durante un minuto. Enjuague, seque y observe al microscopio compuesto. Realizar
esquemas de lo observado. Observar preparaciones permanentes, en su caso.
4. Para realizar identificación de hongos dermatofitos. Colectar escamas de uñas provenientes de
un paciente con onicomicosis, evitar el uso de cremas y esmaltes de uñas previo al análisis y
no haber recibido tratamiento para la onicomicosis en las 2-3 semanas previas a la toma de la
muestra. Previo a la toma de muestra realizar limpieza y desinfección de la zona con gasa

24
 estéril con alcohol al 70%. Una vez limpia la lámina ungueal, se accederá a la zona para la
toma de muestra (descartar el primer raspado para evitar el riesgo de contaminación). La
muestra lo mas fraccionada posible será recogida en una caja Petri estéril. Aclarar las escamas
de uñas con KOH al 25 %. Para la observación en el microscopio se añadirá una parte de
solución de azul de lactofenol sobre dos partes de la disolución de KOH.

CUESTIONARIO
1. ¿Menciona por lo menos dos especies de hongos incluidos en el género Rhizopus
importantes en la medicina veterinaria?
2. ¿Qué función tienen el KOH en la observación microscópica de hongos provenientes de
muestras de piel, uñas, pezuñas o pelos?

25
 PRACTICA No 8
AGENTES ANTIMICROBIANOS

Objetivo:
1. Conocer la metodología empleada en la evaluación de la efectividad de un agente
antimicrobiano.
2. Observar el efecto de diversos agentes antimicrobianos sobre la viabilidad de microbiana.

Fundamento:
Se conoce como un antimicrobiano a cualquier agente ya sea físico o químico que tenga la
capacidad de interferir con el ciclo vital de un microorganismo. Dentro de los antimicrobianos
físicos encontramos agentes tales como calor, luz ultravioleta, filtración, radiación ionizante, etc.,
con estos agentes se pueden lograr efectos tales como la eliminación de la viabilidad de todos los
microorganismos presentes en la muestra (esterilización) o simplemente reducir la población
microbiana viable (por ejemplo, la pasteurización). Por otro lado, los agentes antimicrobianos
químicos engloban a un grupo muy heterogéneo de sustancias que al igual que los agentes físicos
tiene la capacidad de interferir con la viabilidad y/o crecimiento de los microorganismos. Los
agentes antimicrobianos se clasifican en agentes "microbicidas" y agente "microbioestáticos" de
acuerdo a su efecto sobre el microorganismo.

Materiales y reactivos:

- Cepa bacteriana de E. coli y Bacillus subtilis

- Caldo nutritivo en tubos ajustados a un pH de 3, 5, 7, 9 y 11
- Cajas Petri con agar nutritivo
- Discos de papel filtro estériles de 6 mm de diámetro
- Lámpara de luz ultravioleta
- Pinzas estériles
- Hisopos estériles
- Mechero
- Regla con escala milimétrica
- Soluciones de: Alcohol etílico al 70 %, cloruro de mercurio (o nitrato de plata) 1:1000,
fenol al 3% y 5%, cristal violeta a 1:10 000, 1:50 000 y 1:100 000 y Benzal.
- Alambre de cobre

Metodología:

Efecto de los desinfectantes y colorantes sobre las bacterias:

1. En una caja Petri conteniendo agar nutritivo, inocular y extender uniformemente con un hisopo
estéril la cepa de E. coli.
2. Repetir la operación con la cepa de Bacillus subtilis.
3. Impregnar los discos con las soluciones preparadas de alcohol, cloruro de mercurio, fenol,
benzal y cristal violeta a las diluciones mencionadas.
4. Colocar los discos sobre el medio inoculado tanto en el sembrado con E. coli como con
Bacillus subtilis.
5. Incubar las cajas a 37 oC por 24 a 48 horas.

Resultados: Observe los resultados midiendo el halo de inhibición del crecimiento que rodea a los
discos impregnados con las diferentes sustancias. Registre los resultados en la tabla
correspondiente.

Efecto del pH en el crecimiento de las bacterias.

1. Inocular una asada de E. coli en una serie de cinco tubos con caldo nutritivo a los cuales
previamente se le ha ajustado el pH a 3, 5, 7, 9 y 11.

26
2. Repetir la operación con Bacillus subtilis.
3. Incubar a 37 OC por 24 a 48 horas.
4. Observar la turbidez formada y anotar los resultados.

Efecto de la temperatura en el crecimiento bacteriano.

1. A partir de un tubo con caldo nutritivo previamente inoculado con E. coli, se toma una asada y
se estría en una caja de agar nutritivo (tiempo 0) previamente dividida en 8 segmentos.
2. Coloque el tubo en un vaso de precipitado con agua hirviendo y tomar asadas a los siguientes
tiempos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 minutos, estriando en los siguientes segmentos de la caja de
agar nutritivo en el tiempo respectivo.
3. Repetir el procedimiento anterior con Bacillus subtilis.
4. Incubar a 37 OC por 24 a 48 horas.

Resultados: Observar el índice de crecimiento microbiano. Registre los resultados en la tabla

correspondiente.

Efecto de los metales pesados en el crecimiento bacteriano:

1. Inocular y extender uniformemente sobre la superficie del medio de agar nutritivo, una caja con
E. coli y otra con Bacillus subtilis.
2. Colocar en el centro de la caja un alambre de cobre limpio y desinfectado.
3. Incubar de 24 a 48 horas a 37oC

Resultados: Observar el halo de inhibición formado alrededor del alambre. Registre los resultados
en la tabla correspondiente.

Efecto de la luz ultravioleta.

1. Sobre un papel blanco recorte diferentes figuras: cuadros, círculos, estrellas, etc.
2. Inocular y extender uniformemente sobre la superficie del medio de agar nutritivo dos cajas con
E. coli y otras dos con Bacillus subtilis.
3. Quitar la tapa de la caja petri del cultivo de E. coli, colocar la hoja con la figura recortada y
exponer a la luz ultravioleta por 5 minuto. Realizar el mismo procedimiento con la otra caja
pero exponer durante 10 minutos.
4. Repetir la misma operación con los cultivos de Bacillus subtilis.
5. Tapar las cajas e incubar a 37oC por 24 a 48 horas

Resultados: Observar los efectos sobre el crecimiento bacteriano. Registre los resultados en la
tabla correspondiente.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1. En la práctica realizada ¿Qué efectos tuvo el alcohol sobre el crecimiento de los Gram
positivos y los Gram negativos?
2. ¿Qué efecto causo el cristal violeta sobre los Gram positivos y los Gram negativos a las
diferentes concentraciones?
3. ¿El pH ácido inhibió más el desarrollo ácido que el alcalino ? ¿Por qué?
4. ¿Qué otros metales se usan como antimicrobianos?

27
5. ¿Cuál es el efecto de la luz ultravioleta sobre las bacterias y cuáles son sus limitaciones como
agente antimicrobiano?

TABLAS DE REGISTRO DE RESULTADOS

(Utilice una escala de comparación cuantitativa del 0 al 5, donde 5 es la muestra con mayor
efectividad antimicrobiana)

Efecto de desinfectantes y colorantes:

Cloruro de Cristal violeta

Bacteria Etanol Fenol 3% mercurio 1:10 000 1:50 000 Benzal
70% (1:1000) 1:100 000
E. coli
B. subtilis

Efecto de pH

Bacteria pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11
E. coli
B. subtilis

Efecto de la temperatura

T I E M P O ( minutos)

Bacteria 0 5 10 20 30 40 50 60
E. coli
B. subtilis

Efecto de metales pesados

Bacteria Cobre (-) Cobre (+)

E. coli
B. subtilis

Efecto de luz ultravioleta

Tiempo de exposición

Bacteria 5 10
E. coli
B. subtilis

28
 PRÀCTICA 9
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A AGENTES QUIMIOTERAPEUTICOS.

Objetivos:

1. Efectuar correctamente la técnica de difusión en discos de papel (Bauer y Kirby) para probar la
sensibilidad de las bacterias a agentes quimioterapéuticos.
2. Medición semicuantitativa de la susceptibilidad de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas a los diferentes agentes quimioterapéuticos.

Fundamento:
El papel primario de los laboratorios de microbiología clínica consiste en brindar información
clínica consiste en brindar información con la cual los médicos puedan diagnosticar y tratar
enfermedades infecciosas. La identificación de un microbio que ha sido recuperado de un
espécimen clínico a menudo beneficia al paciente mediante la identificación definitiva de una
enfermedad confusa, ayudando a la selección provisoria del tratamiento quimioterapéutico. Las dos
piezas de información más importantes para un clínico son: Si hay un agente infeccioso presente y
2) qué antimicrobiano brindará tratamiento adecuado.
La susceptibilidad de un microorganismo a los antibióticos y a otros agentes
quimioterapéuticos, puede determinarse bien sea por la técnica de dilución en tubo o por la técnica
de difusión de discos de papel en placa. La ventaja de las pruebas de dilución en tubo es que
brindan mayor información cuantitativa, determinando la menor cantidad de agente
quimioterapéutico requerida para inhibir el crecimiento del organismo in vitro. Esta cantidad se
denomina concentración mínima inhibitoria (MIC).
El método de discos de papel en placa es la técnica más comúnmente utilizada. Esta prueba
se fundamenta en que al colocar un disco impregnado con determinada cantidad de
antimicrobiano, sobre un medio sólido inoculado con bacterias, el antimicrobiano difundirá,
formándose un gradiente de concentración, el cual inhibirá o permitirá el crecimiento de la bacteria.

Materiales y reactivos:

1. Cepas puras de: Staphylococcus sp, E. coli, Proteus vulqaris, Pseudomonas aeruginosa
Klebsiella sp.
2. Pinzas estériles
3. Hisópos estériles.
4. Tubos de ensaye con caldo nutritivo.
5. Cajas Petri con medio de Mueller- Hinton
6. Vernier, regla o plantilla para medir los halos de inhibición.
7. Asa bacteriológica
8. Mechero.
9. Solución estándar 0.5 de MacFarland.

Metodología:

1. Preparar el medio de Mueller-Hinton con un pH final de 7.2 a -7.4 y que el grosor del agar sea
de 4 mm.
2. Preparar una suspensión de la cepa pura a probar en el caldo nutritivo. Esta se compara con la
turbidez del estándar 0.5 de MacFarland que contiene 108 microorganismos por mililitro.
3. Se inocula el medio de Mueller-Hinton utilizando el hisopo estéril el cual se humedece con la
suspensión, se estría en la totalidad del medio.
4. Los discos de papel conteniendo los quimioterapéuticos se colocan en la superficie del agar
inoculado por medio de las pinzas estériles presionando ligeramente.
5. Invertir la caja petri e incubar a 37 0C por 18 horas.
6. Se miden los halos de inhibición del crecimiento bacteriano que rodean a cada uno de los
discos por medio de un Vernier, o con una regla o plantilla diseñada para este propósito.

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 Resultados: Las cepas se clasificarán en Resistentes, intermedias o susceptible de acuerdo a
la tabla de diámetros de referencia que será proporcionada por su profesor.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:
1. De los antimicrobianos usados en esta práctica ¿Cuales son betalactámicos?
2. ¿De los agentes quimioterapéuticos usados en esta práctica ¿Cuáles no son antibióticos?
3. ¿Cuáles antimicrobianos quimioterapéuticos inhiben la síntesis de proteínas?
4. ¿Cuáles quimioterapéuticos pertenecen a los aminoglucósidos?
5. ¿Cuáles inhiben la síntesis de ácido fólico?

30
 PRÁCTICA No 10
ANALISIS BACTERIOLOGICO DE LECHE

Objetivos:
1. Conocer la importancia del análisis bacteriológico de la leche.
2. Desarrollar algunas la metodología que con mayor frecuencia se utilizan en el análisis
bacteriológico de la leche.

Fundamento:
La leche y sus derivados tienen una gran importancia desde el punto de vista de la
alimentación humana. Por esta razón es indispensable que exista un excelente control de calidad en
este producto y sus derivados lácteos. La presencia de microorganismos en la leche es uno de los
principales factores que afectan la calidad de la misma por lo tanto el estudio bacteriológico se hace
indispensable para tener un adecuado control de calidad.
La leche está constituida principalmente de los siguientes componentes: agua , sales
minerales, lactosa, grasas, vitaminas, proteínas (ejem : caseína, albúmina, globulinas) y enzimas.
Las enzimas que podemos llegar a encontrar en una muestra de leche nos indican
algunas condiciones a las que la leche ha sido expuesta. La presencia de fosfatasa nos indica,
que el proceso de pasteurización se llevó acabo a una temperatura menor a la adecuada, mientras
que la ausencia de peroxidasa nos indica que se llevó acabo a temperaturas superiores de 80 0C.
La enzima lipasa provoca la hidrólisis parcial de los ácidos grasos ocasionando con esto olores y
sabores desagradables, esta enzima puede ser fácilmente inactivada mediante un proceso
adecuado de pasteurización. La presencia de la enzima catalasa en grandes cantidades indica que
la leche proviene de vacas enfermas de mastitis (causada por microorganismos). La reductasa no
es una enzima láctea por lo tanto su presencia indica una contaminación microbiana.
En la leche se pueden localizar una gran variedad de microorganismo (a un después de la
pasteurización) los cuales en la mayoría de las veces no son patógenos, pero debido a su
proliferación pueden ocasionar alteraciones en la constitución de la leche, confiriéndole de esta
manera sabores desagradables.
Los géneros que normalmente se encuentran en la leche incluyen entre otros Micrococcus ,
Pseudomonas, Alcalanigenes y Lactobacillus. Dependiendo de las condiciones a que se exponga la
leche se favorecerá el desarrollo de uno u otro tipo de microorganismos. A temperatura bajas se
desarrollan principalmente bacterias fermentadoras responsables del agriamiento, mientras que a
temperaturas más elevadas proliferan bacterias putrefactivas que confieren mal olor.

Existen varios análisis bacteriológicos para determinar la calidad de la leche para consumo
humano o derivados lácteos.

A) Métodos directos:
Examen microscópico (Técnica de Breed, Levowitz, etc)

B) Métodos indirectos:

1. Reducción del azul de metileno: Esta técnica nos permite determinar la densidad microbiana
en una muestra de leche y el método está basado en la reducción (decoloración) del azul de
metileno , que es un indicador del consumo de oxígeno. El consumo de oxigeno esta en
relación del número de microorganismos presentes en una muestra y a su vez con el tiempo de
decoloración.
2. Recuento de colonias en placa. Este método además de indicarnos densidad microbiana nos
permite identificar grupos bacterianos específicos mediante el uso de medios selectivos y
diferenciales. Algunos de los grupos bacterianos que podemos identificar son los siguientes:
a) Recuento de mesófilos aerobios
b) Recuento de termofílicos aerobios
c) Recuento de anaerobios totales
d) Investigación de coliformes
e) Investigación de bacterias enteropatógenas

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f) Investigación de Stafilococcus aureus
g) Cuantificación de esporas

Materiales:

1. Tubos con agar cuenta estandar

2. Tubos con agar rojo violeta bilis
3. Azul de metileno (1:30,000)
4. Tubos con 9 ml de solución salina estéril
5. Cajas Petri estéril
6. Pipeta de 1 ml
7. Mechero
8. Baño María
9. Muestra de leche

Metodología:

REDUCCION DEL AZUL DE METILENO

1. Con una pipeta estéril tomar 10 ml de la muestra de leche por analizar y colocarlos en un tubo
de ensaye estéril.
2. Agregar a éste tubo, 1 ml de la solución de azul de metileno (1:30,000) y mezclar hasta que el
color sea uniforme.
3. Incubar el tubo en un baño de agua a 37 °C durante el tiempo necesario para que se lleve a
cabo la decoloración.
4. Observar cada 20 minutos teniendo cuidado de no agitar.
5. Anotar el tiempo requerido para que se lleve a cabo la decoloración.

Resultados: Clasificar la leche de acuerdo a la tabla que se muestra a continuación

EXCELENTE No se decolora en 8 horas de incubación

MUY BUENA Se decolora en periodo de 5 ½ a 8 horas.

DM= 500, 000 m.o./mL

MEDIANA Se decolora en un periodo de 2 a 5 ½ horas.

DM= 500,000 a 4,000,000 m.o./mL
Se decolora en un periodo de incubación de 20 min a 2 horas.
MALA DM= 4,000,000 a 20,000,000 m.o./mL

PESIMA Se decolora en 20 minutos o menos

DM mayor a 20,000,000 m.o./ mL

DM= Densidad microbiana aproximada

RECUENTO DE COLONIAS EN PLACA

1) RECUENTO DE MESOFILICOS AEROBIOS

1. Agitar la muestra para homogenizar bien la leche.

2. En condiciones asépticas tomar 1 ml de la muestra y transferirla a un tubo de ensaye que
contiene 9 ml de solución salina estéril y homogenice (marcar como dilución 1:10).

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3. Tomar 1 ml de esa solución y transferirlo a otro tubo que contiene 9 ml de solución salina
estéril y homogenice (marcar como dilución 1:100).
4. Repita el mismo procedimiento con otro tubo que contenga 9 ml de solución salina estéril
(marcar como dilución 1:1000).
5. Con otra pipeta estéril tomar 1 ml de la dilución 1:1000 y transferirlo a una caja de Petri estéril.
6. Con la misma pipeta repetir el procedimiento anterior pero ahora con la dilución 1:100 y
finalmente con la dilución 1:10.
7. Marcar cada una de las cajas con las diluciones correspondientes
8. Vaciar en cada caja un tubo de agar cuenta estándar previamente licuado y enfriado a una
temperatura de 45°C.
9. Mezclar el contenido de las cajas girando suavemente en sentido de las manecillas del reloj y
luego en sentido contrario (aproximadamente 5 a 10 veces).
10. Dejar solidificar e incubar las placas invertidas a 37 °C durante 24 horas.

Resultados: Con la ayuda de un cuenta colonias de Quebec contar el número de colonias

de cada una de las placas y calcular el número de bacterias/ml de leche.

2) RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA

Con las mismas diluciones preparadas repetir el mismo procedimiento de siembra, sustituyendo
únicamente el medio de cultivo, empleando ahora medio de cultivo Agar rojo de violeta bilis
Reporte de la misma forma que para mesofílicos.

Resultados: Con la ayuda de un cuenta colonias de Quebec contar el número de colonias

de cada una de las placas y calcular el número de bacterias/ml de leche.

Discusión:

Conclusiones:

Cuestionario:

1. ¿De los análisis realizados en esta práctica cual considera usted el mejor?. Explique.
2. ¿Cómo podría demostrar que la pasteurización de la leche no se efectúo eficientemente?
3. ¿Cuáles son las fuentes de microorganismos patógenos que de manera más común
contaminan la leche (de ejemplos de ellos)?
4. ¿Mencione algunos microorganismos de aplicación en la industria de lácteos, presentes en la
leche?
5. ¿Qué entiende por recuento total de bacterias y que nos indica este?

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BIBLIOGRAFÍA

1. Carter, G. R. con capítulos de William Claus, Yasuko Rikihisa: traducción de Manuel Ramis
Vergés. 1983. Fundamentos de bacteriología y micología veterinaria. Zaragoza,
España: Acribia. Ubicación C3235f Biblioteca central
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Masson. 3ª. Edición. Barcelona, España. 264 paginas. Ubicación 579M2946 Biblioteca central
3. Hirsh D. C., Mac Lachalan J, Walker R. L., Veterinary Microbiology, 2004; Ed. Blackwell
Ubicación 636.08969041 G Biblioteca Posta
4. Quinn P. J., Markey B. K. Veterinary Microbiology and Microbial Disease, 2011. Wiley-Black
Well 2a edición. Inglaterra Ubicación 636.089601 G Biblioteca Posta
5. Songer J. Glenn, 2005. Microbiology Veterinary: Bacterial and fungal agents of animal
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6. Winn, W., Allen, S., Janda, W., Koneman, E., Procop, E., Schrenckenberger, P., Woods, G.
2008. Koneman. Diagnóstico microbiológico. Texto y atlas en color. 6a ed. Ed.
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