Procedimientos Generales de Laboratorio, Uso de Equipo, y Consideraciones de Seguridad

Arturo Duarte Ortuño I. Procedimientos de Seguridad
A. Químicos Un número no definido de químicos usados en cualquier laboratorio de biología molecular son peligrosos. Todos los fabricantes de materiales peligrosos son requeridos por ley de surtir al usuario con información pertinente de cualquier peligro asociado con sus químicos. Ésta información es surtida en forma de Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales o MSDS. Ésta información contiene el nombre químico, CAS#, datos de peligro a la salud, incluyendo tratamientos de primeros auxilios, datos físicos, datos de fuego y peligro de explosión, datos de reactividad, procedimientos para derrame o fuga, y cualquier precaución especial necesaria cuando se manipule este químico. Un archivo conteniendo información de MSDS de las sustancias peligrosos debe mantenerse en el laboratorio. Además, la información de MSDS puede ser consultada en el internet. Es extremadamente necesario de hacer uso de esta información previamente al uso de un nuevo químico y sin duda en el caso de cualquier exposición accidental o derrame. El instructor/encargado de laboratorio debe ser notificado inmediatamente en el caso de un accidente que envuelva cualquier reactivo potencialmente peligroso.

Los siguientes productos químicos son particularmente notables:
• Fenol - puede causar quemaduras graves • La acrilamida - neurotoxina potencial • El bromuro de etidio – Cancerígeno
Estas sustancias no son dañinas si se utilizan adecuadamente: use siempre guantes cuando se utilizan productos químicos potencialmente peligrosos y nunca pipeteé con la boca alguno de ellos. Si accidentalmente derrama cualquiera de estos productos químicos en la piel, inmediatamente enjuague el área completamente con agua e informe al instructor. Desechar los residuos en contenedores adecuados.

B. Luz Ultravioleta
La exposición a la luz ultravioleta puede causar irritación ocular aguda. Dado que la retina no puede detectar la luz ultravioleta, puede tener lesiones oculares graves y no se dan cuenta hasta 30 minutos a 24 horas después de la exposición. Por lo tanto, use siempre protección ocular adecuada cuando se utilizan lámparas de rayos ultravioleta.

C. Electricidad
Las tensiones para la electroforesis son suficientes para causar electrocución. Cubrir los embalses de amortiguación durante la electroforesis. Siempre apague la fuente de alimentación y desenchufe los cables antes de quitar un gel.

D.

Limpieza general

Todas las áreas comunes deben estar libres de desorden y de utensilios sucios, equipo de electroforesis, etc. deben ser tratados adecuadamente. Dado que usted tiene sólo una cantidad limitada de espacio para llamarla propia, es a su ventaja de mantener su propia área limpia. Dado que va a utilizar las instalaciones comunes, todas las soluciones y todo lo almacenado en una incubadora, nevera, etc deben estar etiquetados. A fin de limitar la confusión, cada persona debe utilizar sus iniciales o de la denominación única para el etiquetado de otros platos, etc material sin etiqueta en los refrigeradores, incubadoras, o congeladores que pueden ser destruidos. Siempre se marca la parte posterior de las placas con sus iniciales, la fecha y los datos experimentales relevantes, por ejemplo, los números de cepa.

II. Preparación de Soluciones
A. Cálculo de Molar, % y Soluciones "X". 1. Una solución molar es una en la cual 1 litro de solución contiene el número de gramos igual a su peso molecular. Ej. Para preparar 100 ml de una solución 5M NaCl = 58.456 (peso molecular del NaCl) g/mol x 5 moles/litro x 0.1 litros = 29.29 g en 100 ml de solución. 2. Soluciones %. Porcentaje (peso/volumen) = peso (g) en 100 ml de solución; Porcentaje (volumen/volumen) = volumen (ml) en 100 ml de solución. Ej. Para preparar una solución 0.7% de agarosa en buffer TBE, pesar 0.7 de agarosa y llevarla a un volumen de 100 ml con el buffer TBE. 3. Soluciones "X". Muchos buffers de enzimas son preparados como soluciones concentradas, por ejemplo 5X o 10X (cinco o diez veces la concentración de la solución a emplear) y son entonces diluidas de tal manera que la concentración final del buffer en la reacción es 1X. Ej. Para configurar una digestión restrictiva en 25 μ l, uno debería añadir 2.5 μ l de un buffer 10X, los componentes de la reacción, y agua para un volumen final de 25 μ l. B. Preparación de Soluciones de Trabajo de Soluciones Concentradas Existentes . Muchos buffers en biología molecular requieren los mismos componentes pero con frecuencia varían en las concentraciones. Para evitar la necesidad de preparar cada buffer desde cero, es útil preparar varias soluciones concentradas base y diluirlas como sea necesario. Ej. Para preparar 100 ml de buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA), combine 1 ml de una solución 1 M de Tris y 0.2 ml de EDTA 0.5 M y 98.8 ml de agua estéril. Lo siguiente es útil para calcular cantidades de solución existente necesarias: C i x V i = C f x V f , donde C i = concetración inicial, o concentración de la solución existente; V i = volumen inicial, o cantidad de solución existente necesaria; C f = concentración final, o concentración de la solución deseada; V f = volumen final, o volumen de la solución deseada. C. Pasos para la Preparación de Soluciones: Apoyarse en manual de laboratorio de referencia por cualquier instrucción específica en la preparación de una solución en particular y en la etiqueta del envase por cualquier precaución específica en el manejo del químico. Pesar la cantidad deseada de químico(s). Use una balanza analítica si la cantidad es menor a 0.1 g. Coloque el/los químico(s) en un recipiente de tamaño apropiado con una

1M Tris-HCl pH=8. Las puntas de micropipetas y tubos de microfuga deben ser autoclavados antes de su uso. a 121° C por 20 min. 5M NaCl. como el fenol y el cloroformo. y almacenados en un recipiente. Autoclave. can be used to make working stocks by adding autoclaved double-distilled water in a sterile vessel to the appropriate amount of the concentrated solution. Métodos para aislamiento de DNA A. por ejemplo antibióticos. Cuando sean necesitados. El material de plastic tales como pipetas y tubos de cultivo son surtidos con frecuencia estériles. puede ser añadido y las placas pueden entonces ser colocadas. Los medios sólidos para places bacterianas pueden ser preparados de antemano. Para experimentos con RNA. III. transfiera a un cilindro graduado y añada la cantidad de agua destilada requerida para completar el volume final. autoclavados. cheque el pHmetro con soluciones buffer frescas y siga las instrucciones para el uso del pHmetro. Asegúrese que los tubos que esté usando sean resistentes a los químicos usados en su experimento. el agar puede ser derretido en un microondas.g. El medio para cultivos de bacterias debe ser autoclavado el mismo día que sea preparado.0. Cuando los químicos se haya disuelto. El material de vidrio debe enjuagarse con agua destilada y autoclavado o secado a 150| C por 1 hora. D. Algunas soluciones no pueden ser autoclavadas. El material de vidrio y plastic usado para biología molecular debe estar escrupulosamente limpio. Si la solución necesita estar a un pH específico. Concentrated solutions.varilla de agitación. preferiblemente entre una o dos horas. cualquier componente adicional. Guardar a temperatura de almacenamiento y checar si hay contaminación previo al uso tomando el recipient a la altura del ojo y agitandolo suavemente. Prepare todas las soluciones con agua doble destilada.22 μ m o 0. Material de Vidrio y Plástico. Ésas deben ser filtradas a través de un filtro estéril de 0. Aislamiento a gran escala de DNA de doble cadena . Tubos de ensayo sucios. Tubos hechos de polipropileno son turbios y resistentes a varios químicos. Añada menos de la cantidad requerida de agua. Una excepción ocurre cuando se preparan soluciones que contengan agar o agarosa. los tubos de policarbonato o poliestireno son claros y no son resistentes a muchos químicos. Pese el agar o agarosa directamente en el recipiente final. contaminación bacteriana y trazas de detergente pueden inhibir reacciones o degradar ácido nucleico. SDS. por ejemplo. e. el material de vidrio y las soluciones son tratados con dietilpirocabonato para inhibir RNasas las cuales pueden ser resistentes al autoclavavado. de ser posible.45 μ m.

Durante el curso de éste trabajo se realizaron varias modificaciones al protocol anterior. secado. el DNA es resuspendido en buffer RNasa y tratado con RNasa A y T1. Las proteínas solubilizadas en el detergente y las membranas son precipitadas con acetate de sodio. empezando con la inoculación inicial de 3 ml de antibiótico contenido en el medio con el plásmido o cósmido contenido en la colonia bacteriana. El tratamiento de la nucleasa es necesario para remover el RNA por digestion ya que el RNA compite con el DNA para el vínculo con la tierra diatomea. El el supernadante que contiene el DNA es transferido a un nuevo tubo. Recientemente. El DNA es eluído durante incubación a 65° C y el DNA conteniendo supernadante es recolectado después de centrifugación y separación de las partículas de tierra diatomea. El DNA recuperado es medido mediante la toma de lecturas de absorbancia a 260 nanómetros. pero siguiendo la precipitación delDNA por polietilenglicol. Después del tratamiento con RNasa. Sin embargo. el cual es cargado en tubos de polialómero y sujetos a ultracentrifugación de la noche a la mañana. y la bola final de DNA es resuspendida en buffer y ensayada por digestión restrictiva como detectado en electroforesis en gel de agarosa.18) seguido por una ultracentrifugación en equilibrio de gradientes de cloruro de cesio-bromuro de etidio (1). Brevemente. El DNA es resuspendido en un buffer conteniendo cloruro de cesio y bromuro de etidio. en contraste el DNA plásmido recombinado. se contaminó con moléculas de DNA cósmido suprimidas. y tratadas con detergente alcalino. El crecimiento celular. Por ejemplo. son visualizados bajo la luz UV de longitud de onda larga y la banda inferior es removida con una jeringa de 5cc. y después a 4 l. el DNA conteniendo supernadadnte es vinculado a la tierra ditomea en un buffer caotrópico de hidrocloruro de guanidina por incubación a temperatura del cuarto.El método usado para el aislamiento a gran escala de DNA cósmido y plásmido es una modificación no publicada (16) de un procedimiento de alcalinólisis (17. se observó que el DNA cósmido recombinante aislado del cultivo celular creció bajo estas condiciones. Después de la concentración por precipitación con etanol. y el DNA plásmido o cósmido es precipitado por la adición de polietilenglicol y recolectado por centrifugación. el DNA es ensayado por digestión restrictiva. lavado varias veces con buffer de etanol y acetona. inicialmente los tiempos de crecimiento de las células incluyeron tres incubaciones sucesivas por la noche. . El bromuro de etidio intercalado es separado del DNA cargando la solución en una columna de intercambio de iones en equilibrio. y el lisado es clarificado primero por filtración del precipitado a través de estopilla y después por centrifugación. éstas supresiones son evadidas por la aplicación de cada una de las tres incubaciones sucesivas por ocho horas en lugar de por la noche. un método basado en tierras diatomeas (19-22) fue usado para aislar DNA plásmido o cósmido de un lisado celular. y el incremento del volumen del cultivo de 50 ml. las células que contienen el deseado plásmido o cósmido son cosechadas por centrifugación. incubadas en un buffer de lisozima. equilibradas por el gradient de densidad del cloruro de cesio después la ultracentrifugación. El bromuro de etidio mancha las bandas de DNA plásmido o cósmido. diluido y precipitado con etanol. y clarificado del lisado son pasos son pasos efectuados como se describe arriba. El A260 conteniendo fracciones es combinado. Sin embargo. aunque hay una ligera pérdida de rendimiento acompañado de tiempos reducidos de crecimiento. El DNA asociado a la tierra diatomea es entonces recolectado por centrifugación. lisis. y después resuspendido en buffer.

y 37 g de cloruro de cesio (Var Lac Oid Chemical Co. Para la purificación del gradiente de cloruro de cesio: 7a. Transfiera la muestra a tubos de polialómero para centrífuga de 35 ml. Las placas de células pueden ser congeladas a -70°C en este punto. 8a. 4. y DNA cromosomal colando a travez de una doble capa de estopilla. 5 ml de bromuro de etidio 5 mg/ml. tape bien. Transfiera el cultivo a un matraz Ehrlenmeyer flask conteniendo 50 ml de un medio similar. Resuspenda las placas de células en medio Viejo y transfiera a dos frascos. Disuelva las placas en un combinado total de 32 ml de buffer TE 100:10. proteinas.Protocolo 1. y mezcle cuidadosamente. agite y mezcle. 6. 11a.5 ml del cultivo a cada uno de los 4 litros de mdio similar.. Transfiera el lisado a un frasco de centrifugación de 250 ml. Inc. 3. e incube en un baño de hielo-agua por 30-60 minutos. e incube por unas 8-10 horas adicionales. y decante el medio. e incube por 5min en un baño de hielo-agua. centrifuge a 10. pH 4. remueva las burbujas de aire. Transfiera 12. e incube en un baño de hielo-agua por 1-2 horas. Centrifuge a 60. selle con tapones de goma y asegure adecuadamente. membranas. mezcle gentilmente invirtiendo el frasco algunas veces.000 rpm por 30 minutos a 4° C en el RC5-B usando el rotor GSA. 2.5 ml por cada frasco). e incube por otras 810 horas. Colecte el DNA precipitado por el PEG por centrifugación en frascos de 250 ml a 7000 rpm por 20 minutos a 4°C en el RC5-B usando el rotor GSA. Albergue las células por centrifugación a 7000 rpm por 20 minutos en frascos de 500 ml en el RC5-B usando el rotor GS3. . 9a. 10a. Resuspenda las placas de células en un total de 70 ml de solución GET/Lisozima (35 ml por cada frasco) removiendo gentilmente la placa con una espátula e incubando por 10 minutod a temperatura de almacenamiento.8 (52.000 rpm de 16-20 horas a 15-20°C en el Sorvall OTD-75B ultracentrifuge (DuPont) usando el rotor T-865.) (la concentración final del cloruro de cesio debe ser 1 g/ml). Tome una colonia bacteriana que albergue el DNA plásmido o cósmido de interés y colóquela en un tubo Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 2 ml de medio LB suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C por 8-10 horas con agitación a 250 rpm. (Nota: No arremoline el lisado en ningún momento porque esto puede cizallar el DNA cromosomal).5 M. centrifuge como antes. añada un cuarto en volumen de NaCl 50% PEG/0. Agregue un total de 140 ml de solución lisis alcalina (70 ml por cada frasco). Junte los supernadantes clarificados en un recipiente limpio. Añada 105 ml de 3M NaOAc. 5. Clarifique el lisado de SDS precipitado.

Para purificación basada en tierra diatomea: 7b. Visualice el DNA teñido por el bromuro de etidio bajo luz UV de longitud de onda larga. y remueva la banda inferior de DNA usando una jeringa de 5cc y una aguja calibre 25.000 rpm por 30 minutos en el RC5-B usando el rotor GS3. 13b. Permita que el DNA esté a temperature ambiente por 5 minutos con mezclado ocasional. centrifugue como antes. centrifuge a 10. 8b.6.1. 12b.000 rpm por 10 minutos en el RC5-B usando el rotor GS3. y centrifugue como anteriormente. .5 volumenes de etanol frío al 95%.12a.5 ml. Reúna fracciones con un A260 de 1. Decante el supernadante. Remueva la tierra diatomea por centrifugación a 9.5 volumenes de 95% de etanol frío/acetona. (Sería conveniente primero remover y descartar la banda superior).000 por 10 minutos en el RC5-B usando el rotor GS3. resuspensión. Añada un volumen igual de isopropanol y precipite a temperatura de cuarto por 5 minutos.00 o mayor en tubos de vidrio Corex de 35 ml. Centrifugue a 9. Equilibre la resina Dowex AG (BioRad) por centrifugación sucesiva. Resuspenda el DNA en buffer TE 10:0. agua. 9b. 11b. Combine los supernadantes que contienen DNA y precipite el DNA en tubos de vridrio Corex de 35 ml agragando 2. y seque la placa de DNA en un horno a vacío. y centrifugue como antes. y añada 40 ml de tierra diatomea definida en HCl-guanidina (100 mg/ml) por cada frasco. y eluir el DNA envolvente por incubación a 65°C por 10 minutos con mezclado intermitente. resuspenda cada placa en 40 ml de buffer de lavado de tierra diatomea. y precipite con etanol por adición de 2.5 ml. 15b. Decante el supernadante y seque la placa en un horno a vacío. y colecte fracciones de 0. pH 7. Decante con cuidado el supernadante. Resuspenda la placa en 20 ml de buffer TE 10:1 TE. Para remover el bromuro de etidio. Decante el supernadadnte y drene la placa de DNA. 14b. 13a. 10b. añada 80% de etanol. y decantando con 1M NaOH. Centrifugue a 9. Incube al menos 2 hours a -20°C. añada un volumen de ddH2O. decante. Resuspenda cada placa de DNA en 20 ml de buffer TE 10:1. Reúna los supernadantes del paso 6 en frascos de 500 ml y agregue RNasa A libre de DNasa y RNasa T1 de tal forma que la concentración final de RNasa A sea 40 ug/ml y de RNase T1 sea 40 U/ml. 14a. Incube en un baño de agua a 37°C por 30 minutos. y después HCL-Tris 1M. resuspenda cada placa en 40 ml de acetona.000 rpm por 45 minutos en el RC5-B usando el rotor SS-34. Repita si es necesario. 15a. cargue la muestra de DNA en una columna equilibrada Dowex 1. Decante el supernadante.6 hasta que la solución Dowex tenga un pH de 7.

Junte las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos en tubos cónicos de 50 ml en la centrífuga de mesa Beckman GPR y decante el supernadante. se efectúa un método de purificación de tierra diatomea basado en lisis alcalina (19-22). . Aislamiento Midiprep de DNA de doble cadena Una midi-prep de asilamiento de DNA de doble cadena ha sido creada para generar una cantidad suficiente de DNA platilla para varias reacciones catalizadas de terminador fluorescente Sequenase[TM]. mezcle suavemente por agitación. membranas. 5. y 5 ug son usados comúmente en una reacción de terminación Sequenase[TM]. En este tiempo. B. mezcle suavemente. Aqui. Resuspenda la placa seca de DNA en 2 ml de buffer TE 10:0. Para 50 ml de cultivo celular. una colonia bacteriana la cual alberga el plásmido de interés es tomada en 3 ml de medio líquido conteniendo ampicilina e incubado en un agitador a 37°C por 8-10 horas. similar al discutido anteriormente en el aislamiento de DNa a gran escala. Clarifique el lisado de SDS precipitado. alrederor de 50 ug de DNA son recuperados. Protocolo 1. y DNA cromosomal vertiendo a través de una doble capa de estopilla en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Centrifugue a 3. proteínas.1 y ensaye por concentración para lecturas de absorbancia a 260 nm o por electroforesis de gel de agarosa.000 rpm por 20 minutos a 4°C en la centrífuga de mesa Beckman GPR. 2. Nota: Éste procedimiento es el método de selección para aislar platillas basadas en plásmido de doble cadena para Reacciones de Rotulado con Tinte de Secuencia Terminadora Sequenase. 4. e incube por 5 minutos en un baño de hielo-agua. Las plascas de células pueden congelarse a -70°C en este punto. Añada 4 ml de 3M NaOAc. añada 04 ml de solución lisis alcalina. Transfiera el cultivo a un matraz Ehrlenmeyer conteniendo 50 ml de un medio similar. Después del albergado de células por centrifugación. e incube en un baño de hielo-agua por 30-60 minutos. Tome una colonia de bacteria que albergue el DNA plásmido de interés y colóquela en un rubo Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 3 ml de medio 2xTY suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C de 8-10 horas con agitación a 250 rpm.8.16b. 3. pH 4. Resuspenda las placas de células en 2 ml de solución de GET/Lisozima. El DNA purificado es ensayado crudamente por concentración y pureza mediante electrophoresis de gel de agarosa contra estándares conocidos. El producto aproximado de DNA de doble cadena usando éste método es 1 ug de DNA por ml de cultivo celular. e incube por otras 11-14 horas. el cultivo es transferido a 50 ml de medio que contiene ampicilina e incubado por otras 10-12 horas.

Como el DNA superenrrollado es deseado para el secuenciado de DNA de doble cadena. Un rendimiento típico para éste método de aislamiento de DNA es 10-15 ug de DNA plásmido de 6 ml de cultivo inicial. 12. Después colectando el plásmido contenido en las células por centrifugación. El DNA es checado crudamente para concentración y pureza usando electrofóresis de del de agarosa contra estándares conocidos. Las células son sucesivamente incubadas con un buffer RNasa-lisis. Resuspenda la placa de DNA secada en 40 ul de buffer TE 10:0. Transfiera el supernadante a un Nuevo tubo de microcentrifugación de 1. añada 20 ul de RNasa libre de DNasa a 20 mg/ml e incube en un baño de agua a 37°C por 30 minutos. el plásmido conteniendo supernadante es incubado con tierra diatomea e hidrocloruro de guanidina y esta mezcla es añadida a uno de los 24 pozos en el BioRad . Transfiera el supernadante a un tubo de microcentrifugación de 1. alícuotas más pequeñas de antibiótico conteniendo medio líquido inoculado con colonias celulares que contienen plásmido son incubadas en un agitador a 37°C por 12-16 horas. resuspenda en 7 ml de buffer de lavado de tierra diatomea. Decante el supernadante y seque en un horno a vacío. Decante el supernadante. Remueva la tierra diatomea por centrifugación a 3. 8. 13.6 ml de buffer TE 10:1. resuspenda en 7 ml de acetona. y centrifugue como anteriormente lo hizo. Añada 7 ml (igual volumen) de tierra diatomea HCl-guanidina (20 mg/ml) y permita que el DNA esté en contacto con la temperatura ambiente por 5 minutos con mezclado ocasional. una modificación de éste método empleando tierra diatomea (19-22) algunas veces es usado para el aislamiento de plantillas de doble cadena para DNA secuencial con cebadores fluorescentes. 11.5 ml y precipite con etanol. 7. Decante el supernadante. Aislamiento Miniprep de DNA de doble cadena El método estándar para el aislamiento miniprep de DNA plásmido incluye la misma estrategia general que el aislamiento a gran escala.1 y ensaye para concentración por electroforesis de gel de agarosa. 14. Centrifugue a 3. y centrifugue como antes.000 rpm por 5 minutos en la centrífuga de mesa Beckman GPR. y eluír DNA aprisionado por incubación a 65°C por 10 minutos con mezclado intermitente.000 por 5 minutos en la centrífuga de mesa Beckman GPR.6. Resuspenda la placa en 0. y acetate de sodio. Sin embargo. C. 9. Después de remover las proteínas precipitadas y las membranas.5 ml y centrifugue a 12. detergente alcalino. Decante el supernadante a un tubo de polipropileno para centrífuga de 50 ml. y el DNA plásmido es recuperado del supernadante por precipitación con isopropanol.000 rpm por 5 minutos en una microcentrífuga a temperatura del cuarto. El lisado es clarificado de proteínas precipitadas y membranas por centrifugación. 10. la placa cellular es resuspendida en un buffer hipotónico de sucrosa.

Protocolo 1. Para purificación de base de tierra diatomea: . Clarifique el lisado de SDS precipitado. 6.2 ml de solución lisis alcalina.8. pH 4. Resuspenda las placas celulares en 0. El DNA asociado a la tierra diatomea es lavado para remover el hidrocloruro de guanidina con un buffer de etanol.Gene Prep Manifold. membranas. Electroforise una alícuota de la muestra de DNA en un gel de agasora al 0.1.2 ml de 3M NaOAc. añada 0.2 ml de solución TE-RNasa (50:10 buffer TE conteniendo 40 ug/ml de RNasa A. o en el paso 7b proceder con la purificación de la tierra diatomea para reacciones de ciclo secuenciado para Taq con terminador rotulado. y resuspenda la placa de DNA seca en 100-200 ul de buffer TE 10:0. centrifugue como antes por otros 15 minutos y transfiera el supernadante a un tubo limpio de 1. e incube por 15 minutos a la temperatura del cuarto.7% para determinar en crudo la concentración y pureza. El DNA recolectado es concentrado por precipitación con etanol y ensayado en crudo para concentración y pureza por electroforesis de gel de agarosa contra estándares conocidos. El supernadante es removido por filtración a vacío sobre un filtro de nitrocelulosa.5 ml. mezcle suavemente por agitación. Tome una colonia que albergue el DNA plásmido de interés y colóquelo en un tubo Falcon de 17 X 100 mm conteniendo 6 ml de metió TB suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C de 16-18 horas con agitación a 250 rpm. proteínas. El buffer de elución es añadido a los pozos. y después secado por filtración.000 rpm por 15 minutos en una microcentrífuga a 4° C. Colecte las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos en un centrífuga de mesa Beckman GPR y decante el supernadante. Nota: Esta es una típica mini-prep hasta el paso 7. 2. donde en el paso 7a se debe precipitar la muestra y usarla para el ciclo secuenciado de Taq con los tapaporos rotulados. e incube en un baño de hielo-agua por 15 minutos. 3. mezcle con cuidado. y DNA cromosomal por centrifugación a 12. Transfiera el supernadante a un tubo de microcentrifugación de 1. Para reacciones de de secuenciado para Sequenase terminador rotulado use el procedimiento Midi-prep detallado anteriormente. Las placas celulares pueden ser congeladas a -70°C en este punto. Añada 0. incube en un baño de hielo-agua por 15 minutos. Para purificación de lisis alcalina estándar: 7a. transfiera a tubos de microcentrifugación de 1. Precipite el DNA por adición de 1 ml de etanol 95%. 5. El producto aproximado de DNA de doble cadena es 3-5 ug de DNA por 6 ml de cultivo inicial. y el DNA conteniendo solución es separado de las partículas de tierra diatomea por filtración en un tubo colector. también puede añadirse RNasa T1 para una concentración final de 10 U/ul) por agitación suave. 4.5 ml.5 ml.

Encienda la bomba de vacío y ajuste el nivel de vacío a 8 in. Después de remover el bromuro de etidio en una columna de intercambio de iones. Derrame las muestras bien mezcladas dentro de los pozos del colector Prep-A-Gene y filtre a 8 in. precipitación con acetato de sodio de proteínas solubilizadas en detergente y membranas. y coloque el colector Prep-A-Gene como se describe en el manual. y el DNA es concentrado por precipitación con etanol y analizado por digestión enzimática restrictiva y electroforesis de gel de agarosa. D. 9b. Hg. la preparación del vector defosforilado.7b. Después el M13RF conteniendo células bacterianas es colectado por centrifugación. permitiendo que todo el el líquido sea filtrado entre los lavados.5 ml en el colector. empape la membrana de nitrocelulosa Prep-A-Gene en isopropanol por al menos 3 minutos. Aislamiento a gran escala de M13RF (9) La doble cadena M13RF es aislada para usarse en el corte M13 SmaI. y aplique 300 ul de buffer TE 10:1 calentado a 65°C y jale el DNA eluido a 5 in. Añada 1 ml de tierra diatomea en hidrocloruro de guanidina (20 mg/ml) y permita que el DNA esté en contacto con la temperatura del cuarto por 5 minutos con mezclado ocasional. Mientras tanto. Precipite el DNa con etanol y resuspenda la placa de DNA secado en 30 ul de buffer TE 10:0. y entonces cese el vacío. 12b. pero resulta en una máxima cantidad de moléculas de M13 RF por célula.5 ml de fase inicial de JM101. y deje la membrana secarse por 1 minuto. Reduzca el vacío a 5 in. Esto brevemente implica lisis alcalina celular. 11b. Después de que el líquido ha sido filtrado. el DNA conteniendo fracciones es detectado por la medición de A260 y colectado. aumente el vacío a 10-12 in.1. Protocolo 1. se describe a continuación. como se describió anteriormente. e incube de acuerdo al . precipitación de DNA con polietilenglicol. sin agitación. 10b. Hg antes de cesar el vacío en la llave de paso. Prepare un cultivo en fase inicial de JM101 inoculando un matraz Ehrlenmeyer conteniendo 50 ml de 2xTY con glicerol provisto de JM101 y pre-incubado por 1 hora en unbaño de agua a 37°C. Sin desmontar las abrazaderas negras. Sujete el colector con las abrazaderas blancas. Hg hasta que el líquido haya pasado a través del filtro. usando una pipeta de repetición. Cese el vacío en la llave de paso y remueva el estante de recolección que contiene los tubos. Lave las muestras cuatro veces con 250 ul de buffer de lavado de tierra diatomea. Las condiciones de cremientos de células infectadas con la bacteria M13 (ver figura 1) aparece convoluída. Tome una placa que represente el M13 clone en cuatro alícuotas de 1. Hg. Hg. las moléculas de doble cadena son aisladas usando el método del cloruro de cesio para un aislamiento de plásmido a gran escala. y extracción de DNA teñido con bromuro de etidio del gradiente de cloruro de cesio después de la ultracentrifugación. retire las abrazaderas blancas y coloque el estante de recolección con tubos de rosca de 1. 8b. deje secar la membrana por 1 minuto.

y cloruro de cesio de manera que la concentración final de cloruro de cesio sea 1 g/ml. 5.5 ml por por cada frasco). Las placas celulares pueden se congeladas a -70°C en este punto. Clarifique el lisado de SDS precipitado. y DNa cromosomal por vertido a través de una capa doble de estopilla.000 rpm por 45 minutos en el RC5-B usando el rotor SS-34. añada un volumen de ddH2O. 2. Incube por lo menos 2 horas a -20°C. Transfiera el lisado a un frasco de centrifugación de 250 ml. Para remover el bromuro de etidio. equilibrada como antes. Resuspenda el DNA en buffer TE 10:0. proteínas. 3. Centrifugue a 60. 8. Visualice el DNA teñido con el bromuro de etidio bajo luz UV de longitud de onda larga. 6. Añada 6 ml de bromuro de etidio 5 mg/ml.00 o mayor en tubos de vidrio Corex de 35 ml.000 rpm de 16-20 horas a 15-20°C en el Sorvall OTD-75B ultracentrifugue usando el rotor T-865. . Añada un total de 24 ml solución de lisozima (6 ml por cada frasco).5 de etanol frío al 95%. Añada 48 ml de buffer TTE 50:2:10 (12 ml por por cada frasco) y 2 ml de RNasa A (10 mg/ml) (0. cargue la muestra de DNA en una columna de 1. 4. 11. centrifugue a 10.5 ml Dowex AG (BioRad). añada etanol al 80%. Resuspenda las places celulares en medio fresco 2xTY para remover fago extracelular contaminante y transfiera a dos frascos. Junte las fracciones con un A260 de 1.000 rpm por 30 minutos a 4° C en el RC5-B usando el rotor GSA. remueva la banda inferior de DNA usando una jeringa de 5cc y una aguja de calibre 25. Transfiera la muestra a tubos de polialómero de 35 ml y llene con una solución 1:1 de buffer TE 100:10 TE y bromuro de cesio. 9. 12. mezcle gentilmente. 7. selle con empaques de goma y cierre adecuadamente. mezcle con cuidado. y precipite con etanol agregando volúmenes de 2. y seque la placa de DNA en un horno a vacío. 10. centrifugue a 10.5 ml. centrifugue. decante. Colecte las células por centrifugación a 7000 rpm por 20 minutos en frascos de 500 ml en el RC5-B usando el rotor GS3. e incube en un baño de hielo-agua por 5 minutos. (Sería adecuado remover y descartar la banda superior primero). e incube por 5 minutos en un baño de hielo-agua.1. Resuspenda las placas celulares en un total de 120 ml (30 ml por cada frasco) de buffer STB 1X removiendo suavemente la placa con una espátula. y colecte fracciones de 0. centrifugue como antes. y decante el medio.procedimiento mostrado en la figura 1 para resultar en 4 litros de bacteria infectada con M13. remueva las burbujas de aire. Decante con cuidado el supernadante. membranas.

las células bacterianas son emplacadas por centrifugación y el contenido viral supernadante es transferido a un tubo limpio. La cubierta proteínica del fago es desnaturalizada y extraída por una o incluso dos extracciones con fenol. y la concentración y pureza son analizadas por electroforesis de gel de agarosa contra estándares conocidos. y tome placas basadas en M13 con mondadientes estériles y colóquelas en tubos Falcon de 12 X 75 . Prepare un cultivo en fase inicial de JM101. y el emplacada es resuspendido en buffer. Las partículas de fago son precipitadas con PEG. Después de la incubación. Protocolo 1. la placa de DNA seca es resuspendida en buffer. Se prepara un cultivo preincubado de fase inicial de JM101 por transfiriendo glicerol descongelado base a 50 ml de medio líquido e incubado por 1 hora a 37°C sin agitarse. Placas de M13 son tomadas con un mondadientes estéril y colocadas en alicuotas de 1.E.5 ml de cultivo en fase inicial de JM101. Aislamiento de DNA de cadena simple M13 usando fenol Este procedimiento de aislamiento (23) es el método de preferencia para la preparación de plantillas basadas en M13 usadas en reacciones catalizadas de terminador teñido de Sequenase[TM]. los cuales son incubados en un agitador a 37° C por 4-6 horas. como anteriormente. Después de la precipitación con etanol. recolectadas por centrifugación.

6. y entonces colocado cuidadosamente en la tableta Biomek. Pipeteé 1 ml de la parte superior del supernadante y colóquelo en un tubo de microcentrifugación de 1. y colocar la placa de microtitulación en el Biomek. Una solución de polietilenglicol (PEG) después es añadida a cada pozo y mezclada. Resuspenda el DNA secado en 6 ul de TE 10:0. y después centrifugada. sin desmontar la placa. incubada a temperature de la habitación para precipitar las partículas de fago. 4. Incube por 4-6 horas a 37°C con agitación a 250 rpm.000 rpm a 4°C. pH 7.5 ml de las células. Después de colocar la placa de microtitulación de regreso en el Biomek. Procedimiento de aislamiento automatizado Biomek Eperon modificado para DNA de cadena simple M13 Éste método semiautomatizado es una modificación del procedimiento reportado previamente (24. El supernadante entonces es removido invirtiendo la placa y drenando con cuidado en una toalla de papel. como antes. Basicamente. Transfiera el cultivo a tubos de microcentrifugación de 1. centrifugados para separar las células bacterianas del viral supernadante. Por cada muestra.mm conteniendo alícuotas de 1. una solución de detergente Triton X-100 es agregada robóticamente a .1 para usarse en reacciones catalizadas de secuenciado de tinte terminador de cadena simple Sequenase[TM]. 2. Mezcle invirtiendo varias veces e incube por 15-30 minutos a temperatura de la habitación. transferidos a tubos de microcentrifugación. Resuspenda el emplacado en 100 ul de HCl-Tris 10 mM. dos alicuotas de 250 ul son distribuidas roboticamente dentro de dos pozos de una placa de 96 pozos de microtitulación. La placa de microtitulación es cubierta con una placa de acetate sellador. una solución diluida más de PEG es añadida robóticamente a cada pozo. Los cultivos infectados con fago son incubados con agitación a 37°C por 4-6 horas. F.25). Extraer el DNA con fenol y dos veces con éter.000 rpm a 4°C para recolectar el fago precipitado. 7. preparadas como se discutió antes. y después precipite con etanol. Decante el supernadante y remueva el PEG residual supernadante por succión dos veces.2 ml de 20% PEG/2.6 por arremolinamiento. 5. Este paso de enjuague ayuda en la remoción de proteínas contaminantes y RNA. y éste proceso es repetido para cada una de las 48 muestras hasta que los 96 pozos enteros sean llenados. placas de M13 son tomadas con mondadientes estériles y colocadas en alicuotas de fase inicial de JM101. 3. Después de remover el supernadante. como se discutió anteriormente.5 ml centrifugue por 15 minutos a 12.5 M NaCl para precipitar las partículas del fago. y agregue 50 ul de fenol saturado con TE. La placa entonces es cubierta con otro sellador y centrifugada nuevamente. y permite el aislamiento simultáneo de 48 DNAs de cadena simple por estación de trabajo Biomek 1000 en un lapso de 3 horas (26). Centrifugue por 15 minutos a 12.5 ml conteniendo 0.

como anteriormente se hizo. e incube por 4-6 horas a 37°C con agitación a 250 rpm. El Biomek distribuirá dos alícuotas de 250 ul de viral supernadante por muestra en los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos de fondo plano (Dynatech). 3.5 M NaCl a cada pozo. El modulo reactive debe contener PEG-2000. respectivamente. El Biomek después añadirá 50 ul de solución 20% PEG/2. Usando mondadientes estériles. 9. centrifugue y drene como antes. y mezclara por pipeteo de arriba a abajo. Cubra la placa con una placa de acetato sellador e incube a temperatura de la habitación por 15 minutos. Una alícuota de cada muestra de DNA es sujeta a electroforesis de gel de agarosa para analizar crudamente concentración y pureza. 8. El Biomek entonces juntará robóticamente el contenido de cada par de pozos en tubos de microcentrifugación de 1. Remueva la placa selladora y drene el PEG de la placa drenando cuidadosamente de arriba abajo en un Kimwipe. Prepare un cultivo en fase inicial JM101 en 50 ml de 2xTY. Después de una breve centrifugación para colectar el condensado. y el Biomek robóticamente añadirá 200 ul de solución de enjuague PEG:TE a cada pozo. 2. . Triton-Tris-EDTA. los cuales son tapados y colocados en un baño de agua a 80° C por 10 minutos para ayudar a la solubilización de la capa de fago de proteínas en el detergente. 6. La placa es agitada suavemente y la muestra de cada par de pozos es roboticamente transferida a tubos de microcentrifugación.000 rpm por 15 minutos a 4°C. el DNA de cadena simple es precipitado con etanol. y el Biomek añadirá 70 ul de solución TTE a cada pozo. transfiera placas individuales de M13 a tubos Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 1 ml de cultivo celular en fase prematura. Remueva y agite suavemente para resuspender. Regrese la placa a la tableta. 1. y etanol-acetato.5 ml. (Crecimiento por más de 6 horas resulta en lisis celular y contaminación del DNA fago por proteínas celulares y ácidos nucleicos). Cubra la placa con sellador. Protocolo El procedimiento requerirá 9 filas de puntas P250 (contando del centro de la tablet de Biomek hacia la izquierda) para aislar 48 plantillas (48ISOL). 5. EMplaque el fago precipitado centrifugando la placa a 2400 rpm por 20 minutos en una centrífuga de mesa Beckman GPR.cada pozo. 7. Regrese a la placa a la tableta. El producto de la plantilla de cadena simple es aproximadamente 2-3 ug por muestra. 4. Abra cuidadosamente los tubos y coloque en la tableta Biomek. Separe las células bacterianas del supernadante conteniendo viral por centrifugación a 12. secado y resuspendido.

12.10. Una alícuota de cada muestra de DNA es sujeta a electroforesis de gel de agarosa para analizar crudamente concentración y pureza. añada 100ul de solución TE-RNAsa-A conteniendo RNAsa T1.75 ml de medio TB por pozo. cobra el bloque de 96 pozos con la tapa suelta. Remueva el bloque del agitador/incubador y colecte las células por centrifugación a 2500 rpm por 7 minutos. Tome clones individuales de cada placa on un mondadientes estéril y deposite cada uno por separado en el bloque de 96 pozos conteniendo 1. Una solución lisis alcalina es usada para lisar las células y el lisado es precipitado con KOAc. Estas células son colectadas por centrifugación y las placas son manual o roboticamente resispendidas por la adición de solución TE-RNasa. 2. Aislamiento en 96 pozos de plantillas de doble cadena Un manual como un procedimiento automatizado es dado a continuación. Las células pueden se guardadas congeladas a -20°C en el bloque en este punto. Protocolo Manual del método de aislamiento de doble cadena Lo siguiente es un manual del procedimiento para el aislamiento secuencial de plantillas en 96 pozos de doble cadena que ha sido desarrollado en nuestro laboratorio. y permita que las células crezcan por 24 horas en el agitador/incubador a 37° C a 350 rpm. . Después de descongelar las células. Mantenga el mondadientes en el medio por alrededor de 5 minutos para permitir que las células se difundan en el medio. remueva los mondadientes. Basicamente colonias que contienen plásmidos de doble cadena sin tomados con mondadientes estériles y colocados en medio e incubados a 37°C por 24 horas con agitación a 350 rpm. mezcle por pipeteo arriba y abajo 4-5 veces para resuspender la placa celular y después incube en el incubador/agitador a 37°C por 5 minutos a 350 rpm para mezclar más a fondo. Un procedimiento similar que ha sido automatizado en el Biomek es presentado en otro espacio aquí. Resuspenda las plantillas de DNA en 20 ul de buffer TE 10:0. 1. G. 3. como se describió anteriormente. Precipite con etanol el DNA agregando 500 ul etanol/acetato a cada tubo.1. El producto de la platilla de doble cadena es aproxmadamente 3 mg por muestra. El método automatizado es una modificación de un procedimiento previamente reportado (4) el cual permite el aislamiento de 96 DNAs por estación de trabajo de laboratorio automatizada Biomek 1000 cada dos horas. 11. El lisado es clarificado por filtración y posteriormente concentrado por precipitación con etanol. Incube los tubos a 80°C por 10 minutos para desnaturalizar la cubierta de proteína viral y después centrifugue brevemente para recoger la condensación.

Drene el supernadante y permita que las placas se drenen invertidas.8 en el tercer módulo. 1. debe poner la solución TERNasa en el primer módulo. Colecte las células por centrifugación a 1800 rpm por 7 min. 3. 5. y coloque el bloque en un agitador/incubador a 37°C por 5 minutos a 350 rpm para mezclar a fondo y cizallar el DNa genómico para reducir la viscosidad de la solución. las plantillas secadas deben ser almacenadas a -20°C. la solución lisis alcalina en el segundo módulo de reactivo y el 3 M KOAc. 2. Tome colonias usando un mondadientes y colocándolas en 1. 9. 5. Presione ENTER para continuar con el programa. Coloque el filtro miniporo en la posición etiquetada "placa de titulación de fondo plano de 96 pozos".8 ml de TB con sales de TB conteniendo el antibiótico apropiado y agite por 22-24 horas a 350 rpm en un bloque de 96 pozos con cubierta.0 ml". 7. . pH 5.4. 8. lavado tres veces con etanol al 70%. arranque el programa DSISOL2 y configure el Biomek como se indica en la pantalla de configuración. Centrifugue el bloque en la centrífuga GPR a 3000 rpm a 4°C por 30 minutos. el emplacado es colectado por centrifugación. Un adicional de 75 ul del supernadante es transferido a un tubo de reacción Robbins PCR (en formato de tubo de 96 pozos) y precipitado con 200 ul de etanol al 95%. y almacenado seco at -20°C para su uso posterior. y secado directamente en los tubos de reacción de ciclo secuenciado. 6. Coloque el bloque a -20degC por 30 minutos. Específicamente. Agite el bloque a mano para mezclar los reactivos y después incube a la temperature del cuarto por 1 hora con arremolinado intermitente. Coloque el bloque de 96 pozos conteniendo las células en la tableta de Biomek en la posición etiquetada “Minitubos de 1. Transfiera 10 ul del supernadante a los respectivos tubos de reacción de ciclo secuenciado. El siguiente es un procedimiento para el aislamiento automatizado de plantillas de 96 pozos de doble cadena que se ha desarrollado en nuestro laboratorio. Remueva con cuidado 200 ul del supernadante de cada pozo en el bloque de 96 pozos con la pipeta de 12 canales y transfiéralos a una placa de microtitulación de fondo en V. pH 4. y precipite con 150 ul de etanol al 95% (sin acetato añadido). Después guarde a -20°C por 30 minutos. Después añada 100ul de acetato de sodio o de potasio 3M. lavado tres veces con etanol al 70%. Remueva el bloque del incubador/agitador y entonces añada 100ul de solución lisis alcalina. Las placas celulares pueden ser congeladas en este punto si es necesario. 4. Antes de agregar el terminador fluorescente a la mezcla de reacción de ciclo secuenciado. siendo cuidadoso de no transferir ninguna célula de desecho. Encienda el Biomek.

se agrega buffer de citrato estándar. Siguiente. el Biomek añadirá 100 ml de solución lisis alcalina a los pozos con la placa de filtro. transferirá el volumen entero a la placa filtro conteniendo la solución lisis alcalina y mezclará otra vez. y después de una centrifugación la capa acuosa es removida a un tubo de microcentrifugación fresco. El Biomek añadirá 100 ml 3M KOAc. Transfiera la placa filtro al QiaVac Vacuum Manifold 96 y filter usando agua de vacío solamente (no force la filtración ya que las placas son frágiles y podrían perder su sello). Después de que el supernadante es descartado. Resuspenda en 50 ml de TE 10:0. se mezcla y los tubos son centrifugados. se le añade buffer y el DNA es resuspendido para incubarlo a 55°C por la noche. Ajuste la filtración del aparato con un bloque de 96 pozos limpio para recolectar el filtrado (lave y reuse el bloque usado para el crecimiento). El DNA es precipitado con etanol.8 a los pozos de la placa filtro y mezclará al los lados de los pozos. Protocolo (actualizado 10/30/98) . A la muestra entonces se le extrae el fenol una vez con una solución fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. La porción superior de supernadante es descartada y se añade buffer adicional. Una vez que el emplacado este seco. resuspendido en buffer. 7. 11. H. 9. Seque a vacío. 8. el emplacado es resuspendido en una solución de detergente SDS y proteinasa Km y la mezcla es incubada a 55° C por una hora.6. 14. Después de que las muestras de sangre son descongeladas (almacenadas a -70°C en tubos a vacío de EDTA).1 para usar una química secuencial de colorante iniciador o colorante terminador. 12. Aislamiento de DNA genómico desde sangre El aislamiento de DNA genómico es desarrollado de acuerdo al protocol del FBI (27). Primero el Biomek añadirá 100 ml de solución TE-RNasa a las placas celulares y mezclará para resuspender parcialmente. Algunos escogen colocar la placa filtro a -20°C por 5 minutos en este punto. El supernadante recolectado en el bloque de 96 pozos es el DNA crudo y debe ser precipitado con etanol antes de su uso mediante la adición de 1ml de etanol al 100% e incubando a -20°C por al menos 30 minutos. y después precipitado con etanol una segunda vez. la solución de DNA genómico es analizada por la cadena de reacción de polimerasa. drene invertido en una toalla de papel. El Biomek después mezclará la suspensión celular otra vez. Esto comúnmente toma menos de 20 minutos. se mezcla y el tubo es centrifugado nuevamente. 10. Decante el supernadante. Decante y lave con 500 ml de etanol al 80% y centrifugue por 5 minutos adicionales a 3000 rpm. 13. Centrifugue por 25 minutos a 3000 rpm en una centrífuga enfriada Beckman GPR. pH 4.

Muestras de sangre son comúnmente obtenidas como 1 ml de sangre entera almacenada en tubos de EDTA a -70° C. 3. Oklahoma 73019 broe@ou. Incube por la noche a 55°C. Añada 1 ml de buffer 1X SSC. e incube a 55°C por 10 minutos. Centrifugue por 1 minuto a 12. Después añada 25 ul de SDS al 10% y 5 ul de proteinasa K (20 mg/ml H2O) (Sigma P-0390). Enjuague las muestras congeladas.1. y a cada muestra de 1 ml. 6. 12. Universidad de Oklahoma.2M NaOAc a cada emplacado y vortice brevemente.000 rpm en un tubo de microcentrifugación. Decante el supernadante. Añada 180 ul de buffer TE 10:1. Añada 375 ul de 0.000 rpm en una microcentrífuga. Agregue 500 ul de etanol frío al 100%. 9. 7. y remueva todo el supernadante. Centrifugue por 1 minuto a 12. agitando periódicamente para disolver el DNA genómico.edu Extracción de DNA . centrifugue como antes por 1 minuto. agregue 1 ml de etanol frio al 100%. Decante el supernadante y drene.5 ml. mezcle.8 ml de buffer 1X SSC. vortice brevemente e incube por 1 hora a 55°C. e incube por 15 minutos a -20° C. Añada 120 ul de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y agite por 30 segundos. 13. Centrifugue por 2 minutos a 12. 5. Almacene las muestras a -20°C. Norman. Remueva 1 ml del supernadante y descarte en desinfectante. Decante el supernadante y enjuague el emplacado con 1 ml de etanol al 80%. y seque el emplacado en una Speedy-Vac por 10 minutos (o hasta que esté seco). vortice. Departamento de Química y Bioquímica. agite. Remueva cuidadosamente la capa acuosa y colóquela en un nuevo tubo de microcentrifugación de 1. 2.000 rpm en una microcentrífuga. Roe. mezcle. 4. y centrifugue por 1 minuto a 12.000 rpm en una microcentrífuga. Resuspenda el emplacado adicionando 200 ul de buffer TE 10:1 TE.000 rpm en una microcentrífuga. y mezcle. 10. añada 0. Bruce A. Añada 20 ul de acetato de sodio 2 M y mezcle. 11. Centrifugue la muestra por 2 minutos a 12. 8.

55ºC (temperature óptima para la actividad de la proteinasa K) por la noche en un baño de agua o en un incubador. evaluado en el Laboratorio de DNA. Se observó que en almacenamiento prolongado de sangre entera a -20 y -80ºC . 1. para facilimtar la hemólisis de RBCs se recomienda almacenar la muestra fresca por unas cuantas horas en un enfriador ya que el frío destruye las células rojas. PROCEDIMIENTO: 1. Después de la centrifugación se observan 2 fases y debe ternerse cuidado de no crear un disturbio en la interfase. En el siguiente protocolo el DNA fue extraído de leucocitos de sangre periférica usando 3ml de sangre entera. 8. 7.0) conteniendo 100µ g/ml de proteinasa K y 1% de dodecilsulfato de sodio (SDS w/v). Los tubos después son incubados a una temperature de 37 . seguido de la adición de 3. 10mM KHCO3. Este emplacado debe ser lavado por al menos 3 veces por adición de 3ml de buffer de lisado de eritrocito y repitiendo los pasos 3 y 4. pH 8. 0.9 y una concentración de 100ng/ml. Es importante desglosar el emplacado y enjuagarlo bien con buffer de lisado de eritrocito con el fin de limpiar las células blancas de la sangre del hemo remanente. Escuela Médica. Durante este paso el DNA es extraído en el supernadante y las proteínas son separadas en la fase inferior. 9. Alternativamente pueden dejarse los tubos en un rotor por 1 hora. Después de la incubación. pH 7. 4. 3ml de sangre entera son transferidos a un tubo cónico de centrifugación (15ml de volumen) al cual 9ml de buffer de lisado de eritrocito 1X (0. 10. El DNA sera precipitado con rotación suave del tubo y se observa un hilo como hebra. Malta. . Los volúmenes de buffers y reactivos usados deben ser ajustados de acuerdo al volumen de sangre entera a usarse. seguido de la adición de un volumen igual de isopropanol.155M NH4Cl. Cuando se analizó por espectrofotmetría >95% del DNA genómico extraído dió un promedio de pureza de DNA a proteínas en un rango de 1. (1988). Durante este paso las membranas de las células blancas de la sangre son desnaturalizadas y el DNA sale en solución.1. Después de descongelar.75mls de cloroformo.7 . 1.1mM Na2 EDTA. Los tubos son mezclados vigorosamente (en un vórtice) por alrededor de 20 seg con mezclado ocasional por al menos 30min. La solución es dejada por 10 minutos a RT con mezclado occasional por inversión seguido de una centrifugación por 5 minutos a 4000 rpm. 25mM Na2 EDTA. La emulsion sera centrifugada por 10 minutos a 2000 rpm con minima fuerza de rompimiento.Ésta es una modificación de un procedimiento de salado como es descrito por Miller et al.5mls de buffer SE junto con 750µ l NaCl 6M (saturado) son agregados en cada tubo. 5. Después de la centrifugación el supernadante es descartado y una placa blanca será visible al fondo del tubo.4) debe ser añadido. 3. 6. son añadidos al emplacado. 2.5mls de buffer SE (75mM NaCl. el producto de DNA disminuyó considerablemente probablemente debido a la degeneración de los glóbulos blancos.. Sangre entera es recolectada en contenedores de EDTA disodio y almacenada a -20ºC y un numero de muestras también son almacenadas a -80ºC. La fase acuosa superior (conteniendo el DNA) es transferida a un tubo de centrifugación cónico estéril limpio usando una pipeta Pasteur.

absoluto HCl Alcohol Isoamílico Sigma.1mM] Llenar a 1000 ml con agua destilada . Para ajustar una concentración menor uno debe usar otros métodos cuantitativos tales como Picogreen (Molecular Probes) usando espectrofluorometría ya que la espectrofotometría no es precisa y sensitiva a muy bajas concentraciones. [10 mM] Na2EDTA 0. La concentración de DNA es determinada por electrophoresis de gel de agarosa o por espectrofotometría y ajustando a la concentración deseada adicionando más buffer TE.0) y dejado por la noche en un rotador.034 g or 200  l EDTA 0. 3400-1016 Buffer Tris EDTA. Gibbstown. I-3643 Isopropanol (2-Propanol) Fenol Carbonato de potasio (KHCO3) Proteinasa K EM Science.29 g f. Inc. Repita este paso una vez más. 0. Rama Genética. NCI Instituto Nacional de Salud Reactivos Cloruro de amonio (NH4Cl) Cloroformo Mallinckrodt.5M EDTA.c. El supernadante es descartado teniendo cuidado de no descartar el emplacado. 24568-2 (100 mg) Acetato de sodio Cloruro de sodio EDTA de sodio (Na2EDTA) Dodecilsulfato de sodio (SDS 10%) Digene Diagnostics. [155 mM] KHCO3 1 g f. Después de descartar el supernadante el emplacado es secado del exceso de etanol usando centrifugación a vacío o dejando los tubos abiertos e invertidos e un horno a alrededor de 50 . 12. 14. Preparación de DNA desde sangre Sección Genómica de Cáncer. Cat. El DNA es entonces lavado por inversión para limpiarlo de cualquier sal remanente y el tubo es centrifugado a 11000g por 4 minutos. 15.65ºC por una hora.c. Cat. 13. [0. Usando una espátula estéril o un bucle se transfiere la hebra de DNA a un tubo estéril de microcentrifugación conteniendo 1ml de etanol al 75%. El emplacado seco es resuspendido en buffer TE (1M Tris-HCl. Es importante notar que antes de ajustar y leer la concentración de DNa uno debe obtener una muestra homogénea de DNA lo cual no es muy fácil de conseguir ya que el DNA es muy viscoso. pH 8.11. Cat.c. Cat.5 M f. WV. 4440 Etanol. pH 8.0 Preparación Buffer lisis NH4Cl 8.

A 10 ml de sangre entera (EDTA. Lave el DNA en etanol al 70% y disuelva el DNA en 0. añada 1 ml de buffer SE y resuspenda el emplacado. Transfiera el supernadante a un nuevo tubo. haga un gancho sobre un mechero bunsen y capture el DNA. y centrifugue a 1200 rpm por 10 min a 4° C. y centrifugue a 3000 rpm por 5 min a 10°C. 4. Remueva el supernadante y congele el emplacado. agite a mano por 10 min. Remueva el supernadante (sangre de desecho). Remueva el supernadante (sangre de desecho).39 g f.2) y 10 ml de isopropanol. agite suavemente. Añada 5 ml de buffer SE y 10 ml de fenol. y centrifugue a 3000 rpm por 5 min a 10°C.c. Remueva el supernadante (sangre de desecho). . resuspenda el emplacado. citrato) añada 30 ml de buffer lisis.2 con CH3COOH Proteinasa K (10mg/ml) Disolver 100 mg de Proteinasa K en 10 ml de TE por 30 min a la temperatura del cuarto Alicuote y almacene a –20°C Procedimiento 1. y centrifugue por 10 min a 4°C (1200 rpm). 8.c. agite a mano por 10 min. 2. agite a mano por 10 min. use una pipeta de vidrio.5-1 ml de buffer TE por la noche a 4°C en un agitador rotativo. añada 10 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). [25 mM] Llenar a 1000 ml con agua destilada Ajustar pH 8. 6. añada ml de buffer SE. 7.) Añada 5 ml de buffer SE y resuspenda el emplacado. añada 300 μl de acetato de sodio 3 M (pH5. 3. agite suavemente. añada 10 ml de buffer lisis. y centrifugue por 10 min a 4°C (1200 rpm).4 con 1 M HCl o NaOH por cada uso Cloroformo/Alcohol isoamílico 24:1 Cloroformo 24 ml Alcohol isoamílico 1 ml Buffer SE NaCl 4. (Si el DNA no se disuelve déjelo más tiempo a 4°C en el agitador rotativo).Ajustar pH 7. Use un criotubo y centrifugue a 1200 rpm por 10 min a 4°C.5 M f. 5. incube por 30 min en hielo.0 con 1 M NaOH por cada uso Acetato de sodio 3 M acetato de sodio 246 g/L Ajustar pH 5. Transfiera el supernadante a un tuboe nuevo.41 g o 50 ml EDTA 0. resuspenda el emplacado. añada 40 l proteinasa K (10 mg/ml) y 250  l 20% SDS. agite suavemente hasta que el DNA sea precipitado. (Es posible almacenar el emplacado a -80°C. 9. añada 10 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). De nuevo transfiera el supernadante a un tubo nuevo. [75 mM] Na2EDTA 8. e incube por la noche a 37°C en un baño de agua. Para hacerlo. heparina. y centrifugue a 3000 rpm por 5 min a 10°C.

GeneQuant) y corra 200 ng en un 1% gel de agarosa. 2. 25200-056 Agua destilada Gibco BRL. Cat. Cat. 3 M.0 100 ml 0. lave las células dos veces con 10 ml de buffer DNA y resuspenda en 10 ml de buffer DNA. pH 5. 15513-039 Buffer fosfato salino (PBS). Cat. Centrifugue los cultivos celulares por 10 min a 1200 rpm. Mida la concentración de DNA en un espectrofotómetro (Pharmacia. 10010-023 Proteinasa K Gibco BRL. Preparación de DNA desde Células Linfoblastoideas Reactivos Cloroformo Mallinckrodt. Cat. pH 8. 15230-170 Preparación Buffer DNA 1M Tris HCl. 1X Gibco BRL. .5 M EDTA 100 ml dH2O agua 300 ml Cloroformo/Alcohol isoamílico 24:1 Cloroformo 24 ml Alcohol isoamílico 1 ml Procedimiento 1. pH 8. incube por 10 min en hielo. Lave el emplacado celular dos veces con 10 ml 1X PBS. I-3643 Buffer fenol Gibco BRL. absoluto Alcohol isoamílico Sigma. 24568-2 Acetato de sodio. Tome el matraz con el cultivo celular y transfiera el contenido a un tubo de centrifuga de 15 o 50 ml. 4440 Etanol.2 Dodecilsulfato de sodio (SDS).10. Cat. Cat. Cat. 16-011V Tris HCl.0 Trypsin Gibco BRL. centrifugando entre lavados. Cat. Remueva el supernadante. 10% Buffer TAE Bio Whittaker.

Obtenga de 65-100 µl de sangre por sangrado retroorbital con un tubo microcapilar heparinizado. Coloque en un estante de invertido e invierta por 2 hr para enjuagar a fondo. 3.2). 7. agite suavemente hasta que el DNA se precipite. agite a mano por 10 min (RT).6 ml de cloroformo/alcohol isoamílico y agite a mano por 10 min (RT). Seque el emplacado en un speed vac por 5 min. 7. Añada 3 ml de buffer DNA. Añada 200 µl de buffer lisis a cada tubo y arremoline para suspender uniformemente. Microfugue 25 segundos a 16000xg para emplacar el nuclei. resuspenda el emplacado. Almacene en hielo hasta el procesamiento. Agite a mano por 10 min (RT). Resuspenda el emplacado nuclear en 100 µl PBND con 60 µg/ml de proteinasa K e incube a 55 C por 60 minutos (o por la noche si es conveniente). 6. 5. o hasta que no haya remanentes de hemoglobina. Reactivos: 1) Buffer Lisis 0. Agregue 100 μl de Proteinasa K (10 mg/ml) y 400 μl de 10% SDS. Expulse la sangre inmediatamente a un tubo de microcentrifugación de 1. Transfiera el DNA a un tubo eppendorf estéril.6 ml de fenol. 4. 5.3. 10.32 M Sucrosa 10mM Tris-HCl (pH 7. centrifugue por 10 min a 10°C a 3000 rpm. Centrifugue por 10 min a 1200 rpm y remueva el supernadante. centrifugue por 5 min a 10°C (3000 rpm). Agite suvemente e incube a 45°C en unbaño de agua por la noche. mezlce suavemente. centrifugue por 5 min a 10°C (3000 rpm). 9.3) . DNA desde sangre entera para PCR (from Higuchi.8 ml de fenol y 1. 6. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml.5) 5 mM MgCl2 1% v/v Triton X-100 2) PBND (PCR Buffer con detergentes no iónicos)* 50 mM KCl 10 mM Tris-HCl (pH 8. Mida la concentración de DNA y corra de 1-5  l (aproximadamente 200 ng) por electroforesis en gel de agarosa (1%) en buffer 1X TAE.8 ml de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Mezcle inmediatamente para prevenir la formación de coagulos. y agregue 3 volumenes de etanol al 100%. 8.000 rpm. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Añada 3. 2. Caliente las muestras a 97 C por 10 minutos para inactivar la proteinasa K. Disuelva el DNA en 300  l agua estéril y coloque en un agitador rotativo por la noche a 4°C. Centrifugue por 20 min a 14. Añada 3. Añada 36 μl (1/10) de acetato de sodio 3 M (pH 5. Remueva y descarte el supernadante y repita los pasos del 2-4 dos veces más.5 ml conteniendo 20 µl de 10 mM EDTA. 4. (1989) Amplifications 2: 1-3) 1. R. Use una pipeta de vidrio estéril para transferir el DNA precipitado a un tubo de 30 ml de 70%. Añada 1. Añada 1-5 µl de solución de DNA para 25 µl de reacción PCR.

05 µl) dH2O to 25 µl Extracción de DNA desde sangre entera por silica gel.5 mM each dNTP. DNA plásmido de E.5 µl 10x Perkin Elmer buffer. Con respecto a esto un enfoque parece muy atractivo a tratar la sangre entera con un reactive tal que simultaneamente lise la sangre y desnaturalice las partículas virales. Siendo aplicado a pruebas humanas tal procedimiento complicado lleva al personal de laboratorio a un riesgo elevado de ser infectado por SIDA.5 mM dNTP mezcla (2. Introducción Aquí presentamos elnuevo simple y economic procedimiento en el cual el DNA puro es extraído de sangre entera en 15-20 min. extracción con fenol y precipitación del DNA con alcohol. fue la razón de que extractos de DNA aparecieron contaminados por material rojo. Sin embargo. El uso del fuerte agente caotrópico GuSCN para lisar células humanas seguido de la adsorción de DNA en vidrio en polvo se describió por Boom (1) y Bush (2).2. la sangre entera representa una cierta dificultad para la extracción de DNA inmediata debido a la presencia de grandes cantidades de protein en la muestra. citomegalovirus asi como otros virus potencialmente presentes en la sangre. La gran variedad de adsorbentes de vidrio se ha reportado los últimos años para ser usados en la extracción de DNA desde varias fuentes. 200 µM final) 0. lisis con detergente. inhibiendo la amplificación de PCR. Asi.5 mM MgCl2 0. conteniendo ácidos nucleicos. hepatitis.1 mg/ml gelatina 0. Comprende la separación de la fracción de células blancas de la sangre entera. digestion con proteinasa.5 µl 20 µM reverse primer (0.45% (v/v) Nonidet P40 0.5 mM MgCl2 (final) 2 µl 2.4 µM final) 0.5 µl 20 µM forward primer (0.coli (3) y DNa genómico de células eucariótidas o procariótidas (1) podría ser traida. el aislamiento de fragmentos de DNA de gel de agarosa (4).45% (v/v) Tween 20 Autoclave para esterilizar y disolver la gelatina Almacene en congelación *Añada proteinasa K (60 µg/ml) inmediatamente previo a su uso) Reacción típica de 25 µl PCR: 1-5 µl DNA 2. 1. Esta aproximación emplea la habilidad de los adsorbents basados en vidrio de ligar ácidos nucleicos en altas concentraciones de sal y liberar a bajas. cuando intentamos aplicar . El procedimiento tradicional para el aislamiento de DNA de sangre es laborioso y consumidor de tiempo.1 µl Taq DNA polimerasa (puede decrecer a 0. La gran recuperación y la calidad del product son provistas por el uso del seleccionado adsorbente basado en video y la optimizada composición del lisado y de las soluciones de lavado.4 µM final) 0. Para referencia.

Reactivos • • • La composición de la solución de guanidina fue: 6 M GuSCN. centrifugue por 10 seg. Mezcle en un tubo de minicentrifugación de 2. tome el supernadante.5). Sin embargo. El lavado de propanol contenido de 25% iso-propanol. La calidad del DNA provee una confiable amplificación de PCR y restricción enzimática. 3.0).851-9) en 100 ml de solución de guanidina. Colecte silica gel por giro corto (3 seg. 9.5 ml de sangre entera (conteniendo 50 mM de EDTA como anticoagulante) con 1. 40 g/l Triton X-100 y 10 g/l DTT. 2. producto y calidad El tiempo total del procedimiento es 15-20 minutos. Remueva a fondo el etanol y seque la silica gel a vacío aplicando calor. Procedimiento 1. Peletice el adsorbente por giro corto (a 5000 g). 5000 g). Las muestras pueden ser almacenadas a temperatura del cuarto por meses sin problema de degradación. Después.0 ml de solución de guanidina por arremolinamiento. 100 mM NaCl y 10 mM Tris-HCl (pH 8.2 ml 0. 25% etanol. El tamaño del DNA es mayor de 50 kb. desarrollar un aparato automatizado para la extracción de DNA preferimos el concepto biomecanico basado en vidrio. Parámetro optimizados del procedimiento. 10 mM Tris-HCl (pH 6. La mezcla ligadora fue preparada por resuspendido de 4 g de silica gel (Aldrich. 10. todos los reactivos pueden ser almacenados a la temperatura del cuarto. Repita el lavado de la silica gel con la solución de guanidina. 20 mM EDTA. Tiempo. #28. 6. Eluya DNA a 65oC por 3 min.0 ml de mezcla ligadora. La ausencia de nucleasas es provista por la incubación por la noche del DNA a 37oC en presencia de 10 mM MgCl2.procedimientos de aislamiento de DNA basados en vidrio disponible directamente a la sangre entera. lave la silica gel con propanol de lavado (dos veces) y etanol puro (una vez) de la misma forma. El producto de DNA en el procedimiento es rutinariamente 40 ug por mililitro de sangre. composición mejorada de las soluciones de lavado junto con la nueva selección de adsorbente de vidrio resulto en un nuevo corto y económico protocolo el cual provee DNA de perfecta calidad para reacciones enzimáticas y análisis PCR. Parámetros del procedimiento . 7. 5. 8. Resuspenda la silica gel en 100 ul de buffer TE. 4. Incube a la temperatura del cuarto por 3 min. Resuspenda el emplacado en 1. que permitio la aplicación del procedimiento entero en un tubo. Resuspenda mezcla otra vez.

Los siguientes nuevos elementos han sido introducidos en el procedimiento con el fin de proveer una maxima productividad y calidad de DNA y eliminar de contaminantes el producto: 1.851-9) fue seleccionada como resultado de pruebas comparativas de adsorbentes basados en vidrio comerciales disponibles. La sal caotrópica de tiocianato de guanidina fue usada en combinación con el detergente no iónico Triton X-100 a 4% de concentración y el agente antioxidante DTT a 1% de concentración en solución de guanidina. La silica gel Aldrich (#28. 4. Iso-propanol y NaCl fueron incluidos en la composición de la solcuón del alcohol de lavado. . Los parámetros del procedimiento fueron sistematicamente optimizados para proveer los requerimientos dichos. 3. 2.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful