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01/2008:20818

2.8.18. DETERMINACIÓN DE AFLATOXINA B1 EN LAS

DROGAS VEGETALES

El texto correspondiente a esta monografía ha sido validado en colaboración con la AEMPS

(Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios).

PRECAUCIÓN: las aflatoxinas son muy tóxicas y cancerígenas. Realizar las

manipulaciones en una campana de extracción siempre que sea posible. Tomar
precauciones particulares, tales como el uso de una caja de manipulación con guantes,
cuando las toxinas estén en forma seca debido a sus propiedades electrostáticas y a la
tendencia a dispersarse en las zonas de trabajo. Procedimientos de descontaminación de
los desechos de laboratorio de las aflatoxinas han sido desarrollados por la Agencia
Internacional de Investigación del Cáncer (IARC).
Las aflatoxinas son micotoxinas naturales producidas principalmente por Aspergillus flavus y
Aspergillus parasiticus. Estos hongos son comunes y ampliamente extendidos en la
naturaleza y se encuentran lo más frecuentemente cuando ciertas semillas se cultivan en
condiciones de estrés tales como la sequía. Los mohos aparecen en el suelo, en los
vegetales en descomposición, en el forraje, y en las semillas que sufren un proceso de
deterioro microbiano, e invaden todo tipo de sustratos orgánicos siempre y cuando se den las
condiciones favorables para su crecimiento. Las condiciones favorables incluyen un alto grado
de humedad y una temperatura elevada. Se producen en la naturaleza al menos 13 tipos
diferentes de aflatoxinas y la mayor parte de ellos se reconocen como altamente tóxicos y
cancerígenos. La aflatoxina B1 se considera la más tóxica. Las drogas vegetales susceptibles
de contaminación por aflatoxinas se analizan por un método validado.
Salvo indicación contraria en la monografía, las drogas vegetales contienen como máximo
2 µg/kg de aflatoxina B1. La autoridad competente puede exigir también el cumplimiento con
un límite de 4 µg/kg para la suma de aflatoxinas B1, B2, G1 y G2.
El método descrito a continuación se cita como ejemplo de un método que ha demostrado ser
adecuado para la raíz de harpagofito, el jengibre y las vainas de senna. Para otras drogas
vegetales, es necesario demostrar su aplicabilidad o utilizar otro método validado.

MÉTODO
Cromatografía de líquidos (2.2.29).
Las aflatoxinas se degradan bajo el efecto de la luz. Realizar la determinación protegida de
la luz del día poniendo una lámina absorbente de la luz UV sobre las ventanas en
combinación con luz tamizada, o cortinas o persianas en combinación con luz artificial (es
aceptable el empleo de tubos fluorescentes). Proteger las disoluciones que contienen
aflatoxinas de la luz del día.
Antes de su uso, enjuagar el material de vidrio con una disolución al 10 por ciento V/V de
ácido sulfúrico R y después enjuagar cuidadosamente con agua destilada R hasta la

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eliminación completa del ácido.

Disolución problema. Utilizar una columna de inmunoafinidad que contenga anticuerpos frente
a la aflatoxina B1, con una capacidad no inferior a 100 ng de aflatoxina B1 y que dé una
recuperación no inferior al 80 por ciento cuando se pasa a través de ella una disolución de
5 ng de aflatoxina B1 en una mezcla de 12,5 mL de metanol R y 87,5 mL de agua R. Dejar
que la columna de inmunoafinidad alcance la temperatura ambiente. A 5,00 g de la droga
pulverizada (500) (2.9.12) añadir 100 mL de una mezcla de 30 volúmenes de agua R y
70 volúmenes de metanol R y extraer utilizando ultrasonidos durante 30 min. Filtrar a través
de un papel de filtro plegado. Pipetear 10,0 mL del filtrado límpido a un matraz cónico de
150 mL. Añadir 70 mL de agua R. Pasar 40 mL a través de la columna de inmunoafinidad a
un caudal de 3 mL/min (sin exceder de 5 mL/min). Lavar la columna con 2 volúmenes, cada
uno de 10 mL, de agua R a un caudal que no exceda de 5 mL/min y secar aplicando un ligero
vacío durante 5-10 s o haciendo pasar aire a través de la columna de inmunoafinidad por
medio de una jeringa durante 10 s. Aplicar 0,5 mL de metanol R a la columna y dejar que
pase a través de ella por gravedad. Recoger el eluato en un matraz aforado de 5 mL.
Después de 1 min, aplicar una 2a porción de 0,5 mL de metanol R. Después de 1 min más,
aplicar una 3a porción de 0,5 mL de metanol R. Recoger la mayor parte del disolvente de
elución utilizado, haciendo pasar aire a presión o aplicando vacío a la columna. Diluir hasta
5 mL con agua R y agitar bien. Si la disolución es límpida se puede utilizar directamente para
análisis. En caso contrario, pasarla a través de un filtro de un solo uso antes de la inyección.
Utilizar un filtro de un solo uso (por ejemplo, un filtro de politetrafluoroetileno de 0,45 µm de
tamaño de poro) que haya demostrado que no causa pérdida de aflatoxina por retención.
Disolución madre primaria de aflatoxina B1. Disolver aflatoxina B1 R en una mezcla de
2 volúmenes de acetonitrilo R y 98 volúmenes de tolueno R para dar una disolución
de 10 µg/mL. Para determinar la concentración exacta de aflatoxina B1 en la disolución
madre, registrar la curva de absorción (2.2.25) entre 330 nm y 370 nm en cubetas de cuarzo.
Calcular la concentración en masa de aflatoxina B1, en microgramos por mililitro, utilizando la
siguiente expresión:

A = absorbancia determinada en el máximo de la curva de absorción;

M = masa molar de la aflatoxina B1 (312 g/mol);
ε = coeficiente de absorción molar de la aflatoxina B1 en la mezcla de tolueno-
acetonitrilo (1930 m2/mol);
l = longitud del recorrido óptico de la cubeta (1 cm).
Disolución madre secundaria de aflatoxina B1 . Preparar una disolución madre secundaria
que contenga 100 ng/mL de aflatoxina B1 diluyendo la disolución madre primaria de
aflatoxina B1 con una mezcla de 2 volúmenes de acetonitrilo R y 98 volúmenes de tolueno R.
Envolver ajustadamente el matraz en una hoja de aluminio y mantenerlo por debajo de 4 °C.
Antes del uso, no retirar la hoja de aluminio hasta que el contenido haya alcanzado la
temperatura ambiente. Si la disolución se tiene que conservar durante un largo periodo de
tiempo (por ejemplo, 1 mes), pesar el matraz y anotar su masa antes y después de cada
utilización de la disolución.
Disoluciones de referencia de aflatoxina B1. Poner los volúmenes de la disolución madre
secundaria de aflatoxina indicados en la Tabla 2.8.18.-1. en matraces aforados separados de
250 mL. Pasar una corriente de nitrógeno a temperatura ambiente durante el tiempo justo
para la evaporación del disolvente. Añadir a cada matraz 75 mL de metanol R, dejar que se
disuelva la aflatoxina B1 y diluir hasta 250 mL con agua R.
Tabla 2.8.18.-1. – Disoluciones de referencia de aflatoxina B1

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Volumen de la disolución
Disolución de referencia
madre secundaria (µl)
Concentración final de la
disolución de referencia
(ng/ml)

1 125 0,05

2 250 0,1

3 500 0,2

4 750 0,3

5 1000 0,4

Curva de calibración. Preparar la curva de calibración utilizando las disoluciones de

referencia 1 a 5 de aflatoxina B1, que cubren un intervalo equivalente a 1-8 µg/kg de
aflatoxina B1 en la droga vegetal. Verificar la linealidad de la curva. Si el contenido de
aflatoxina B1 en la muestra a examinar está fuera del intervalo de calibración, se debe diluir la
disolución problema hasta un contenido en aflatoxina que sea apropiado para la curva de
calibración establecida.
Columna:
— tamaño: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;
— fase estacionaria: gel de sílice octadecilsililada para cromatografía R (5 µm).
Fase móvil:
— fase móvil A (para derivatización post-columna por reacción fotoquímica o por bromuro
de piridinio): acetonitrilo R, metanol R, agua R (2:3:6 V/V/V);
— fase móvil B (para derivatización post-columna con bromo derivado
electroquímicamente): añadir 0,12 g de bromuro de potasio R y 350 µL de ácido nítrico
diluido R1 por litro de fase móvil A.
Caudal: 1 mL/min.
Detección: detector de fluorescencia con un filtro de excitación de 360 nm y un filtro de
emisión con un umbral de corte a 420 nm, o equivalente. Para los detectores regulables los
parámetros recomendados son 365 nm (longitud de onda de excitación) y 435 nm (longitud de
onda de emisión).
Inyección: 500 µL.
Derivatización post-columna con hidrobromuro de perbromuro de piridinio (PBPB):
— bomba exenta de pulsaciones;
— mezclador en T con volumen muerto nulo;
— tubo de reacción de politetrafluoroetileno, l = 0,45 m, Ø = 0,5 mm;
— fase móvil A;
— reactivo de derivatización post-columna: disolver 50 mg de hidrobromuro de perbromuro
de piridinio R en 1000 mL de agua R (conservar protegido de la luz y utilizar antes de
4 días);
— caudal del reactivo de derivatización: 0,4 mL/min.
Derivatización post-columna en reactor fotoquímico (PHRED)
— reactor con una ampolla UV 254 nm de mercurio a baja presión (como mínimo de 8 W);
— plato soporte pulido;
— bobina de reacción: tubería de politetrafluoroetileno formando un enmallado ajustado
alrededor de la ampolla UV, l = 25 m, Ø = 0,25 mm, volumen muerto nominal 1,25 mL;

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— tiempo de exposición: 2 min;

— fase móvil A.
Derivatización post-columna con bromo generado electroquímicamente (KOBRA):
— célula KOBRA: célula electroquímica que genera una forma reactiva de bromo para
derivatización de aflatoxinas, que da como resultado una mejor fluorescencia; es
suministrada por diversos proveedores comerciales;
— Generador de corriente continua de derivación en serie con la célula KOBRA, que
proporciona una corriente constante de aproximadamente 100 µA;
— tubo de reacción de politetrafluoroetileno, l = 0,12 m, Ø = 0,25 mm;
— fase móvil B.
Orden de elución: aflatoxina G2, aflatoxina G1, aflatoxina B2, aflatoxina B1.
Cálculo: calcular la curva de calibración y = ax + b, con la concentración (ng/ml) de
aflatoxina B1 en el eje de las x y la señal (S) en el eje de las y. La concentración (C) de la
aflatoxina B1 en una disolución es igual a .
Calcular el contenido en aflatoxina B1 de la droga vegetal, en nanogramos por gramo,
utilizando la siguiente expresión:

m = masa de la droga vegetal tomada para análisis, en gramos;

V1 = volumen del disolvente utilizado para extracción, en mililitros;
Vi = parte alícuota sometida a purificación por inmunoafinidad, en mililitros;
V2 = volumen final de disolución obtenido después de elución de la columna de
inmunoafinidad y dilución, en mililitros;
C = valor medido de la concentración de aflatoxina B1 en la disolución problema, en
nanogramos por mililitro.
La presencia de aflatoxina B1 puede ser confirmada mediante registro del cromatograma sin
derivatización post-columna, lo que lleva a una gran disminución (más de 10 veces) de la
respuesta debida a la aflatoxina B1.

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