Biotecnología

Prof. Titular: Ing. Fuentes Berazategui, Jorge

Prof. Adjunto: Ing Da Silva, Stela Maris

J.T.P.: Ing. Puglisi, Ricardo Jorge

Albanes Leonel, Paula Luffi, Cristian García, Albanes Ezequiel,

Elizondo Exequiel.
1) Describa el procedimiento para preparar un medio de cultivo.

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensable para el

crecimiento de los microorganismos. Estos pueden prepararse a partir del añadido de agua a
medios de cultivos deshidratados ofrecidos comercialmente o prepararse con todos los
compuestos orgánicos e inorgánicos. Para la preparación de un medio de cultivo se realiza lo
siguiente:

1.- Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte
de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las
instrucciones del fabricante o del profesor, añadir la cantidad de agua adecuada para
conseguir la concentración deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante
(agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullición del mismo agitando de vez en
cuando, para asegurar un completa disolución del agar.

2.- Esterilizar la disolución: Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el
crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el
procedimiento será diferente.

3.- Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir con el papel de aluminio. Llevar a
esterilizar al autoclave 121 ºC durante 15 -20 minutos. Una vez estéril repartir en placas Petri
estériles y dejar en reposo para que solidifique.

2) Método de aislamiento de microorganismos en caja Petri mediante agotamiento por

estriado.

Este es un buen método para el aislamiento de colonias (obtención de colonias

aisladas); mediante esta técnica buscamos obtener colonias separadas a partir de un inóculo.
Para su realización se toma una caja Petri en la palma de la mano, de forma ligeramente
inclinada, con la mano contraria se manipula el asa redonda previamente esterilizada por
flameado directo a la llama y con ella se recoge el material del cultivo, para colocarlo en un
área periférica de la caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inóculo. El asa
debe ser nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar (procurando no dañarlo) , a
continuación se realiza una estría partiendo del final de la estría anteriormente realizada y
arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de la superficie
del agar. Se debe procurar en cada sección de la caja, las estrias queden trazadas con mayor
separación. Y por último se vuelve a flamear el asa y se realiza otra estría desde el final de la
segunda estría realizada. Es importante recordar flamear y enfriar el asa cada vez que culmine
una estría y solo tocar con el asa la estría inmediatamente anterior, con el objetivo de ir
disminuyendo la carga microbiana arrastrada por la argolla. Finalmente se esteriliza el asa
antes de descartarla.

3) Describa el procedimiento que útilizo para recuperar un cultivo puro y conservarlo en

medio sólido.

Al retirar la caja Petri de la estufa de cultivo, como era de esperarse se formó una gran
cantidad de microorganismos que abarcaba por completo el primer y segundo cuadrante por
completo.
 Con anterioridad se prepararon medios de cultivo en tubos de ensayo en forma de pico
de flauta. El procedimiento consiste en que una vez preparado y esterilizado el medio de
cultivo sólido, se distribuye en tubos estériles. Se llenan 2/3 partes del tubo para tener mayor
superficie de siembra y evitar derrames. Se tapan y colocan en posición inclinada hasta
solidificación, obteniéndose como un pico de flauta en el tubo.

Las colonias obtenidas en el tercer cuadrante al estar perfectamente separadas entre

sí consideramos que proviene de un único microorganismo por lo que son un cultivo puro.
Para recuperar este cultivo puro y conservarlo, tomamos la colonia con el ansa del anillo y
hacemos un estriado en el pico de flauta comenzando desde el final del tubo hacia la boquilla.
Tapamos el tubo y llevamos a la estufa de cultivo a la temperatura adecuada para que el
microorganismo objeto de estudio se desarrolle y tener disponibilidad del mismo para futuros
ensayos y cultivos.

4) Explique en qué consiste la operación unitaria de liofiliación y cómo puede emplearse en

la conservación de los cultivos microbianos.

Es un método de conservación a largo plazo. Se basa en paralización del metabolismo

celular por falta de agua: congelación y sublimación.

Es el método más empleado para el mantenimiento de colecciones de cultivo. Se ha

usado para muchas bacterias y virus reteniendo la viabilidad hasta 50 años. Consiste en una
congelación y posterior desecación al vacío (el agua sublima a baja presión).

Para evitar los daños del frío, se usan crioprotectores como la leche y la albúmina.
Aquí el cultivo se centrifuga y el sedimento se suspende en una solución crioprotectotora y se
congela con nieve carbónica, a continuación se hace sublimar el agua.

Una vez desecado, la ampolla se cierra a la llama, manteniendo el vacío. Para evitar su
oxidación, se llena de nitrógeno y después se guarda a 4 ºC o a temperatura ambiente.

Para recuperar los microorganismos, rompemos la ampolla, adicionamos medio fresco

e incubamos los viales a una temperatura adecuada. Para probar si la cepa es pura, se
disemina o siembra una muestra.

5) Describa brevemente un microscopio óptico y su empleo.

Un microscopio es un instrumento que nos permite observar elementos vivos o no de

tamaño demasiado pequeño para ser vistos a simple vista.

Los microscopios básicamente se componen de una o varias lentes que permiten

obtener una imagen aumentada del objeto y que funcionan por refracción. Por lo tanto se
considera, que los microscopios cuentan con dos secciones, una óptica, que sirve para
observar, y la otra que es una parte mecánica que sostiene la primera.

Sistema óptico:

-OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.

-CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación

-DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador

-FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador

Sistema mecánico:

-SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

-PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.

-CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular.

-REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite al girar cambiar los objetivos.

TORNILLO DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue

el enfoque correcto.

Los microscopios pueden ser utilizados en distintas áreas, como: Laboratorios clínicos,
hospitales, industria farmacéutica, industria biológica, industria alimenticia.

6) Describa cómo realizar la observación en fresco de microorganismos.

Consiste en observar elementos vivos, al estado fresco. Es vital cuando se hace sobre la
célula en el organismo o en el medio, por ejemplo protozoos en agua dulce, organismos
pluricelulares transparentes. Es supravital cuando se examinan células extraidas del organismo
como: sangre o tejido y se depositan sobre un portaobjetos con una gota de solución
fisiológica. Permite conocer forma y movimiento de las células. Pueden utilizarse colorantes
que no tengan efecto nocivo sobre las célula, para ello se emplean en alta dilución y se
denomina coloración vital. Se puede observar el núcleo, citoplasma, mitocondrias, centríolo y
comportamiento de la membrana.
 A partir de cultivos en medio líquido se procede de la siguiente forma: cargar el asa
bacteorológica con una gota de cultivo y depositarla en porta objetos limpio. Colocar un cubre
objetos procurando que no queden atrapadas burbujas de aire. Si la cantidad de cultivo que
recoge el asa es muy pequeña se carga 2 ó 3 veces.

A partir de cultivos en medios sólidos: en primer lugar se procede a colocar una gota
de agua en el portaobjetos limpio. A continuación se carga el asa con una pequeña cantidad de
bacterias de una colonia de cultivo y se resuspende en la gota de agua. Colocar el
cubreobjetos. La preparación se observa al microscopio pudiendo determinar su morfología
(cocos o bacilos) al igual que su movilidad.

7) Describa el procedimiento para realizar la observación de microorganismos por coloración

simple. Mencione ventajas y desventajas.

Procedimiento de coloración simple.

1. Extender una gota de suspensión microbiana sobre un portaobjetos mediante un ansa.

2. Secar suavemente pasando el porta objetos sobre un mechero.
3. Una vez seco, pasarlo 3 ó 4 veces por la parte amarilla de llama.
4. Extender una gota de colorante (violeta de geneciana).
5. Dejar actuar un minuto.
6. Retirar el exceso de colorante mediante lavado suave con agua de la canilla.
7. Observar en el microscopio.

Fundamento de la coloración.

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver
con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el
medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de
colorantes. Estos pueden utilizarse para distinguir entre tipos diferentes de células o para
revelar la presencia de distintos constituyentes celulares tales como flagelos, esporas,
cápsulas, paredes celulares y centros de actividad respiratoria.

Las células son generalmente tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación, si se añade el colorante no se producen cambios estructurales en la
célula. La coloración produce habitualmente el encogimiento de las células ; la tinción por el
contrario, hace que las células aparezcan mayores de lo que realmente son, de manera que la
medida de las células que han sido fijadas o teñidas no puede realizarse con mucha precisión.

Ventajas de la coloración:

 Aumenta el contraste microorganismo-medio lo que nos permite distinguir las células

del medio y entre los distintos tipos de células.
 Al aumentarse el tamaño de las células resulta más fácil su visualización.

Desventajas de la coloración:
  Al variar el tamaño de las células en la tinción y en la fijación no se obtienen datos
precisos acerca del tamaño real de las mismas.
 No se observan todas las bacterias por ejemplo las Gram negativas.

9) Dibuje algunos de los microorganismos observados y de serle posible adjunte fotografías

tomadas durante la realización del TP.

Realizar un informe describiendo el cultivo utilizado para la observación y lo observado.

El cultivo utilizado para la observación fue una solución acuosa de queso roquefort,
debido a que el agua que originalmente trajimos para la observación era muy clara y carecía
muy probablemente de microorganismos, además se realizó la observación de unas hojas de
coca fermentadas en agua.

Ambas muestras se las llevó a un medio de cultivo en una caja de Petri y al cabo de la
otra semana de realizada la experiencia se observó una mancha blanca algodonosa levemente
azulada en el caso del queso roquefort y una mancha negra en el caso de las hojas de coca
fermentadas. Estas colonias fueron luego las utilizadas para realizar la siembra en el pico de
flauta y para realizar la tinción. Las imágenes de lo observados se muestran anteriormente

Realizar esquemas de las colonias y microorganismos observados.