Cinética enzimática

(principios)

ITESM Campus Toluca

Escuela de Ingeniería y Ciencias
Depto. de bioingeniería
IBT Juan Jesús Cruz Maldonado
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Quiz!
https://create.kahoot.it/share/bt2005-cinetica-enzimatica-
principios/03aa0e96-e2ce-4bd3-aa7c-2727f39040cf
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Bases moleculares de la acción enzimática

• Desde un punto de vista termodinámico, las reacciones bioquímicas
pueden ser exergónicas (espontáneas, 𝛥𝐺 < 0) o endergónicas (no
espontáneas, 𝛥𝐺 > 0).

¿Que una reacción sea espontánea o no nos indica qué

tan rápido se llevará a cabo?
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Bases moleculares de la acción enzimática

𝐶6 𝐻12 𝑂6 + 6𝑂2 → 6𝐶𝑂2 + 6𝐻2 𝑂 Δ𝐺 = −2870 𝑘𝐽

No, el valor/signo de no Δ𝐺 nos dice mucho acerca de la velocidad de una reacción!

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Bases moleculares de la acción enzimática

¿Qué impide que una molécula se convierta a otra (a pesar de que la
reacción sea espontánea)?
¿Cómo aceleramos una reacción?
• Energía de activación (Ea):
Energía necesaria para que el
sustrato alcance un estado de
transición previo a la
formación del producto.

• La reacción se puede acelerar:

aumentando la temperatura o
reduciendo Ea
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Bases moleculares de la acción enzimática

• El uso de enzimas por parte de organismos vivos les permite realizar
reacciones bioquímicas a la velocidad suficiente para mantener la
homeostasis.

• Las enzimas solo aceleran la reacción sin cambiar el equilibrio de la

misma
𝑘1 = 10−3 min−1 𝑘1
Sin catalizador 𝐾𝑒𝑞 = = 100
𝑘−1
𝑘1 𝑘−1 = 10−5 min−1
𝑆 ⇌𝑃
𝑘−1

Con catalizador
(velocidad aumenta 10,000 veces)
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Bases moleculares de la acción enzimática

• ¿Para qué tener una gran estructura protéica si solo 2 ó 3
aminoácidos participan en la catálisis?

• Mantener la disposición espacial

requerida

• Estabilización del sustrato

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(Alberto et al., 2004)

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Bases moleculares de la acción enzimática

• Para que la enzima lleve cabo la reacción es
necesario que:

1. El sustrato y el sitio activo entren en contacto

2. Las condiciones ambientales sean propicias

(Temperatura, pH, fuerza iónica)

3. No haya otras moléculas que impidan la unión

del sustrato al sitio activo (inhibidores)
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Equilibrio enzima-sustrato 𝐾𝑑 : Cte. de disociación

𝐸: Enzima libre
𝑘1
• La reacción: 𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 𝑆: Sustrato libre
𝐸𝑆: Complejo enzima sustrato
𝑘−1

𝑘−1 𝐸 𝑆
• Relacionando: 𝐾𝑑 = =
𝑘1 [𝐸𝑆]

• Considerando el balance de la enzima:

𝐸 𝑇 = 𝐸 + 𝐸𝑆
• Por lo tanto:
𝐸𝑇 𝑆
𝐸𝑆 =
𝐾𝑑 + 𝑆
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Equilibrio enzima-sustrato 𝐾𝑑 : Cte. de disociación

𝐸: Enzima libre
• La concentración de 𝐸𝑆 depende completamente de 𝑆 y de 𝐾𝑑 . 𝑆: Sustrato libre
𝐸𝑆: Complejo enzima sustrato
• Cuando 𝑆 está en bajas concentraciones 𝐸𝑆 aumenta de forma
lineal. 𝑘1
𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆
• Conforme 𝑆 aumenta 𝐸𝑆 se vuelve constante y tiende a 𝐸 𝑇 𝑘−1

𝐸𝑇 𝑆
𝐸𝑆 𝐸𝑆 =
𝐾𝑑 + 𝑆

𝑆
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Catálisis enzimática
• Consideremos una reacción enzimática simple de la forma:
𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 ⇌ 𝐸 + 𝑃
• Donde 𝐸 es la enzima, 𝑆 el sustrato, 𝑃 el producto y 𝐸𝑆 el complejo
enzima-sustrato

¿Cómo describir esta reacción en forma

matemática?
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Catálisis enzimática
• Consideraciones: 𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 ⇌ 𝐸 + 𝑃
a) 𝐸 y 𝑆 reaccionan rápidamente para formar 𝐸𝑆
b) 𝐸, 𝑆 y 𝐸𝑆 están en equilibrio. La velocidad de disociación
de 𝐸𝑆 hacia 𝐸 y 𝑆 es más rápida que hacia 𝐸 y 𝑃
c) La concentración de sustrato es mayor a la de la enzima 𝑆 ≫ 𝐸 𝑇
d) La velocidad de reacción está limitada por la disociación de 𝐸𝑆 a 𝐸 y 𝑃
e) La velocidad es medida en los primeros instantes de la reacción.
Reacción inversa es nula o poco significativa
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Ecuación de Henri-Michaelis Menten

(Equilibrio rápido)
𝑘1 𝑘𝑃 𝐾𝑆 𝑘𝑃
1. Reacción general: 𝐸 + 𝑆 ⇌
𝑘
𝐸𝑆 ⇌ 𝐸 + 𝑃 𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃
−1

2. Balance de materia (enzima): 𝐸 𝑇 = 𝐸 + 𝐸𝑆

3. Ecuación de velocidad: 𝜐 = 𝑘𝑃 𝐸𝑆

𝑘−1 𝐸 [𝑆]
4. Relación de equilibrio: 𝐾𝑆 =
𝑘1
=
𝐸𝑆

𝜐𝑚𝑎𝑥 𝑆
𝜐= Ecuación de Henri-Michaelis
𝐾𝑆 + 𝑆 Menten
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Ecuación de Henri-Michaelis Menten

(Equilibrio rápido) 𝑘 𝐸 [𝑆] −1
𝐾𝑆 = =
𝑘1 𝐸𝑆
• 𝐾𝑆 es una cte. de equilibrio y es una medida
de la afinidad por el sustrato
𝜐 = 𝑘𝑃 𝐸𝑆 𝜐𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑃 𝐸 𝑇

• 𝜐𝑚𝑎𝑥 es la velocidad máxima de reacción, 𝜐

alcanzada a altas concentraciones de
sustrato

• 𝑘𝑃 es la constante cinética de reacción,

también se le puede escribir como 𝑘𝑐𝑎𝑡 𝜐=
𝜐𝑚𝑎𝑥 𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆
𝑆
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Orden de reacción de la
Ec. de H-MM
De acuerdo a la región en la gráfica:

• 1er orden: 𝐾𝑚 ≫ 𝑆 𝜐𝑚𝑎𝑥 𝑆

𝜐= = 𝑘[𝑆] 𝜐
𝐾𝑆

• Orden cero: 𝐾𝑚 ≪ 𝑆 𝜐𝑚𝑎𝑥 𝑆

𝜐= = 𝜐𝑚𝑎𝑥
[𝑆]
𝜐𝑚𝑎𝑥 𝑆
𝜐=
𝐾𝑆 + 𝑆

𝑆
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Cinética enzimática
• A la gráfica de 𝜐 vs [𝑆] se le conoce como “cinética enzimática”
De forma experimental ¿Cómo podemos hacer una cinética enzimática?

Caso específico: Invertasa EC 3.2.1.26

Sacarosa → Glucosa + Fructosa
S→P 𝜐𝑚𝑎𝑥 𝑆
𝜐=
𝐾𝑆 + 𝑆
𝑆
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Cinética enzimática (curvas de progreso)

• Una curva de progreso nos indica el cambio en la
concentración de el sustrato o el producto respecto al
tiempo

• Utilizar el sustrato o el producto como analito

depende del método de detección
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Cinética enzimática (curvas de progreso)

• El cambio del producto o el sustrato respecto al
tiempo nos dará una medida de la velocidad
𝑑𝑆 𝑑𝑃
− = =𝜐
𝑑𝑡 𝑑𝑡
• Sin embargo, nos interesa la velocidad inicial, ya que
posteriormente la velocidad decrecerá conforme
el sustrato se termine

𝑑𝑆 𝑑𝑃
− = = 𝜐0
𝑑𝑡 𝑑𝑡
20

• Se obtienen una serie de datos de 𝜐0 a diferentes

concentraciones de sustrato (𝑆)

𝑆
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• Se obtienen una serie de datos de 𝜐0 a diferentes

concentraciones de sustrato (𝑆)

• Se grafican en la forma ya establecida

𝜐

𝜐𝑚𝑎𝑥 𝑆
𝜐=
𝐾𝑆 + 𝑆
𝑆
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Ejercicio
• Se ha realizado un ensayo enzimático de invertasa con sacarosa (10 mg/mL)
como sustrato. Con base en los resultados obtenidos determine:

P t
[mg/mL] [mins]
0.278 0
a) Obtenga la curva de progreso
0.441 0.5
0.689 1
1.465 1.5 b) Calcule la velocidad inicial 𝜐0
1.566 2
2.851 3
3.841 4
4.757 5 c) (Extra, 1pto) Estime el valor de 𝜐𝑚𝑎𝑥 y 𝐾𝑆 para
5.565
6.251
6
7
las condiciones del ensayo
6.767 8
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𝑚𝑔𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜
𝜐0 = 1.0111
𝑚𝐿 𝑚𝑖𝑛

𝜇𝑚𝑜𝑙𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜
𝜐0 = 5.612
𝑚𝐿 𝑚𝑖𝑛

𝜇𝑚𝑜𝑙𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜
𝜐max (𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜) = 7193 𝑚𝐿 𝑚𝑖𝑛
Resultados inciso extra
𝐾S (𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜) = 8.64 𝑚𝑀
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Tarea
Investigue con base en las siguientes preguntas:

• ¿Qué son los ensayos enzimáticos?

• ¿En qué consiste el ensayo de Bradford para cuantificación de proteínas?
• ¿Qué es y como está definida una unidad internacional de actividad
enzimática?
• ¿De qué forma se puede cuantificar la actividad enzimática?
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Referencias
1. Copeland, R. A. (2000) Enzymes: A practical introduction to structure,
mechanism and data analysis (2nd Edition). Wiley
2. Segel, Irwin H. (1993) Enzyme kinetics: Behavior and analysis of rapid
equilibrium and steady-state enzyme systems (2nd Edition). Wiley
3. Alberto, F., Bignon, C., Sulzenbacher, G., Henrissat, B., & Czjzek, M. (2004).
The Three-dimensional Structure of Invertase (β-Fructosidase) from
Thermotoga maritima Reveals a Bimodular Arrangement and an
Evolutionary Relationship between Retaining and Inverting Glycosidases.
Journal of Biological Chemistry, 279(18), 18903–18910.
https://doi.org/10.1074/jbc.M313911200
4. Reed, G., & Nagodawithana, T. (Eds.). (1995). Biotechnology: Enzymes,
biomass, food and feed (2nd ed.,Vol. 9).VCH.