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PRÁCTICA No.

11
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LICOPENO EN ALIMENTOS DE ORÍGEN
VEGETAL

INTRODUCCIÓN

El licopeno es un pigmento origen vegetal, por su carácter extremadamente


hidrofóbico está. Incluido en la familia de los lípidos carotenoides Como se
muestra en la Figura 1, el licopeno en su estructura posee once insaturaciones,
característica que le confiere la propiedad de interactuar y destruir los radicales
libres provenientes del oxígeno, por lo cual se le considera un agente antioxidante
extraordinariamente poderoso.

Como se señala en la Figura 2, el licopeno ocurre en diferentes frutas y verduras


aportando el color rojo característico a los tomates, frutas y otros vegetales.

Además de las plantas, este carotenoide es


sintetizado por algas y microorganismos, pero
los seres humanos son incapaces de
producirlo, por lo que deben incorporarlo en su
dieta. Cada vez en la literatura científica se
publican informes que sugieren que la ingesta
de altos niveles de licopeno se correlaciona
con efectos benéficos a la salud humana,
reduciendo notablemente la incidencia de
patologías cancerosas como la de próstata,
pulmón y tracto digestivo, además minimiza el
riesgo de padecer enfermedades
cardiovasculares, y trastornos oculares relacionados con el envejecimiento como
la degeneración macular y cataratas, además de brindar protección a la piel frente
a los efectos nocivos de la luz ultravioleta.

FUNDAMENTO

El licopeno es un lípido carotenoide altamente lipofílico constituido por 8 unidades


de isopreno, su fórmula química es C40H56 con un peso molecular de 536.9 g/mol,
su estructura química es sencilla y está formada por cuarenta átomos de carbono,
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carece de anillos aromáticos e incluye la presencia de once dobles enlaces


conjugados. Es soluble en solventes orgánicos.

En el año 2002, Fish y colaboradores diseñaron un ensayo cuantitativo que


involucra el uso de volúmenes reducidos de solventes orgánicos, para evaluar el
contenido de licopeno en sandías. En un evento inicial el licopeno es liberado del
tejido vegetal usando solventes orgánicos polares como el etanol y el
hidroxitolueno butilado en acetona, aplicando agitación mecánica para promover el
rompimiento celular. La extracción del pigmento liberado se hace adicionando un
solvente orgánico no polar como el hexano.

El contenido de licopeno en la muestra se determina espectrofotométricamente


usando el método teórico basado en la Ley de Lambert-Beer que gobierna la
relación entre la concentración molar y la absorción de luz (absorbancia), como lo
describe la siguiente ecuación:

Sustituyendo en la ecuación anterior, el valor del coeficiente de extinción molar del


licopeno en hexano equivalente a 17.2 x 104 M-1  cm-1 y el peso molecular de
536.9 g/mol; la realización de las operaciones adecuadas conforme lo describen
Fish y colaboradores y el grupo de trabajo de Raveló Perez; conduce a la
siguiente ecuación final:

Aunque la absorbancia de la muestra de licopeno en hexano se mide a una = 503


nm para minimizar la interferencia de otros carotenoides, el espectro de absorción
generado por una solución de licopeno en hexano exhibe un perfil típico conocido
como “espectro de tres dedos”, exhibiendo máxima absorción de luz a longitudes
de onda de 443 nm, 471 nm y 502 nm, tal como se puede apreciar en la Figura 3.

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COMPETENCIAS DE LA PRÁCTICA

 Efectuar un procedimiento que involucra el uso de bajos volúmenes de


solventes orgánicos para extraer licopeno a partir de vegetales.
 Manejar el espectrofotómetro para medir la absorbancia a distintas
longitudes de onda, para el producto cromóforo extraído y una solución de
licopeno puro.
 Representar mediante una gráfica la relación entre la absorbancia y la
longitud de onda, del compuesto cromóforo obtenido y de una solución de
licopeno puro.
 Comparar el perfil del espectro de absorción de licopeno puro con el perfil
generado por el producto coloreado extraído.
 Discriminar si el compuesto extraído es licopeno o un carotenoide diferente.
 Calcular la concentración de licopeno en la muestra utilizada.

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EL ALUMNO SERÁ COMPETENTE CUANDO

 Maneje adecuadamente el espectrofotómetro y mida la absorbancia de las


distintas soluciones.
 Interprete los espectros de absorción del producto coloreado obtenido y del
licopeno puro
 Determine si el compuesto obtenido es licopeno, mediante la comparación
de sus espectros de absorción y las longitudes precisas de máxima
absorción
 Establezca la concentración de licopeno existente en la muestra analizada.

MATERIAL

1 batidora de inmersión taurus Robot 180


1 matraz Erlenmeyer de 50 mL
Tapones de corcho para matraz Erlenmeyer
1 recipiente de plástico, fondo redondo, 280 mL de capacidad
1 barra magnética de 5 cm x 0.8 cm
1 base magnética
1 espátula
1 recipiente rectangular, tamaño mediano
1 balanza analítica
1 Agitador Vortex multitubos VWR VX2500
3 pipetas graduadas de 5 mL
1 Micropipeta de 5,000 L
Puntillas para micropipeta de 5,000 L
Pipetas Pasteur
Bulbos para pipetas Pasteur
Celdas de vidrio para espectrofotómetro
Espectrofotómetro UV/visible

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REACTIVOS

Hidroxitolueno butilado (BHT) al 0.05% en acetona


Hexano
Alcohol etílico al 95%
Agua bidestilada
Acetona

SOLUCIÓN DE LICOPENO PURO EN HEXANO: colocar en un vidrio de reloj una


cápsula (softgel) de Licopeno marca Vitamin W orld, tomarla con unas pinzas y
cortarla con una navaja. Con una varilla de vidrio, tomar una pequeñísima cantidad
del licopeno y disolverlo en 20 mL de Hexano. La solución mostrará un color
amarillo claro. Guardar esta solución en un frasco oscuro y al momento de la
práctica transferir una porción de la solución a una celda de vidrio para
espectrofotómetro.

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METODOLOGÍA

I.-TRATAMIENTO DE LA MUESTRA.

El procesamiento de las muestras se llevará a cabo bajo condiciones de


iluminación reducida y a una temperatura ambiental de 22.5°C

1. Pesar 100 gramos de muestra (tomate, sandía, toronja).

2. Cortarla en trozos muy pequeños.

3. Depositar los trocitos en un recipiente de plástico con fondo redondo de 280 mL


de capacidad dispuesto en un baño de hielo.

4. Moler la muestra hasta punto de papilla usando una batidora de inmersión


Taurus, Robot 180.

5. Una vez que la muestra se molió adecuadamente, depositar una barra


magnética de 5 cm x 0.8 cm.

6. Cubrir el recipiente con papel aluminio.

7. Llevar todo el sistema a la superficie de una base magnética.

8. Encender la agitación a una velocidad moderada, evitando salpicaduras, de


manera que la muestra se mantenga homogénea durante el proceso de
pesada.

II.-PESADA DE LA MUESTRA.

1. En un matraz Erlenmeyer de 50 mL, pesar 0.6 gramos de la muestra, usando


una balanza analítica.

2. Al finalizar la operación de pesada, envolver el matraz con papel aluminio y


colocarlo en un baño de hielo.

III.-EXTRACCIÓN DE LICOPENO.

Sin retirar el matraz del baño de hielo, realizar las siguientes operaciones:

1. Adicionar al matraz 5 mL de Hidroxitolueno butilado (BHT) al 0.05% p/v en


acetona, con una pipeta graduada de 5 mL.

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2. Luego, añadir 5 mL de alcohol etílico al 95% v/v usando una pipeta graduada de
5 mL.

3. Por último, agregar 10 mL de Hexano usando para ello una micropipeta


Transferpette®S con capacidad de 500-5,000 L acondicionada con sus
puntillas apropiadas.

4. Instalar el baño de hielo con el matraz en un Agitador Vortex multitubos VWR


VX2500.

5.- Encender la agitación correspondiente a una velocidad de 8 y mantenerla por


un período de 15 minutos.

6. Al término de ese lapso, apagar la agitación, retirar el baño de hielo con el


matraz.

7. Añadir 3 mL de agua bidestilada una pipeta graduada de 5 mL.

8. Colocar el sistema de trabajo nuevamente en el Agitador Vortex multitubos


VWR VX2500.

9. Agitar durante un lapso adicional de 5 minutos a la misma velocidad.

10. Después de ese tiempo, apagar la agitación y retirar el baño de hielo con el
matraz.

11. Remover el matraz del baño de hielo y mantenerlo en reposo a temperatura


ambiente durante 5 minutos o más para permitir la separación apropiada de las
fases.

12. Una vez separadas las fases, retirar con una pipeta Pasteur la capa hexánica
superior y depositarla en una celda de vidrio para espectrofotómetro de 1 cm de
diámetro

IV.- MEDICIÓN DE LA ABSORBANCIA DE LA MUESTRA.

1. Encender el espectrofotómetro.

2. Seleccionar la = 503 nm.

3. Depositar hexano en una celda de vidrio para espectrofotómetro de 1 cm de


diámetro

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4. Colocar la celda con hexano en el compartimiento especial del


espectrofotómetro.

5. Realizar el ajuste a 0 de absorbancia.

6. Introducir en el compartimiento del espectrofotómetro, la celda que contiene el


licopeno en hexano y leer la absorbancia, registrar el valor proporcionado por el
aparato.

7. Con ese dato calcular el contenido de licopeno en la muestra.

V.- ELABORACIÓN DEL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DEL LICOPENO


EXTRAIDO.

1. Encender el espectrofotómetro.

2. Seleccionar la = 350 nm.

3. Colocar la celda con hexano en el compartimiento especial del


espectrofotómetro.

4. Realizar el ajuste a 0 de absorbancia.

5. Introducir en el compartimiento del espectrofotómetro, la celda que contiene el


licopeno en hexano y leer la absorbancia, registrar el valor proporcionado por el
aparato.

6. Leer la absorbancia de la solución de licopeno a diferentes longitudes de onda


en un rango de 350 nm a 600 nm, cada 10 nm; realizando el ajuste a 0 de
absorbancia cada ocasión que se seleccione la nueva longitud de onda.

7. Con los datos obtenidos construir el espectro de absorción correspondiente

VI.- ELABORACIÓN DEL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DEL LICOPENO PURO.

1. Introducir en el compartimiento del espectrofotómetro, la celda que contiene el


licopeno puro disuelto en hexano.

2. Leer la absorbancia de la solución de licopeno a diferentes longitudes de onda


en un rango de 350 nm a 600 nm, cada 10 nm; realizando el ajuste a 0 de
absorbancia cada ocasión que se seleccione la nueva longitud de onda.

3. Con los datos obtenidos, construir el espectro de absorción correspondiente.

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