REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

SIMÓN RODRÍGUEZ
NUCLEO MATURÍN
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Facilitadora: Lcda. Carmen Díaz

Participantes:
Silvia Medina C.I.: V-12.537.185
Melissa Carvajal C.I.: V-30.467.001
Sección “A”

Noviembre 2022
 Introducción

La salmonella y la shigella pertenecen a la familia de las enterobacterias (familia Enterobacteriaceae)

son bacterias Gram negativas del orden Enterobacterales que contienen más de 30 géneros y más de 100
especies que pueden tener morfología de cocos o bacilos. Los miembros de este grupo forman parte de la
microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros órganos del ser humano y de otras especies
animales. Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuáticos. Sucumben con
relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido el cloro.

La norma Covenin 1291-88, ha sido concebida para su aplicación general en el campo de la

microbiología de alimentos, en los productos alimenticios destinados al consumo humano y animal para
detectar y determinar la presencia de Salmonella.

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Detección de salmonella y determinación de shigella

MATERIALES Y EQUIPOS

 Licuadora de dos velocidades o velocidad simple con control reostático, que opere a una
velocidad no menor de 8.000 r.p.m., y no mayor de 45.000 r.p.m.
 Homogeneizador mecánico (Stomacher), que opere de 230 r.p.m.; con una capacidad de 400ml.
 Jarra metálica o de vidrio, de 250 ml a 1.000 ml de capacidad, provisto de tapa. Debidamente
esterilizadas.
 Bolsas de polipropileno de paredes delgadas y fondo sellado de 18 cm x 30 cm x 250 g,
debidamente esterilizadas.
 Balanza de 2.000 g de capacidad y apreciación de 0.1g.
 Envases apropiados estériles, para contener las muestras.
 Frascos con capacidad para contener 90, 99 y 450 ml de diluente.
 Instrumentos para preparar las muestras: cuchillos, espátulas, tenedores, pinzas, tijeras,
cucharas y otros, debidamente esterilizados.
 Pipetas graduadas estériles, de 1, 2, 5, 10 y 11 ml.
 Tubos de ensayo estériles de 16 mm x 160 mm, 18 mm x 180 mm, 20 mm x 200 mm u otros
apropiados.
 Autoclave, horizontal o vertical
 Horno de aire caliente de temperatura regulable (entre 160 – 180 °C)
 Refrigerador.
 Baño de agua.
 Termómetro.
 Solución tampón fosfato a pH 7,2 (Solución de Butterfield)
o Fosfato diácido de potasio (𝐾𝐻2 𝑃𝑂4) ……… 34 g
o Agua destilada …………………………..… c.s.p. 1000 ml
 Agua peptonada al 0,1%
o Peptona …………………………………… 1,0 g
o Agua destilada ………………………….… 1000 ml

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PREPARACIÓN DE MUESTRAS

Condiciones generales

 El sitio donde se realizara el análisis microbiológico deberá reunir las condiciones de asepsia
indispensable. El material y equipo a utilizar deben estar convenientemente preparados,
identificados y listos para su uso.
 Cuando se abra el recipiente de las muestras con la muestra debe evitar cualquier tipo de
contaminación.
o Si no se dispone de cabinas especiales, debe abrirse primero los productos que se
supone tienen menor carga microbiana y por último los crudos o desecados, para evitar
la contaminación del área y contaminación cruzada.
 La jarra, latas y otros recipientes deben lavarse y secarse; desinfectar el área de preparación de
la muestra mediante algún agente adecuado con alcohol al 70%, el cual se debe eliminar a la
llama, no se deben flamear aquellos envases que puedan dañarse y/o explotar.
o En caso que se requieran condiciones de asepsia más estrictas, deben utilizarse otros
desinfectantes, tales como alcohol yodado (2% de yodo) y compuestos derivados de
amonio cuaternario. Deben utilizarse cabinas especiales (flujo laminar), si no se dispone
de estas deberán utilizarse áreas desinfectadas y protegidas se las corrientes de aire.
 Cuando el producto este envuelto en cartón, papel, papel de aluminio y cualquier otro material
similar, este deberá limpiarse con un paño o esponja humedecido con algún agente
desinfectante (alcohol al 70%), para eliminar la contaminación superficial y el polvo. Debe
darse una atención especial al área de abertura del empaque o envase.
 Debe tomarse una muestra representativa de la muestra.

Tratamiento de muestras según el estado físico

Muestras solidas

 Se pesan 10, 25 o 50 g ± 0,1 de la muestra en una jarra, frasco apropiado o en bolsas de

polipropileno, estériles, previamente tapados.
 Se añaden 90, 225 o 450 ml de diluente respectivamente (solución tampón fosfato o agua
peptonada al 0,1%)

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  Se homogeneiza por no más de 2 minutos a 8.000 r.p.m., debe esperarse 2 – 3 minutos hasta
que desaparezca la espuma formada. En caso de emplearse un homogeneizador mecánico
(Stomacher), se agita la muestra por un tiempo de 60 segundos.
o En caso de alimentos sólidos, cuya flora microbiana está limitada a la superficie (maní,
nueces, almendras, pasas, aceitunas sin hueso u otros) se pesan 50 g y se agregan 50 ml
de diluente, se agita vigorosamente 50 veces en un ángulo de 45°. Cada ml de la
solución de enjuague será equivalente a 1 g de muestra.
o Cuando se analicen alimentos con alto contenido de grasa (mayor de 20%) o polvos que
formen grasas, puede añadirse al diluente, agentes humectantes tales como tergitol 7
anionico (1% p/v) para facilitar la emulsión.
o Se recomienda tomar siempre que sea posible, la mayor cantidad de muestra (50 g) a fin
de obtener resultados más confiables.

Muestras liquidas

 Se mide con una pipeta de 10 u 11 ml de la muestra y se transfieren a un frasco de disolución

que contenga 90 o 99 ml respectivamente de diluente (tampón fosfato o agua peptonada. En
caso de muestras muy viscosas, estas se deben pesar. En caso de muestras con elevada cantidad
de gas, debe trasvasarse a un recipiente estéril y agitar por rotación durante 15 – 30 minutos
hasta que liberen el gas.

PROCEDIMIENTOS

Disoluciones

 La muestra se agita luego 25 veces, bien sea por un movimiento del brazo en un ángulo de 45°
o por rotación del recipiente en diferentes sentidos.
o La homogenización de la muestra, bien sea solida o liquida en la forma antes descrita,
corresponde a la primera dilución (10−1 )
 A partir de la primera dilución se procede de inmediato a preparar las diluciones necesarias de
la siguiente forma:
o Se mide 1 ml de la disolución 10−1 y se transfiere a un tubo que contenga 9 ml de
diluente o 10 u 11 ml de la disolución 10−1 y se transfiere a un frasco de disolución que
contenga 90 o 99 ml respectivamente de diluente para obtener la disolución 10−2 . Se
5
 agita el tubo o frasco utilizado 25 veces, bien sea por un movimiento del brazo en un
ángulo de 45° o por rotación del recipiente en diferentes sentidos.
o Se repite este procedimiento a fin de obtener las otras disoluciones necesarias para el
análisis (10−3 ), (10−4 ), (10−5 ), etc., o aquellas que según la experiencia necesite el
alimento o microorganismo objeto de análisis.

Agar nutritivo

 Agar verde brillante - rojo fenol

 Agar xilosa-lisina desoxicolato
 Agar desoxicolato-citrato
 Agar Hektoen entérico
 Agar bismuto sulfito
 Agar Kligler
 Agar hierro tres azucares (TSI)
 Agar lisina-hierro (LIA)
 Agar fenilalanina
 Agar Salmonella-Shigella (SS)

Siembra de placas

 Transferir con una pipeta estéril una cantidad conocida de cada disolución de la muestra a una
serie de placas de Petri marcadas previamente con el factor de disolución correspondiente. Para
esta operación es posible emplear tan solo una pipeta si se comienza por la disolución y la
placa de factor más alto (la más diluida). La cantidad a transferir habitualmente es de 0,2 ml.
 Añadir a cada placa un tubo de agar fundido y mezclar el inoculo con el medio mediante
rotación suave de la placa, unas 10 veces hacia la derecha y otras 10 hacia la izquierda.
 Dejar que solidifique el agar completamente e incubar a la temperatura deseada en posición
invertida.

INCUBACIÓN

Incubar las placas, protegidas de la luz, a una temperatura de 35 - 37 °C durante un período de 24 a

48 h o durante más tiempo si es necesario.
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 CONTEO DE COLONIAS

Es un análisis que pretende determinar la presencia o la ausencia de un determinado microorganismo

en una cantidad definida de muestra, sin saber la cantidad. Por lo tanto, el resultado será del tipo:
Presencia/Ausencia, Detectado /No detectado, Positivo/Negativo y siempre irá referido a una cantidad
determinada de muestra: 1g, 25g, 125g… Por ejemplo: No detectado/25g.

Esto significa que se han analizado 25g y que, en estos 25g, no se ha detectado que hubiera ninguna
célula del microorganismo en cuestión.

Si queremos saber si el microorganismo está presente en una cantidad de muestra más grande,
deberemos repetir el análisis con una cantidad mayor de muestra. En cambio, si la cantidad es menor, nos
sirve el mismo resultado, ya que si un microorganismo no se ha detectado en 50g de muestra, tampoco se
habría detectado si hubiéramos pesado una parte de aquellos mismos 50g

Así pues, vemos que un resultado de <10 ufc/g y uno que diga No detectado/g no son equiparables
(aunque, a veces, en la práctica se los considere iguales), ya que uno nos dice que, en 1 gramo de muestra,
puede haber algún microorganismo de los que buscamos pero en un número inferior a 10 y el otro nos
dice que, en 1 gramo de aquella muestra, no se ha detectado la presencia de ningún microorganismo de
los que buscamos.

CUADRO DE LÍMITES PERMITIDOS

Límites microbiológicos máximos permitidos de Salmonella en alimentos

En las explotaciones ganaderas, mataderos y empresas alimentarias, se deben cumplir los criterios
microbiológicos establecidos para la Salmonella en las canales de animales y en los alimentos de mayor
riesgo. Asimismo, los fabricantes de alimentos susceptibles de estar contaminados con Salmonella deben
cumplir las medidas de higiene generales y específicas.

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 Límite Máximo
Fase en la que se aplica Acción en caso de
ALIMENTO Microbiológico
el criterio resultados insatisfactorios
permitido
Mejoras en la higiene del
Canales después de su
Canales bovinas, ovinas, Ausencia en la zona sacrificio, revisión de los
faenado pero antes del
caprinas, porcinas y equinas examinada por canal controles del proceso y del
enfriamiento
origen de los animales
Mejoras en la higiene del
sacrificio y revisión de los
Ausencia en 25 g de
Canales de pollos de carne y Canales tras el controles del proceso, del
una muestra conjunta
pavos enfriamiento origen de los animales y de las
de piel del cuello
medidas de bioseguridad en
las explotaciones de origen
Carne fresca de aves de corral
( ausencia de Salmonella
Ausencia en 25 g
enteritidis y Salmonella
typhimurium)
Carne picada y preparados de
carne destinados a ser Ausencia en 25 g
consumidos crudos
Carne picada y preparados de
carne a base de carne de aves
Ausencia en 25 g
de corral destinados a ser
consumidos cocinados
Productos cárnicos destinados
a ser consumidos crudos,
excluidos los productos en los
que el proceso de fabricación o Ausencia en 25 g
la composición del producto
elimine el riesgo
de Salmonella
Productos cárnicos hechos a
base de carne de aves de
Ausencia en 25 g
corral, destinados a ser
consumidos cocinados
Gelatina y Colágeno Ausencia en 25 g
Quesos, mantequilla y nata a
base de leche cruda o leche
Ausencia en 25 g
sometida a tratamiento térmico
inferior a la pasteurización
Leche en polvo y suero en
Ausencia en 25 g
polvo
Helados, excluidos los
productos en los que el proceso
Ausencia en 25 g
de fabricación o la
composición del producto
8
 Límite Máximo
Fase en la que se aplica Acción en caso de
ALIMENTO Microbiológico
el criterio resultados insatisfactorios
permitido
eliminen el riesgo
de Salmonella
Ovoproductos, excluidos los
productos en los que el proceso
de fabricación o la
Ausencia en 25 g
composición del producto
eliminen el riesgo
de Salmonella
Alimentos listos para el
consumo que contengan
huevos crudos, excluidos los
productos en los que el proceso
Ausencia en 25 g
de fabricación o la
composición del producto
eliminen el riesgo
de Salmonella
Crustáceos y moluscos cocidos Ausencia en 25 g
Moluscos bivalvos vivos y
equinodermos, tunicados y Ausencia en 25 g
gasterópodos vivos
Semillas germinadas listas para
Ausencia en 25 g
el consumo
Frutas y hortalizas troceadas
Ausencia en 25 g
listas para el consumo
Zumos de frutas y hortalizas
no pasteurizados listos para el Ausencia en 25 g
consumo
Preparados deshidratados para
lactantes y alimentos dietéticos
deshidratados destinados a
Ausencia en 25 g
usos médicos especiales para
lactantes menores de seis
meses
Preparados deshidratados de
Ausencia en 25 g
continuación
Carne picada y preparados de
carne a base de especies
distintas a las aves de corral Ausencia en 10 g
destinados a ser consumidos
cocinados
Carne separada
Ausencia en 10 g
mecánicamente

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Límites microbiológicos máximos permitidos de Shigella en alimentos

Actualmente no existen límites microbiológicos específicos establecidos para garantizar la seguridad en

los alimentos susceptibles de ser contaminados con Shigella. No obstante, el criterio microbiológico
aplicable a los productos alimenticios y sus posteriores modificaciones, establece analizar
enterobacteriáceas para la vigilancia habitual, y, en caso de que se manifieste su presencia, pueden
iniciarse controles de agentes patógenos específicos.

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