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GrelinaO-la aciltransferasa (GOAT) es esencial para la supervivencia

mediada por la hormona del crecimiento de ratones con restricción
calórica
Tong Jin Zhaoun,1, Guosheng Liangun,1, Roberto Lin Lia, Xuefen Xiea, Mark W.Sleemanb, Andrew J. Murphyb, David
M. Valenzuelab, George D. Yancopoulosb, Joseph L. Goldsteinun,2y Michael S. Brownun,2
aDepartamento de Genética Molecular, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, TX 75390; ybProductos farmacéuticos Regeneron, Tarrytown, NY 10510

Contribuido por Joseph L. Goldstein, 22 de febrero de 2010 (enviado para revisión el 28 de enero de 2010)

GrelinaO-la aciltransferasa (GOAT) une el octanoato a la progrelina, que se
procesa en grelina, una hormona peptídica octanoilada que estimula la
liberación de la hormona del crecimiento (GH) de las células hipofisarias. La
eliminación del gen que codifica la grelina o su receptor produce solo fenotipos
leves en ratones. Por lo tanto, la función esencial de la grelina es oscura. Aquí
eliminamos laCabra gen en ratones, eliminando así toda la grelina octanoilada
de la sangre. En dietas normales o altas en grasas,Cabra−/−los ratones crecieron
y mantuvieron los mismos pesos que los compañeros de camada de tipo salvaje
(WT). Cuando se somete a una restricción calórica del 60%, WT yCabra−/−los
ratones perdieron el 30% del peso corporal y el 75% de la grasa corporal en 4
días. En ambas líneas, la glucemia en ayunas disminuyó inicialmente por igual.
Después de 4 días, la glucosa se estabilizó en ratones WT en 58–76 mg/dL. En
Cabra−/−ratones, la glucosa siguió disminuyendo, alcanzando 12-36 mg/dL en el
día 7. En este punto, los ratones WT mostraron actividad física normal, mientras
que Cabra−/−los ratones estaban moribundos. La GH aumentó progresivamente
en ratones WT con restricción calórica y menos enCabra−/−ratones. Infusión de
grelina o glucosa en sangre normalizada con GH enCabra−/−ratones y evitó la
muerte. Por lo tanto, una función esencial de la grelina en ratones es la
elevación de los niveles de GH durante la restricción calórica severa,
preservando así la glucosa en sangre y previniendo la muerte.
| | |
glucosa en sangre grelina hipoglucemia ratones knockout octanoato |
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informe anterior sobreCabra−/−ratones, el único hallazgo positivo fue una
reducción menor de peso cuando se les alimentó con una dieta rica en
octanoato (11). En el estudio actual, probamos el requerimiento de GOAT bajo la
condición opuesta, es decir, bajo condiciones de restricción calórica. Ante una
dieta restringida en calorías en un 60% (40% de la ingesta normal),Cabra−/−los
ratones no pudieron mantener su nivel de azúcar en la sangre. A diferencia de
los ratones WT,Cabra−/−los ratones se volvieron moribundos después de 7 días.
Estos datos revelan una función esencial de la grelina, que quizás explique su
conservación evolutiva, es decir, el mantenimiento de la viabilidad durante los
períodos de hambruna.
Resultados
Figura S1Amuestra la estrategia mediante la cual se utilizó la tecnología
VelociGene para reemplazar la región de codificación deCabracon un
casete que contiene unlacZgen reportero y un gen de resistencia a la
neomicina (neo).El análisis de PCR genómico mostró las bandas predichas
para WT y los alelos interrumpidos deCabra (Figura S1B). El análisis
cuantitativo por RT-PCR del ARNm de la mucosa gástrica mostró una
eliminación de la transcripción GOAT enCabra−/−ratones, mientras que la
cantidad de ARNm que codifica la preprogrelina no se vio afectada (Figura
S1C).
ElCabra−/−los ratones tenían una apariencia normal hasta la edad adulta y

producían un número normal de descendientes. Sus pesos corporales eran

indistinguibles de los controles de compañeros de camada WT cuando se
La hrelina es una hormona peptídica octanoilada de 28 aminoácidos secretada alimentaban con una dieta de comida normal (18% de calorías de grasa) o una
GRAMO
por el estómago. Se identificó a través de su capacidad para estimular la dieta alta en grasas (45% de calorías de grasa) (Fig. 1A).La masa grasa y la masa
liberación de la hormona del crecimiento (GH) de las células pituitarias (1). Los niveles magra, medidas por RMN, fueron idénticas en los animales WT yCabra−/−ratones
plasmáticos de grelina aumentan antes de las comidas, y la inyección de grelina mejora
(Figs. 1ByC).Después de 14 semanas con la dieta alta en grasas, la masa grasa
la ingesta de alimentos en roedores y humanos (2, 3). Estos estudios definen los
aumentó en la misma cantidad en ambas líneas. La ingesta diaria de alimentos
efectos farmacológicos de la grelina. Ha sido mucho más difícil definir los efectos de la
fue la misma en WT yCabra−/−ratones cuando se alimentan ad libitum.
deficiencia de grelina. Cuando se alimentan con una dieta de comida normal, los
ratones manipulados genéticamente que carecen de grelina (4, 5) o su receptor (6, 7)
Las pruebas orales de tolerancia a la glucosa mostraron que losCabra−/−
muestran un patrón de crecimiento normal sin signos de deficiencia de GH. Pueden o
los ratones habían mejorado modestamente la tolerancia a la glucosa (Figura S2A), que
no exhibir una ligera resistencia a la obesidad inducida por dietas ricas en grasas y una
se asoció con un ligero pero significativo aumento de la insulina plasmática en el punto
ligera mejora en la secreción de insulina y la tolerancia a la glucosa en estas
de tiempo de 30 minutos (Figura S2C). En la dieta alta en grasas, la tolerancia a la
circunstancias. Cuando se alimenta con una dieta restringida en calorías al 50%
glucosa empeoró en ambas líneas de ratones, pero elCabra−/−
durante 40 días, Los ratones con grelina y sin receptor de grelina perdieron la misma
los ratones continuaron mostrando niveles de glucosa más bajos que los ratones WT (
cantidad de peso que los ratones de tipo salvaje (WT). Sus niveles de glucosa en sangre
Figura S2B). La reducción de la glucosa en sangre enCabra−/−ratones se acompañó de
en ayunas se redujeron ligeramente en algunos días, pero no en todos (7).
una marcada elevación en los niveles de insulina en plasma, especialmente en el punto
CIENCIAS MÉDICAS

de tiempo de 30 minutos (2 veces) (Figura S2D). Este resultado es consistente con

Las actividades de liberación de GH de la grelina dependen
completamente de la unión de un residuo de octanoato a la serina-3 de la
grelina (8). La grelina es el único péptido conocido que contiene un ácido
graso de ocho carbonos, una modificación que se ha conservado en la
evolución desde el pescado (8). Recientemente, nuestro laboratorio (9) y
otros (10) identificaron una enzima unida a la membrana que transfiere
octanoato de octanoil CoA a serina-3 de grelina, formando un éster de
acilo. Esta enzima se conoce como GOAT, que significa grelina. O-
aciltransferasa.
En un intento por explicar la conservación evolutiva del residuo de
octanoato en la grelina, en los estudios actuales buscamos definir las
consecuencias metabólicas en ratones que carecen de laCabra gen
como resultado de la recombinación homóloga. En el pre-
hallazgos previos en ratones que carecían de grelina (12).
Contribuciones de los autores: investigación diseñada por T.-JZ, GL, JLG y MSB; T.-JZ, GL, RLL y
XX realizaron investigaciones; MWS, AJM, DMV y GDY contribuyeron con nuevos reactivos/
herramientas analíticas; T.-JZ, GL, JLG y MSB analizaron datos; y T.-JZ, GL, JLG y MSB escribieron
el artículo.
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
1TJ.Z. y GL contribuyeron igualmente a este trabajo.
2¿A quién puede dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: joe.goldstein@utsouthwestern.edu o
mike.brown@utsouthwestern.edu.
Este artículo contiene información de apoyo en línea enwww.pnas.org/cgi/content/full/
1002271107/DCSupplemental.

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1002271107 PNAS |20 de abril de 2010 |vol. 107 | No. 16 |7467–7472

 Figura 1.Composición corporal de WT yCabra−/−ratones alimentados con una dieta chow o alta
en grasas. Los machos de camada (4 semanas de edad) fueron alimentados ad libitum con la
dieta chow o la dieta alta en grasas durante el tiempo indicado. (A)Los ratones se pesaron a
intervalos semanales. (ByC)Catorce semanas después de los tratamientos dietéticos, la grasa
total (B) y delgado (C)las masas corporales se midieron por RMN. Cada valor representa la
media±SEM de datos de seis ratones.
Las observaciones anteriores que muestran que los niveles de grelina
aumentan en ayunas (13-15) sugirieron que la grelina podría desempeñar
un papel metabólico durante la restricción calórica. Para probar esta
hipótesis, primero colocamos ratones en jaulas individuales y medimos la
ingesta de alimentos de cada ratón cuando se alimentaba ad libitum. peso
yCabra−/−los ratones consumieron la misma cantidad de comida (WT, 4.4±
0,08 g/día; Cabra−/−, 4.5±0,08 g/día). Luego cambiamos a cada ratón a una
dieta restringida en calorías que contenía solo el 40% de la cantidad diaria
de calorías que el mismo ratón consumía cuando se alimentaba ad libitum.
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Los ratones fueron alimentados a las 6 pm cada día (3 h antes del
comienzo del ciclo de oscuridad). Después de 3 días, WT yCabra−/−los
ratones consumieron toda su comida dentro de 1 h después de la
alimentación, un patrón que continuó durante todo el experimento.
La figura 2 muestra los resultados del estudio de restricción calórica. peso y
Cabra−/−ratones ambos perdidos≈28% de su peso corporal en los primeros 4
días, luego de lo cual ambos grupos se estabilizaron (Fig. 2A).Ambos grupos
perdieron el 75% de su masa grasa, según lo determinado por RMN (Fig. 2B). La
glucemia en ayunas se midió a las 5:30 p. m., 30 min antes de la alimentación
(Fig. 2C).En ambos grupos, la glucosa en sangre en ayunas disminuyó en los
primeros 2 días. En ratones WT, la glucosa en sangre en ayunas se mantuvo
relativamente constante en 54–65 mg/dl hasta el día 7. En marcado contraste, la
glucosa en sangre en ayunas en elCabra−/−los ratones nunca se estabilizaron.
Continuó disminuyendo hasta que alcanzó un nadir de 12 mg/dL el día 7. Esta
disminución ocurrió a pesar de que el Cabra−/−los ratones continuaron
consumiendo sus alimentos tan rápidamente como los ratones WT, y aunque los
pesos corporales de los dos grupos eran iguales. Después de 7 días, los ratones
WT parecían activos y saludables. A diferencia de,Cabra−/−los ratones estaban
letárgicos y casi moribundos. En este punto, ambos grupos de ratones fueron
sacrificados a las 5:30 pm y se obtuvo plasma para mediciones hormonales. La
grelina plasmática se elevó 18 veces en el plasma de ratones WT con restricción
calórica en comparación con ratones WT alimentados ad libitum (Fig. 2D).Como
era de esperar, la grelina no fue detectable en el plasma deCabra−/−ratones que
consumieron cualquiera de las dietas. En la dieta ad libitum, el nivel de des-acil
grelina se elevó 3 veces enCabra−/−ratones en comparación con WT (Fig. 2MI).Los
niveles de desacil grelina aumentaron notablemente en ambos grupos con la
dieta restringida en calorías, y ya no hubo ninguna diferencia entreCabra−/−y
ratones WT. En la dieta ad libitum, los niveles plasmáticos de GH fueron
igualmente bajos enCabra−/−y ratones WT
7468 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1002271107
Figura 2. Comparación de WT yCabra−/−ratones alimentados con la dieta chow ad libitum o
sujeto a una restricción calórica del 60%. Los compañeros de camada machos (8 semanas de
edad) se alojaron en jaulas individuales y se alimentaron ad libitum con la dieta chow o se
sometieron a una restricción calórica del 60% como se describe enMateriales y métodos.Peso
corporal (A)se midió diariamente a las 5:30 pm, y la masa grasa total (B)se midió por RMN cada
2 o 3 días a las 5 de la tarde (C)La glucosa en sangre se midió diariamente con un glucómetro
Bayer a las 5:30 pm (30 min antes de la alimentación). (D–F)los ratones fueron sacrificados a las
5:30 pm (antes de la alimentación) en el séptimo día de restricción calórica y los niveles
plasmáticos de grelina (D),des-acil grelina
(MI),y GH (F)fueron determinados. Cada valor representa la media±SEM de datos de
seis ratones. Los asteriscos (*) indican el nivel de significancia estadística (Estudiantet
prueba) entre el WT yCabra−/−ratones en condiciones de restricción calórica.
* , pag <0,05; **,pag <0,01; ***,pag <0.001.
(1.4±0.4 y 1.3±0,6 ng/mL) (Fig. 2F).En la dieta restringida en calorías, los
niveles de GH aumentaron en ambos grupos, pero los ratones WT
alcanzaron niveles que eran 2 veces más altos queCabra−/−ratones.
La Tabla 1 resume varios parámetros metabólicos que se midieron
a las 5:30 p. descrito arriba. Los niveles de IGF1 en plasma se
redujeron en >90% en ambas líneas de ratones a pesar de las
elevaciones de GH. Los ácidos grasos libres de plasma fueron
extremadamente bajos en WT con restricción de calorías, así como
también enCabra−/−ratones a pesar de la elevación de GH, que se sabe
que eleva los ácidos grasos libres en plasma (16). La última
discordancia es probablemente atribuible al agotamiento severo de la
masa grasa, lo que limita la fuente de ácidos grasos. La deficiencia de
tejido adiposo probablemente también explica la caída del β-
hidroxibutirato plasmático, el producto de la oxidación de ácidos
grasos, que ocurrió en ambas líneas. La insulina plasmática cayó a
niveles que eran casi indetectables en ambas líneas, y el glucagón
plasmático aumentó por≈2 veces enCabra−/−así como ratones WT. Ni
los niveles de corticosterona ni de cortisol en plasma fueron
significativamente diferentes entre ratones WT yCabra−/−ratones
después de la restricción calórica, pero cabe señalar que los niveles
observados son los que normalmente se asocian con el estrés y parte
de esta elevación puede ser causada por el estrés inducido por el
manejo de los animales.
Zhao et al.
 Tabla 1. Respuesta de WT yCabra−/−ratones a la restricción calórica durante 7 días: parámetros metabólicos
Ad libitum alimentado Calorías restringidas

Parámetro peso Cabra−/− peso Cabra−/−

Peso corporal, gramos 23.7±0.6 24.7±1.0 15.9±0.6 16.4±0.5

Masa grasa, % peso corporal 8.4±0.3 8.6±0.2 1.5±0.2 1.5±0.1
Masa magra, % peso corporal 74.2±0.7 73.1±0.7 78.1±0.1 78.6±0.2
Glucosa en sangre, mg/dL 131±4 133±7 54±10 12±1***
Grelina, ng/mL 0.5±0.1 <0.004*** 8.7±0.7 <0.004***
Des-acil grelina, ng/mL Hormona 1.3±0.1 4.0±0.3*** 15.7±1.2 15.6±2.0
de crecimiento, ng/dL 1.3±0.6 1.4±0.4 66±8 34±5**
IGF1, ng/mL 32±3 37±3 3.1±1.5 1.1±0.7
Ácidos grasos libres, mM β- 0.44±0.06 0,46±0.05 0.07±0.02 0.04±0.02
hidroxibutirato, mM 0.25±0.02 0.27±0.04 0.12±0.01 0.10±0.01
insulina, ng/mL 0.38±0.04 0,66±0.09* 0.006±0.005 0.016±0.016
Glucagón, pg/mL 46±7 59±4 83±dieciséis 106±19
Corticosterona, ng/mL 158±62 189±45 225±28 172±23
Cortisol, pg/mL 531±117 556±128 844±71 620±73

Macho de tipo salvaje yCabra−/−compañeros de camada (8 semanas de edad) fueron alimentados con una dieta de comida ad libitum o sujetos a una restricción
calórica del 60% durante 7 días antes del estudio (los mismos animales que se usaron en la Fig. 2). Cada valor representa la media±SEM de datos de seis ratones. Las
concentraciones de glucosa en sangre y los parámetros plasmáticos se determinaron como se describe enMateriales y métodos.Los asteriscos (*) indican el nivel de
significancia estadística (Estudiantetprueba) entre WT yCabra−/−ratones bajo la misma condición de alimentación o restricción calórica.
* , pag <0,05; **,pag <0,01; ***,pag <0.001.

Para determinar si el hígado estaba dando una respuesta
transcripcional adecuada a la restricción calórica, medimos los niveles
de varios ARNm en extractos de hígado (Tabla 2). Todos los cambios
en el WT con restricción calórica yCabra−/−los ratones eran similares
entre sí y consistentes con un estado bajo de insulina/alto de
glucagón. Por lo tanto, el ARNm de SREBP-1c se redujo en un 90 % y
esto se asoció con reducciones en los ARNm que codifican todas las
proteínas lipogénicas medidas, que son objetivos de SREBP-1c. Por
otro lado, dos ARNm gluconeogénicos, PEPCK y glucosa-6-fosfatasa,
estaban elevados, en consonancia con la relación insulina/glucagón
reducida. También consistente con este estado fue el ARNm de
IGFBP-1, que estaba marcadamente elevado en los hígados con
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des-acil grelina se elevaron en la misma medida en WT y Cabra−/−ratones
(Fig. 4CyD).Es importante destacar que la infusión de grelina normalizó el
nivel de GH en elCabra−/−ratones (Fig. 4MI).A pesar de este aumento de
GH, el IGF1 en plasma se mantuvo bajo el día 7 en WT con restricción
calórica yCabra−/−ratones (2.2±0.8 y 2.6±0,9 ng/mL, respectivamente;norte
=6 ratones en cada grupo). Ácidos grasos libres en plasma en
Tabla 2. Cantidades relativas de ARNm en hígados de WT y
Cabra−/−ratones
alimentado ad libitum Calorías restringidas

restricción calórica. El ARNm que codifica IGF1 se redujo a pesar de

ARNm peso Cabra−/− peso Cabra−/−
los niveles elevados de GH en plasma.
La figura 3 muestra un experimento en el que medimos los niveles de glucosa y Vía SREBP
hormonas durante todo el período en el que los animales fueron sometidos a SREBP-1c 1.0 0.85 0.08 0.08
restricción calórica. Nuevamente, los niveles de glucosa en sangre en ratones WT se SREBP-2 1.0 1.07 0.48 0.38
estabilizaron después de 4 días, mientras que enCabra−/−ratones, continuaron lipogénesis
disminuyendo (Fig. 3A).En ratones WT, la grelina plasmática aumentó el segundo día y ATP citrato liasa 1.0 1.32 0.13 0.13
continuó aumentando linealmente durante todo el experimento (Fig. 3B).La ghrelina ACC-1 1.0 1.10 0.50 0.51
no fue detectable en el plasma de losCabra−/−ratones. La des-acil grelina plasmática FAS 1.0 1.33 0.14 0.14
aumentó en ambas cepas de ratón (Fig. 3C).Los niveles de GH en plasma aumentaron SCD-1 1.0 1.25 0.40 0.52
modestamente en ambas cepas de ratones hasta el día 4 (Fig. 3D).Posteriormente, los Gluconeogénesis
niveles aumentaron mucho más rápidamente en ratones WT en un patrón que PEPCK 1.0 1.08 4.46 4.78
coincidió con la estabilización de la glucosa plasmática. En cambio, enCabra−/−En los G6Pasa 1.0 1.05 2.84 3.82
ratones, los niveles de GH aumentaron mucho más lentamente, de modo que para el Otros
día 8 eran solo un tercio de los niveles observados en los ratones WT.Figura S3muestra IGF1 1.0 1.12 0.41 0.38
una prueba de tolerancia a la glucosa realizada en WT yCabra−/−ratones después de 5 IGFBP-1 1.0 0.89 36.7 74.5
IGFBP-3 1.0 1,65 0.76 0,66
CIENCIAS MÉDICAS

días de restricción calórica. Los niveles de glucosa en sangre fueron significativamente

más bajos en losCabra−/−ratones a los 15 y 30 min después de la sonda de glucosa.
Determinar si la administración de grelina evitaría la hipoglucemia enCabra−/−
ratones, usamos una minibomba osmótica para administrar una infusión
continua de grelina o solución salina comenzando 3 días antes del inicio de la
restricción calórica. La infusión de grelina no tuvo efecto en los ratones WT; sus
niveles de glucosa en plasma fueron los mismos que los observados en ratones
WT infundidos con solución salina (Fig. 4A).EnCabra−/−ratones infundidos con
solución salina, se observó la hipoglucemia esperada, mientras que la infusión
de grelina eliminó la hipoglucemia, restaurando los niveles de glucosa en sangre
a los observados en ratones WT (Fig. 4B).Los niveles de hormonas plasmáticas se
midieron a las 5:30 p. m. del día 7. Después de la infusión de grelina, los niveles
plasmáticos de grelina y
WT masculino yCabra−/−compañeros de camada (8 semanas de edad) fueron
alimentados con una dieta de comida ad libitum o sujetos a una restricción
calórica del 60 % durante 7 días y sacrificados a las 5:30 p. PCR como se describe
enMateriales y métodos. Se usó ARNm de gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa como control invariable. Cada valor representa la cantidad de
ARNm en relación con la de los ratones WT alimentados, que se define
arbitrariamente como 1,0. Los cebadores para el análisis de PCR en tiempo real
fueron como se describe enMateriales y métodosexcepto por lo siguiente: IGF1
(NM_010512): 5′-CCACACTGACATGCCCAAGA-3′y 5′-TCCTTTGC-AGCTTCGTTTTCT-3
′;IGFBP-3 (NM_008343): 5′-GAGTGTGGAAAGCCAGGTT-GTC-3′y 5′-
GCATGGAGTGGATGGAACTTG-3′.SREBP, proteína de unión a elementos
reguladores de esteroles; ACC-1, acetil-CoA carboxilasa-1; FAS, ácido graso
sintasa; SCD-1, estearoil-CoA desaturasa-1; PEPCK, fosfoenolpiruvato
carboxilasa; G6Pasa, glucosa-6-fosfatasa.

Zhao et al. PNAS |20 de abril de 2010 |vol. 107 | No. 16 |7469
 Fig. 3.Cambios diferenciales en los niveles de glucosa y GH en sangre en WT y Cabra−/−
ratones sometidos a restricción calórica. WT masculino yCabra−/−compañeros de
camada (8 semanas de edad) fueron sometidos a una restricción calórica del 60% como
se describe en Materiales y métodos .Las concentraciones de glucosa en sangre (A),
grelina plasmática (B),plasma des-acil grelina (C),y GH plasmática (D)se midieron a las
5:30 pm (30 min antes de la alimentación) del día indicado. Cada valor representa la
media±SEM de datos de cinco ratones. Los asteriscos (*) indican el nivel de significancia
estadística (Estudiantetprueba) entre WT yCabra−/−ratones. *,pag < 0,05; **,pag <0,01;
***,pag <0.001.
PESO (0.22±0,04 mM) yCabra−/−(0.23±0,09 mM) los ratones
permanecieron bajos. Niveles plasmáticos de β-hidroxibutirato en WT
(0,34± 0,10 mM) yCabra−/−(0.35±0,13 mM) también permaneció bajo.
Los datos anteriores plantearon la posibilidad de que las calorías
restringidas Cabra−/−los ratones desarrollan hipoglucemia porque su
deficiencia de grelina impide un aumento máximo de la GH plasmática,
Descargado de https://www.pnas.org por 90.77.163.49 el 9 de mayo de 2023 desde la dirección IP 90.77.163.49.
que se sabe que contrarresta la hipoglucemia (16). Para probar esta
hipótesis, utilizamos una minibomba osmótica para administrar una
infusión continua de GH o vehículo en WT con restricción calórica yCabra−/−
ratones. Las infusiones se iniciaron 3 días antes del inicio de la restricción
calórica. En vehículo infundidoCabra−/−ratones, la glucosa en sangre
disminuyó como antes (Fig. 5B).Esta disminución fue prevenida por la
infusión de GH. La infusión de GH no tuvo efecto sobre los niveles de
glucosa en sangre en ratones WT con restricción calórica (Fig. 5A).Después
de la infusión de GH, los niveles plasmáticos de GH aumentaron
significativamente y se elevaron en la misma medida en WT yCabra−/−
ratones (Fig. 5MI).No se observaron cambios significativos en los niveles
plasmáticos de grelina (Fig. 5C) o des-acil grelina (Fig. 5D).Este
experimento se repitió con resultados casi idénticos (Figura S4). Al igual
que con la infusión de grelina, la infusión de GH corrigió la hipoglucemia
enCabra−/−ratones sin elevaciones significativas en IGF1 medido el día 8
(2.2±1.0 y 2.4±1,0 ng/mL en WT yCabra−/−ratones, respectivamente;norte =
5 ratones en cada grupo).
Discusión
Los datos actuales revelan una función esencial de la grelina en ratones, a saber,
el mantenimiento de niveles elevados de GH en plasma durante períodos de
restricción calórica severa, asegurando así suficiente glucosa en sangre para
permitir la supervivencia. La diferencia metabólica entre WT yCabra−/−los ratones
se hicieron evidentes después de 4 días de una restricción calórica severa del
60% (40% del consumo normal de alimentos), momento en el que ambas líneas
de ratones habían perdido≈30% del peso corporal y 75% de la grasa corporal
(fig. 2). A partir de entonces, en cinco experimentos, los ratones WT mantuvieron
la glucosa en sangre en el rango de 58 a 76 mg/dL, que fue suficiente para la
viabilidad (Figs. 2-5 yFigura S4). A diferencia de,Cabra−/−los ratones exhibieron
una caída en la glucosa en sangre a
7470 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1002271107
Figura 4. Comparación de WT con restricción calórica yCabra−/−ratones sometidos
infusión SC continua de solución salina o grelina. Bombas osmóticas Alzet (velocidad de
suministro de 0,25 μL/h) llenas de solución salina o solución salina (●)que contiene 5
mg/ml de grelina (○)se insertaron sc en las regiones interescapulares de machos de
camada WT de 8 semanas de edad yCabra−/−ratones. Tres días después del inicio de la
infusión, ambos grupos de ratones se sometieron a una restricción calórica del 60%
que continuó durante 7 días. (AyB)Los niveles de glucosa en sangre se midieron
diariamente a las 5:30 pm (30 min antes de la alimentación). (C–E)Los ratones fueron
sacrificados a las 5:30 pm del séptimo día de restricción calórica. Los niveles
plasmáticos de grelina (C),des-acil grelina (D),y GH (MI)fueron determinados. Cada
valor representa la media±SEM de datos de 6 ratones. Los asteriscos (*) indican el nivel
de significancia estadística (Estudiantetprueba) entre WT yCabra−/−ratones infundidos
con solución salina o grelina. *,pag <0,05; **,pag <0,01; ***,pag <0.001.
el rango de 12 a 36 mg/dL. Para el día 7-8,Cabra−/−los ratones parecían
moribundos, momento en el cual fueron sacrificados.
Los ratones WT con restricción calórica desarrollaron elevaciones progresivas
en los niveles de grelina en plasma. Para el día 7, la grelina plasmática era de 12
a 18 veces mayor que la observada en ratones alimentados ad libitum (Figs. 2 y
3). Calorías restringidasCabra−/−los ratones no mostraron grelina detectable.
Ambas líneas de ratones exhibieron marcados aumentos en la des-acil grelina
(Figs. 2 y 3). Es importante destacar que, a pesar de su deficiencia de grelina,
Cabra−/−los ratones se volvieron hambrientos como lo indica su ingestión de
todos los alimentos dentro de 1 h del parto. Por lo tanto, la grelina no es
esencial para el hambre durante los períodos de inanición.
A lo largo de nuestro estudio, notamos que la hipoglucemia enCabra−/−
los ratones se observaron solo cuando recolectamos la sangre a las 5:30 p.
m., media hora antes de alimentarlos. Debido a su rápido consumo de
alimentos, los ratones con restricción calórica habían estado sin comida
durante≈22 horas Cuando medimos la glucosa en sangre a las 9 am del día
7 (después de 14 h sin comer), encontramos valores similares en WT y
Cabra−/−ratones (76±6.2 y 65±6,5 mg/dL, respectivamente;norte =10
ratones por grupo). El contenido de glucógeno en hígados de WT y Cabra−/
−los ratones a las 9 am del día 7 fueron similares (17±0.3 y 18±
1,0 μg/mg de tejido; 5 ratones por grupo); 8,5 h más tarde (23,5 h después de la
alimentación), estos valores cayeron a 3,6±0.7 y 2.0±0,6 μg/mg de tejido,
respectivamente (23 ratones por grupo). Además, no encontramos hipoglucemia
enCabra−/−ratones que fueron alimentados con una dieta normal y luego en
ayunas durante 24 h. Estos datos indican que la hipoglucemia enCabra−/−ratones
requiere dos condiciones: (i)restricción calórica severa y prolongada, que
conduce a una pérdida de casi todas las reservas de grasa corporal; y (ii)
privación aguda de alimentos, lo que conduce a una reducción del glucógeno
hepático.
Hipoglucemia enCabra−/−ratones no fue causado por exceso de insulina, o
por deficiencia de glucagón (Tabla 1). Efectivamente, a las 17:30 horas,
Zhao et al.

Figura 5. Comparación de WT con restricción calórica yCabra−/−ratones sometidos
infusión SC continua de vehículo o GH. Bombas osmóticas Alzet (caudal de 0,25 μL/h)
llenas de vehículo (●)o vehículo que contiene 2,5 mg/ml de GH (○) se insertaron sc en
las regiones interescapulares de machos de camada WT de 8 semanas de edad yCabra
−/−ratones. Tres días después del inicio de la infusión, ambos grupos de ratones se
sometieron a una restricción calórica del 60% que continuó durante 8 días. (AyB)Los
niveles de glucosa en sangre se midieron diariamente a las 5:30 pm (30 min antes de la
alimentación). (C–E)Los ratones fueron sacrificados a las 5:30 pm del octavo día de
restricción calórica. Los niveles plasmáticos de grelina (C),des-acil grelina (D),y GH (MI)
fueron determinados. Cada valor representa la media±SEM de datos de cinco ratones.
Los asteriscos (*) indican el nivel de significancia estadística (Estudiantetprueba) entre
WT yCabra−/−ratones infundidos con vehículo o GH. *,pag <0,05; **,pag < 0,01; ***,pag
<0.001.
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la insulina era apenas detectable y el glucagón estaba elevado en el
mismo grado que en los ratones WT. Además, el hígado respondió
normalmente a estas hormonas, al menos a nivel transcripcional,
produciendo mRNA elevados para enzimas gluconeogénicas y mRNA
reducidos para enzimas lipogénicas (Tabla 2). Después de 5 días de
restricción calórica, una prueba oral de tolerancia a la glucosa,
realizada a las 5 p.Cabra−/−ratones en comparación con ratones WT
con restricción calórica. Niveles máximos de glucosa en sangre en
ratones WT promediados≈300 mg/dl. El valor correspondiente en
Cabra−/−ratones fue de 150 mg/dL (pag <0,001). Estos datos plantean
la posibilidad de que Cabra−/−los ratones tienen una tasa elevada de
eliminación de glucosa (Figura S3). los hígados deCabra−/−los ratones
pueden carecer del sustrato para permitir el aumento de la
gluconeogénesis que se requeriría para mantener la glucosa en
sangre frente a una mayor eliminación de glucosa de la sangre. Las
pruebas de esta hipótesis requerirán estudios de producción y
eliminación de glucosa.
Hipoglucemia enCabra−/−ratones se asoció con deficiencia relativa, pero no
absoluta, de GH (Figs. 2-5,Figura S4, y Tabla 1). En ratones WT, los niveles de GH
comenzaron a aumentar dramáticamente en el día 5, coincidiendo con la
estabilización de la glucosa en sangre (Fig. 3D).En Cabra−/−la GH de los ratones
también aumentó con la restricción calórica, pero el aumento se retrasó y no fue
tan pronunciado como en los WT (Fig. 3D).Estos datos indican que otras señales,
además de la grelina, pueden elevar la GH en animales con restricción calórica,
pero estas señales no son lo suficientemente fuertes para producir niveles
máximos de GH y no pueden prevenir la hipoglucemia y la muerte. La infusión
de grelina a través de una minibomba osmótica restauró el nivel de GH en
personas con restricción calórica. Cabra−/−ratones y restauraron la glucosa en
sangre a los mismos niveles observados en WT (Fig. 4). Se confirma la
importancia del déficit de GH
Zhao et al.
cuando administramos GH mediante una minibomba osmótica y
descubrimos que prevenía la hipoglucemia y la muerte enCabra−/−ratones
(Fig. 5 yFigura S4). Cabe señalar que la GH plasmática no se redujo en
Cabra−/−ratones cuando consumieron una dieta chow (Tabla 1). La ghrelina
parece ser necesaria para la secreción de GH solo cuando se exigen niveles
elevados de GH durante la restricción calórica. Este hallazgo explica el
patrón de crecimiento normal deCabra−/−ratones, así como los
previamente informadosGrelina−/−ratones (4, 5, 7).
La GH mantuvo la glucosa en sangre en ratones WT con restricción calórica, a
pesar de que los niveles de IGF1 estaban bajos (Tabla 1). Además, los niveles de
IGF1 no aumentaron significativamente con la infusión de GH ni en WT ni en
Cabra−/−ratones (medido el día 8). Estos datos indican que las acciones de
elevación de la glucosa de la GH ocurren independientemente del IGF1. Este
hallazgo tiene sentido teleológico porque IGF1 reduciría la glucosa, no la
aumentaría.
La visión estándar de la acción de la GH establece que la GH mantiene el
azúcar en la sangre al aumentar la lipólisis en el tejido adiposo, liberando
así ácidos grasos que evitan la utilización de glucosa en el músculo (16).
Parece poco probable que este mecanismo prevalezca en los ratones con
restricción calórica porque tienen muy poco tejido adiposo del que liberar
ácidos grasos. De acuerdo con la reducción en el tejido adiposo, los niveles
de ácidos grasos libres en plasma fueron bajos en WT con restricción
calórica yCabra−/−ratones. Además, no se elevaron significativamente con
la infusión de ghrelina o GH. Después de 7 días de estas infusiones, los
niveles medios de ácidos grasos en alimentos con restricción calórica
Cabra−/−los ratones fueron 0.23±0,08 mM (infusión de grelina) y 0,20± 0,06
mM (infusión de GH).
Aunque la CABRA es esencial para la supervivencia durante los períodos de
hambruna en ratones, la enzima no es esencial para el almacenamiento de energía en
tiempos de abundancia. De este modo,Cabra−/−los ratones aumentaron de peso y
almacenaron grasa normalmente cuando se alimentaron con una dieta rica en grasas
(Fig. 1). Estos hallazgos son, en general, consistentes con observaciones previas en
ratones que carecen de grelina o su receptor (4–7). Por lo tanto, la grelina no debe
considerarse una hormona que mejora la ingesta de alimentos o el almacenamiento de
grasa en épocas de abundancia, sino más bien una que mantiene la glucosa en sangre
durante épocas de hambruna. La hipoglucemia en nuestroCabra−/−
ratones fue mucho más profunda que la observada previamente por Sun et al.
(7) en sus ratones knockout para grelina y receptor de grelina. sol et al.
alimentados con una dieta que contenía el 50 % de las calorías normales en
comparación con la dieta del 40 % utilizada en los estudios actuales.
Observamos que la hipoglucemia enCabra−/−los ratones no ocurrieron hasta que
la grasa corporal total disminuyó por debajo del 2% de la masa corporal. Es
posible que los ratones estudiados por Sun et al. retuvo suficiente masa grasa
para evitar una hipoglucemia severa. A pesar de estas diferencias, la conclusión
de nuestro estudio es similar a la de Sun et al., a saber, que las principales
acciones de la grelina implican el mantenimiento de los niveles de azúcar en
sangre en el estado de desnutrición. Una hipótesis similar fue propuesta por
Cummings et al. (17).
Los hallazgos actuales en ratones con restricción calórica tienen paralelos en
humanos con restricción calórica secundaria a la anorexia nerviosa. Al igual que
los ratones con restricción calórica, los humanos anoréxicos tienen niveles
elevados de ghrelina y GH (18). También tienen niveles reducidos de IGF1 a
pesar de la elevación de la GH en plasma. Es tentador especular que la grelina
elevada en estos humanos es esencial para mantener la GH máxima y, por lo
CIENCIAS MÉDICAS
tanto, mantener la glucosa en sangre, como lo es en los ratones con restricción
calórica.
Materiales y métodos
Ratones.Todos los ratones se alojaron en jaulas de colonias con ciclos de 12 horas de luz/12
horas de oscuridad. El ciclo oscuro comenzaba a las 9:00 o 10:00 pm La dieta Chow consistía en
Teklad Mouse/Rat Diet 7002 de Harlan Teklad Global Diets. Esta dieta contiene 3,0 kcal/g de
energía metabolizable, de las cuales el 18% de las calorías provienen de grasas, el 49% de
carbohidratos y el 33% de proteínas. Todos los experimentos con animales se realizaron con la
aprobación del Comité Asesor de Investigación y Cuidado Institucional de Animales del Centro
Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas.
Parámetros Metabólicos.Los ratones se anestesiaron con isoflurano, después de lo cual se
extrajo sangre del seno retroorbitario y se recogió en recipientes recubiertos con EDTA.
PNAS |20 de abril de 2010 |vol. 107 | No. 16 |7471
 tubos que contenían ácido p-hidroximercuribenzoico (concentración final, 1
mM). El plasma se separó inmediatamente y se almacenó sin tratamiento a -80
°C, excepto las muestras utilizadas para la medición de grelina e IGF1, que se
trataron antes de congelarlas con HCl (concentración final, 0,1 M) y diluyente
MIX (Assaypro), respectivamente. La glucosa, el colesterol y los triglicéridos en
plasma se midieron con el analizador químico Vitros 250 (Ortho Clinical
Diagnostics) del Mouse Metabolic Phenotyping Core de la Universidad de Texas
Southwestern. La grelina octanoilada y la desacil grelina se midieron mediante
kits de inmunoensayo que distinguían ambas formas del péptido (Cat. No.
A05117 y A05118; Cayman Chemical). Los niveles plasmáticos de GH,
corticosterona y cortisol se midieron con kits comerciales de Cayman. Los
niveles plasmáticos de los siguientes compuestos se midieron con kits
comerciales del proveedor indicado: ácidos grasos libres (Wako Chemicals), β-
hidroxibutirato (Pointe Scientific, Inc.), IGF1 (Assaypro) y glucagón (Millipore). El
contenido de glucógeno del hígado se midió con un kit de ensayo de Biovision.
Dieta alta en grasas.Para los estudios de alimentación con alto contenido de grasas, se alimentó a los ratones con
una dieta que contenía un 45 % de calorías provenientes de grasas. La dieta estaba compuesta por 24 g de % de
grasa, 41 g de hidratos de carbono y 24 g de proteína (n.º de cat. D12451; dietas de investigación).
Restricción Calórica e Infusión de Hormonas.Una semana antes del inicio de la restricción
calórica, machos WT de 8 semanas de edad yCabra−/−los compañeros de camada se colocaron
en jaulas individuales y se alimentaron con la dieta de comida ad libitum. Durante esta semana
de aclimatación, se controló la ingesta de alimentos para determinar la cantidad promedio de
alimentos consumidos diariamente por cada ratón. Posteriormente, los ratones se separaron
aleatoriamente en dos grupos. Un grupo continuó recibiendo la dieta Chow ad libitum. El otro
grupo se sometió a una restricción calórica del 60% de forma que cada ratón se alimentó a las
18:00 horas todos los días con una cantidad de alimento equivalente al 40% de la cantidad
diaria consumida por el mismo ratón durante la semana de aclimatación. El peso corporal y la
glucosa en sangre se midieron diariamente a las 5:30 pm antes de la alimentación; La grasa
corporal total se midió cada 2 o 3 días a las 5 pm por RMN (analizador Bruker Minispec mq7.5
RMN). Los ratones fueron sacrificados
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con isoflurano a las 5:30 pm (antes de la alimentación) en el séptimo u octavo día de
restricción calórica para recolectar sangre y varios tejidos para análisis.
Para los estudios de restricción calórica en los que los ratones recibieron una
infusión sc continua de ghrelina recombinante o GH, se insertó una bomba osmótica
Alzet (Cat. No. 1002; DURECT) sc en la región interescapular de cada ratón 3 días antes
del inicio de la restricción calórica. Para los estudios de infusión de grelina, la bomba se
llenó con solución salina o solución salina que contenía 5 mg/mL de grelina
recombinante de rata (Cat. No. RP10781; GenScript). La grelina octanoilada se entregó
a una velocidad de 0,25 μl/h (30 μg/24 h). Para la infusión de GH, la bomba se llenó con
vehículo (bicarbonato de sodio 70 mM a pH 9,5, NaCl 137 mM y albúmina de rata 100
μg/mL) o vehículo que contenía 2,5 mg/mL de GH de rata recombinante (obtenida del
Programa Nacional de Hormonas y Péptidos). del Instituto Nacional de Diabetes y
Enfermedades Digestivas y Renales a través de AF Parlow). La GH se entregó a una
velocidad de 0.
PCR cuantitativa en tiempo real.Se aisló el ARN total y se realizaron mediciones de PCR en
tiempo real en muestras de ARN agrupadas de 4 a 6 ratones en cada grupo usando cebadores
como se describe (9, 19, 20). Todas las reacciones se realizaron por triplicado, donde el rango
medio de variación para todos los valores fue de 0,40.±0,03%. La cantidad relativa de todos los
ARNm se calculó utilizando el ciclo de umbral comparativo (CT) método. Se utilizó ARNm de
ciclofilina o GAPDH como control invariable.
Otros metodos.La información adicional se describe enSI Materiales y Métodos.
EXPRESIONES DE GRATITUD.Agradecemos a Mónica Mendoza, Isis Soto y Richard
Gibson por su invaluable ayuda con los estudios en animales; y Liz Lummus y Robert
Hammer (University of Texas Southwestern Transgenic Core Facility) para inyecciones
de células madre embrionarias. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del
Instituto Nacional de Salud (HL20948), Perot Family Foundation y Moss Heart
Foundation. GL ha recibido un premio de investigación biomédica individual de The
Hartwell Foundation. RLL cuenta con el respaldo del programa de capacitación de
científicos médicos Grant ST32GM08014.
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