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BACTERIOLOGIA MEDICA I
CUARTO SEMESTRE
RESPOSABLE:
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PRESENTACIÓN
Este manual fue elaborado para los estudiantes del cuarto semestre de la carrera
de Químico Biólogo Parasitólogo, con el objetivo de dar los elementos teórico-prácticos
necesarios para el aislamiento e identificación de bacterias patógenas buscadas
rutinariamente en diversas muestras biológicas, que permitan el diagnóstico clínico y de
laboratorio de las enfermedades infecciosas.
El manual incluye prácticas de laboratorio que permite conocer las características
morfológicas, medios de cultivo y pruebas bioquímicas que permiten la identificación de
las bacterias más comúnmente aisladas en el laboratorio clínico. En cada práctica se
describen la competencia que se persigue, los aspectos teóricos que se consideran
importantes e indispensables para el diagnóstico, el material necesario, el procedimiento y
la manera de reportar los resultados.
Las prácticas se han organizado de acuerdo al programa de la materia de
Bacteriología Médica I y su diseño en función de los recursos con que cuenta el
laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la
Universidad Autónoma de Guerrero, que son similares a los de los laboratorios que
existen en nuestro Estado.
Además cuenta con un anexo para la interpretación de pruebas bioquímicas
indispensables en la identificación, instrucciones para la preparación de reactivos,
colorantes, medios de cultivos y tinciones. Por ello considero que este manual es un
apoyo importante en las prácticas profesionales en el laboratorio clínico.
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Todo el personal debe utilizar siempre Bata de manga larga hasta la altura de la rodilla y
cerrada, esta debe ser considerada como material contaminado, lavarse las manos
periódicamente; cada vez que entren en contacto con material infeccioso y siempre que
se haga abandono del área del laboratorio. Se debe evitar tocarse, frotarse o rascarse
mientras se permanezca en el laboratorio.
El material infeccioso, como muestras clínicas y cultivos microbianos, deben estar
adecuadamente rotulados, indicando en forma precisa el contenido del recipiente y deben
ser descontaminados antes de ser descartados. Todos los procedimientos deben ser
realizados muy cuidadosamente de manera que se reduzca al máximo la formación de
aerosoles. Los aerosoles pueden ser producto de la abertura de placas de Petri o
contenedores de material infeccioso, la inoculación de una muestra clínica o un cultivo,
manipulación de pipetas, centrifugaciones o la esterilización a la llama de las asas
bacteriológicas.
Está prohibido pipetear con la boca y comer, beber, maquillarse o fumar en el área de
laboratorio, así como almacenar o preparar alimentos para consumo humano. Igualmente,
todos los artículos personales deben permanecer fuera del área de laboratorio.
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Los accidentes en el laboratorio deben ser abordados con calma y ser debidamente
reportados, en caso de ocurrir un derrame de material infeccioso, se debe despejar la
zona y usando guantes, se debe colocar un papel absorbente impregnado con un
desinfectante (alcohol 70º-yodado) sobre el material. Si cae material contaminado sobre
su piel, se debe proceder a desinfectar utilizando alcohol 70º-yodado, para luego lavar
abundantemente con agua y jabón y aplicar nuevamente la desinfección. Si se presenta
una contaminación de los ojos, proceda a enjuagar abundantemente con agua. En caso
de presentarse un incendio se debe utilizar un extintor para fuegos tipo ABC y si una
persona en el laboratorio se está incendiando, se le debe cubrir con una bata mojada para
apagar las llamas.
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
ÍNDICE
Número Título Págs.
1 Morfología colonial, tinción de Gram y uso del microscopio………… 10
2 Estafilococos (Staphylococcus)………………………………………… 14
3 Estreptococos (Streptococcus)………………………………………… 19
4 Morfología colonial de Enterobacterias………………………………… 26
5 Identificación Bioquímica de Enterobacterias. ………………………… 29
6 Identificación de Enterobacterias mediante sistemas miniaturizados
API 20E. …………………………………………………………………… 31
7 Bacilos Gram negativos no fermentadores…………………………….. 34
8 Bacilos Gram negativos oxidasa positivos y fermentadores de
lactosa……………………………………………………………………… 37
9 Género: Haemophilus spp……………………………………………….. 40
10 Bacilos Gram positivos (Bacillus subtilis y listeria spp)………………... 43
11 Corinebacterias o exudado faríngeo…………………………………… 49
12 Bacilos Gram positivos poco frecuente (microaerofílicas)……………. 51
13 Género: Neisserias saprofitas…………………………………………… 56
14 Bacterias Anaerobias……………………………………………………… 59
15 Tinción de Ziehl Neelsen ………………………………………………… 62
Anexo1 Instrucciones para preparar reactivos y colorantes…………………… 64
Anexo2 Nefelómetro de McFarland……………………………………………… 66
Anexo 3 Tinciones…………………………………………………………………… 67
Anexo 4 Preparación de medios de cultivo……………………………………….. 68
Anexo 5 Interpretación de Pruebas Bioquímicas………………………………… 81
Referencias Bibliográficas……………………………………………… 92
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
COMPETENCIAS
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Los residuos peligrosos biológicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que
se generan durante las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en
los centros de salud, laboratorios clínicos o de investigación, bioterios, centros de
enseñanza e investigación, principalmente; que por el contenido de sus componentes
puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.
Los desechos deben ser identificados inmediatamente, después del procedimiento que
los generó, en el sitio donde se originaron y por el personal que lo generó. Para su
correcta identificación y posterior envasado, la separación de los residuos se debe
realizar de acuerdo a su estado físico (líquido y sólido), y su tipo como se indica a
continuación:
ESTADO
TIPO DE RESIDUO ENVASADO COLOR
FÍSICO
Sangre Líquido Recipientes Herméticos Rojo
Cultivos y Cepas de Agentes
Sólido Bolsa de Plástico Rojo
Infecciosos
Residuos No Anatómicos Sólido Bolsa de Plástico Rojo
Patológico Sólido Bolsa de Plástico Amarillo
Patológico Líquido Recipientes Herméticos Amarillo
Objetos Punzocortantes Sólido Recipientes Rígidos Rojo
Los RPBI deben estar marcados con el símbolo universal de residuo peligroso-
biológico-infeccioso. Los recipientes deben permitir verificar el volumen máximo de su
capacidad. Todo aquel material que se considere RPBI deberá estar de acuerdo a su
tipo en una bolsa o recipiente de color específico, según lo indica la norma.
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Con los cambios en la norma no se consideran RPBI los siguientes: Torundas y gasas
con sangre seca o manchadas de sangre, Material de vidrio utilizado en laboratorio
(matraces, pipetas, cajas de Petri), Muestras de orina y excremento para análisis de
laboratorio, Tejidos, partes del cuerpo en formol.
Para lograr la desinfección se colocan las bolsas rojas resistentes al calor húmedo y
bien cerradas, en el autoclave a 121° centígrados con 15 libras de presión durante 30
minutos, en este caso las cajas de Petri desechables y otros dispositivos de plástico
utilizados en el laboratorio quedan “irreconocibles” (Perdida de las características
físicas y biológico-infecciosas del objeto para no ser reutilizado). Una vez estériles e
irreconocibles se podrán disponer como basura común.
El autoclave utilizada para el tratamiento de los RPBI no puede ser utilizada para
esterilizar otros instrumentos médicos, por lo que se recomienda ubicar un sitio
especial para instalar el autoclave sólo para el tratamiento de estos residuos, una
sugerencia es colocarlo dentro del mismo almacén temporal exclusivo para RPBI.
Los RPBI que hayan sido tratados podrán disponerse en los camiones recolectores de
basura común, mientras que los RPBI sin tratamiento deberán enviarse a empresas
recolectoras autorizadas.
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PRACTICA No. 1
MORFOLOGIA COLONIAL, TINCIÓN DE GRAM Y USO DEL MICROSCOPIO
HABILIDADES:
- El estudiante diferencia las características morfológicas macroscópicas y
microscópicas de las bacterias mediante tinción de Gram y el manejo del microscopio,
tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-
Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico
OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-
Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de
manejo.
INTRODUCCIÓN
Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en muestras
clínicas. También se emplea como primer paso la diferenciación bacteriana a través de la
visualización morfológica de una colonial, el examen con microscopio óptico de
preparación con tinción de Gram de manera rutinaria para determinar la forma de las
bacterias, las formas comunes como los cocos (esféricas), bacilos (alargadas) y formas
de espiral
Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los
microorganismos Gram positivos se tiñen de color violeta o morado mientras que
aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos
espira lados se tiñen de rojo y se dice que son Gram negativos.
Las aplicaciones más comunes de la coloración de Gram son las siguientes:
La presencia de cocos Gram positivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas
sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos
La presencia de diplococos Gram negativos son características de especies de
Neisseria
Los bacilos Gram positivos grandes sugieren especies de Bacillus o Clostridium, los
bacilos Gram positivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes
(difteroides)
Los bacilos Gram negativos son las bacterias más comunes halladas en los
laboratorios clínicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies
de Haemophilus.
El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena
orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y
también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar
un tratamiento inicial.
MATERIAL
Equipo y materiales: Microscopio y material propio del laboratorio de microbiología.
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Biológicos: Cultivo bacteriano de 24 horas en caja de Petri con división de tres con
colonias asiladas de: Staphylococcus spp, Enterobacterias (diferentes por equipo una por
equipo), Bacillus subtilis y Neisseria spp.
PROCEDIMIENTO
1. En un portaobjetos, hacer cuatro frotes de los diferentes grupos bacterianos
proporcionados.
2. Teñir con Gram
RESULTADOS
1. Describir la morfología Microscópica de cada cepa.
- Enterobacterias
- Staphylococcus
- Bacillus
- Neisseria
HAGA LA DISCUSIÓN E INTERPRETACION DE RESULTADOS Y ENSEGUIDA LA
CONCLUSIÓN.
MORFOLOGÍA COLONIAL
(CARACTERÍSTICA MACROSCOPICAS DE LA COLONIA EN PLACA DE AGAR)
1. TAMAÑO. (mm)
2. FORMA.
3. ELEVACIÓN
4. MARGEN O BORDE
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
5. COLOR. Blanco, amarillo, naranja, rosa, gris, cremosa, rojo ladrillo, beige, otros.
6. SUPERFICIE. Lisa, rugosa o granular
7. ASPECTO. Húmedo o seco
8. LUZ REFLEJADA. Brillante o mate (que no brilla)
9. LUZ TRANSMITIDA. Translúcida (transparente) u opaca
10. CONSISTENCIA.
- SUAVE. Viscosa, mucosa, butirosa (mantequillosa) o membranosa
- DURA. Seca, quebradiza o friable (que se rompe con facilidad)
Esta última característica, se determina tocando la colonia con el asa de siembra o aguja de
inocular por lo tanto debe ser la última en describirse.
TECNICA DE GRAM.
1. Hacer un frotis de una de las cepas proporcionadas, secar al aire y fijarla al calor.
2. Colocar el frotis sobre un puente para tinción.
3. Cubrir el frotis con CRISTAL VIOLETA DURANTE 1 MINUTO.
4. Escurrir el colorante y lavar la preparación con un chorro suave de agua corriente.
(Utilice las pinzas para sostener el portaobjetos).
5. Cubrir la preparación con LUGOL DURANTE 1 MINUTO.
6. Escurrir y lavar con un chorro suave de agua corriente.
7. Sostener el portaobjetos con las pinzas y bañar la superficie con unas gotas de
DECOLORANTE (ALCOHOL-ACETONA) hasta no arrastrar más colorante violeta.
Esto requiere habitualmente entre uno 5 A 15 O MAS SEGUNDOS
8. Lavar con un chorro suave de agua y colocar nuevamente el portaobjetos en el puente
para tinción.
9. Cubrir la preparación con SAFRANINA DURANTE 1 MINUTO
10. Lavar la preparación con agua corriente, escurrir y dejar secar al aire, colocando el
frotis en posición vertical.
11. Examinar la preparación al microscopio con el objetivo 100 X, utilizando aceite de
inmersión.
LITERATURA CITADA
- Manual de prácticas de laboratorio de Microbiología General (2004). Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas, IPN, México, DF.
- Pelczar, M.J.Jr., R.D. Reid y E.C.S. Chan., Microbiología, (2004) 4a. de. MacGraw-Hill-Book,
Company, Nueva York.
- Jawetz, Melnick y Edelberg. (2001). Microbiología Médica. El Manual moderno, México, DF.
- Ramos, D., Gamazo., López. Manual de Prácticas de Microbiología. (1999). Ed. Masson.
Barcelona.
- Ramírez G. RM., Luna M.B., Velázquez M.O., Vierna G.L, et al. (2000). Laboratorio de
Microbiología Experimental. Fac. de Química, UNAM. México, D.F.
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Método
a) Extensión: En un porta bien limpio (con alcohol y flameado) se coloca una gota de agua destilada a
la que. con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequeña cantidad de
suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia. Con el asa se extiende la gota y las bacterias
sobre el porta, se deja secar completamente al aire y se fija la extensión por el calor, calentando
suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PRACTICA No. 2
ESTAFILOCOCOS (Staphylococcus)
HABILIDADES
Reconoce las características morfológicas, fisiológicas y metabólicas de las
principales especies de Staphylococcus comúnmente aisladas en el laboratorio de
microbiología, tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección
personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico
OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-
Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
INTRODUCCIÓN
Los estafilococos son cocos Gram positivos, no móviles, que no forman esporas,
catalasa positiva. Estos microorganismos se acomodan como células simples, en pares,
en tétradas y en cadenas cortas, pero aparecen en forma predominante en grupos como
racimos. La mayoría de las especies son anaerobios facultativos, generalmente no
presentan cápsula, crecen fácilmente en altas concentraciones de sal y muchas cepas
son hemolíticas.
Los estafilococos se encuentran generalmente en la piel y las mucosas del hombre
y otros animales. El género Staphylococcus actualmente se ubica dentro de la familia
Staphylococcaceae. El género Staphylococcus está compuesto por 35 especies, muchas
de las cuales se pueden encontrar en muestras clínicas humanas. Algunos de los
estafilococos patógenos tanto para los seres humanos como para animales producen la
enzima llamada coagulasa, cuya detección se usa en el laboratorio para identificar a estos
microorganismos. La especie patógena más importante es S. aureus, responsable de casi
todos los casos de enfermedad en los seres humanos, S. epidermidis causa
generalmente lesiones cutáneas y S. saprophyticus, especie que puede producir
infecciones en vías urinarias.
S. aureus produce una gran variedad de procesos infecciosos que van desde
infecciones cutáneas relativamente benignas hasta enfermedades sistémicas
potencialmente fatales. Las infecciones cutáneas incluyen foliculitis simple y el impétigo,
así como forúnculos y carbuncos. Entre las infecciones más graves tenemos la
septicemia, endocarditis, meningitis, sepsis puerperal, neumonía, osteomielitis,
infecciones en vías urinarias entre otras. S. aureus posee varios factores de virulencia que
contribuyen a su capacidad de producir enfermedad, entre los que se incluyen:
polisacáridos capsulares, peptidoglucano y ácidos teicoicos de la pared celular, la proteína
A, varias enzimas (catalasa, hiluronidasa, lipasas, firinolisinas, coagulasa, nucleasas),
hemolisinas y toxinas que pueden actuar como superantígenos.
Anteriormente los estafilococos coagulasa negativos (ECN) se consideraban
contaminantes de poca importancia clínica, sin embargo en las últimas dos décadas estos
microorganismos se han reconocido como agentes importantes de enfermedades
humanas, principalmente como patógenos nosocomiales.
Para la recuperación de estafilococos, las muestras clínicas se deben inocular en
agar sangre de carnero y otros medios bacteriológicos selectivos como el agar sal y
manitol y el medio estafilococo 110. Las colonias de estafilococos en agar sangre tienen
de 1 a 2 mm de diámetro, presentan un aspecto mate y son marcadamente convexas con
bordes enteros. Algunas cepas producen pigmento y son amarillas, rosadas anaranjadas
o pardas, en tanto que otras son de color blanco sucio o blanco hueso. Algunos S. aureus
y algunas especies coagulasa negativas pueden tener una zona evidente o difusa de -
hemólisis alrededor de las colonias.
Los estafilococos se diferencian estreptococos por la prueba de catalasa. Se
dispone de varios métodos para la diferenciación de especies de Micrococcus y
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
estafilococos, los dos géneros catalasa positiva. La prueba más sencilla es la sensibilidad
a la bacitracina (0.04 unidades), los estafilococos son resistentes y crecen hasta el borde
del disco, en tanto los micrococos y las especies relacionadas son susceptibles y
producen halos de 10 mm o mayores.
La característica aislada más confiable para identificar S. aureus es la prueba de
coagulasa, se pueden hacer pruebas confirmatorias adicionales como la
desoxirribonucleasa, endonucleasas termoestable y fermentación de manitol. La
identificación bioquímica de los estafilococos coagulasa negativos emplea una gran
batería pruebas fisiológicas y bioquímicas. Actualmente se dispone de varios sistemas
comerciales para la identificación de ECN.
MATERIAL:
- Cultivo bacteriano de 24 horas con crecimiento masivo de diferentes especies de
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus
Reactivos:
- Colorantes para tinción de Gram
- Solución salina estéril
- Peróxido de hidrogeno 3%,
- Plasma humano o de conejo,
- Discos de novobiocina,
Equipo y Materiales varios:
- Hisopos estériles
- Microscopios
- Incubadora a 37º C
- Mecheros
- Aceite de inmersión
- Papel seda para lentes
-
MATERIAL TRAIDO POR EL ALUMNO O POR EQUIPO:
- Asa y portasa - Alcohol
- Portaobjetos - Cuadros de algodón
- Lápiz con punta de diamante - Cerillos
- Pinzas de disección - Esponjas
- Maskintape
- Marcador
.
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar las cepas proporcionadas por estría cruzada en una placa de gelosa sangre
y en sal y manitol.
2. Inocular cada una de las cepas en el caldo rojo de fenol más maltosa, sacarosa,
manosa, trehalosa y manitol, así como en caldo urea.
3. Realizar la prueba de novobiocina (apéndices).
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial de cada cepa, en cada uno de los medios de
cultivo.
Staphylococcu Staphylococcus Staphylococcus
Medio s aureus epidermidis saprophyticus
Agar Sangre
Agar Sal y Manitol
Catalasa
Coagulasa
Ureasa
Novobiocina
Ácido producido en
anaerobiosis de:
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
Manosa
Trehalosa
Manitol
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
COAGULASA
La coagulasa es una enzima proteica de composición química desconocida, que
tiene actividad similar a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, lo
que da como resultado la formación de un coágulo visible en los sistemas apropiados. Se
piensa que in vivo la coagulasa produce una barrera de fibrina en la localización de la
infección estafilocócica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza para identificar
Staphylococcus aureus y diferenciarlo de otras especies de estafilococos.
La coagulasa se presenta en dos formas, libre y unida; y cada una posee diferentes
propiedades que requieren el uso de distintos procedimientos de ensayo.
Procedimiento
1. Colocar en un tubo de ensaye estéril, 0.5 ml de plasma de conejo o humano.
2. Emulsificar una pequeña cantidad de colonia del microorganismo en el plasma.
3. Se incuba a 35oC de tres a cuatro horas y observar si se forma un coágulo inclinando
ligeramente el tubo.
Interpretación
La prueba de coagulasa en tubo se considera positiva si se detecta cualquier grado de
formación de coágulos.
SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
Principio
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PRACTICA No. 3
ESTREPTOCOCOS (Streptococcus)
HABILIDADES
El estudiante, identifica las características de crecimiento, morfología
microscópica, los medios de aislamiento y pruebas disponibles para la identificación
de los estreptococos de importancia clínica, tomando como referencia NOM-017-STPS-
2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo;
Manual-Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección
ambiental-Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y
especificaciones de manejo.
INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Streptococcus, forman parte de la familia
Streptococcocaea. Los estreptococos son anaerobios facultativos, algunas cepas
desarrollan mejor en anaerobiosis y muchos aislamientos son estimulados por la
presencia de CO2. Los estreptococos, enterococos y aerococos de importancia médica
son homofermentadores, lo que significa que el único producto de la fermentación de la
glucosa es el ácido láctico. Los estreptococos son cocos Gram positivos, miden de 0.5 a 1
micra de diámetro, generalmente no móviles, agrupados en cadenas o en pares, son
catalasa negativa.
Son miembros de la flora normal de la boca y tracto intestinal del ser humano y
además agentes etiológicos de varias enfermedades graves que incluyen neumonía
neumocócica, meningitis, sepsis, endocarditis bacterianas, faringitis exudativa
estreptocócica, celulitis, infecciones de heridas y abscesos viscerales.
A principios de la década de 1930, Rebeca Lancenfield identificó 5 grupos
antigénicos de estreptococos (A, B, C, D y E), en base a las diferencias serológicas en los
polisacáridos de la pared celular. Desde entonces los continuos estudios e investigaciones
han ampliado el número, los cuales se han designado como el grupo piogénico, con
excepción de los del grupo D. Otros estreptococos en particular los del grupo viridans, no
poseen ninguno de los antígenos del grupo Lancenfield conocidos, aunque algunas cepas
pueden poseer antígenos similares que reaccionan en forma cruzada con antisueros
específicos del grupo antiestreptococos betahemolíticos.
Los estreptococos patógenos poseen varias características que contribuyen a su
virulencia. Los mecanismos de virulencia de los estreptococos -hemolíticos del grupo A
son los más estudiados. El principal factor de virulencia de este grupo es el antígeno de
superficie denominado proteína M, las cepas ricas en proteína M son resistentes a la
fagocitosis y muerte intracelular por parte de células polimorfonucleares. Algunas cepas
del grupo A poseen una cápsula compuesta de ácido hialurónico químicamente
indistinguible de la sustancia fundamental del tejido conectivo, lo que puede explicar la
carencia de inmunogenicidad de esta sustancia en el huésped infectado. El factor de
opacidad (OF) define otro antígeno de superficie celular asociado a la proteína M que es
un factor de virulencia potencial. Los estreptococos del grupo A producen dos
hemolisinas, la estreptolisina O y S, tóxicas para una variedad de tipos de células. Las
exotoxinas estreptocócicas pirógenas (SPE) son las responsables del Rash de la
escarlatina y también se supone que son las principales determinantes de la virulencia en
la patogenia del síndrome tóxico estreptocócico similar al Sock.
S. pneumoniae es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad. Su
principal factor de virulencia es la cápsula de polisacáridos, que permite que los
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
neumococos la ingestión y muerte por parte de las células fagocitarias del huésped. Se
han reconocido más de 80 tipos capsulares antigénicamente diferentes, algunos más
virulentos que otros.
Las especies más importantes de estreptococos con propiedades patógenas para
el hombre son:
- Streptococcus pyogenes ( estreptococos beta hemolítico del grupo A)
- Streptococcus agalactiae (estreptococos beta hemolítico del grupo B)
- Streptococcus faecalis (estreptococos del grupo D enterococos)
- Streptococcus pneumoniae (neumococo)
- Streptococcus viridans (grupo heterogéneo de diferentes especies)
MATERIAL:
- Cultivo bacteriano de 24 horas con crecimiento masivo de diferentes especies de
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus bovis, Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus.
Reactivos:
- Colorantes para tinción de Gram,
- Peróxido de hidrogeno 30%
- Desoxicolato de sodio al 10%,
- Solución rojo de fenol al 1%
- Solución hidróxido de sodio 0.1 N
- Discos de Bacitracina 0.04 U
- Discos de optoquina 5 µg
- Discos SXT 1.25 µg/23.75 µg.
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
- Incubadora a 37º C
- Mecheros
- Aceite de inmersión
- Papel seda para lentes
- PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO
1. En diferentes placas de gelosa sangre, sembrar por estría cruzada Streptococcus
beta-hemolítico del grupo A, grupo B y grupo C. Colocar un disco de bacitracina y un
disco de trimetropin-sulfametozaxol (SXT), sobre el inóculo primario, presionándolo
ligeramente para que se adhiera al agar. Hacer incisiones en las estrías.
2. En otra caja de agar sangre hacer la prueba de CAMP. (anexo 2)
3. En una placa de gelosa sangre, sembrar por estría cruzada Streptococcus
pneumoniae. Colocar un disco de optoquina en el centro del área de inóculo, presionar
suavemente el disco sobre el agar con una pinza o el asa estéril. Inocular este
microorganismo en caldo BHI, para posteriormente hacer la prueba de solubilidad en
bilis (anexo 2)
4. Sembrar por estría cruzada en una placa de agar sangre el Enterococcus faecalis y
Streptococcus bovis.
5. Incubar las cajas a 37º C durante 24 hrs en tensión de CO 2 (se le coloca en un frasco
al cuál se le introduce una vela encendida para crear una atmósfera de CO2).
6. Sembrar el Enterococcus faecalis y Streptococcus bovis en agar bilis esculina y en
caldo con NaCl al 6.5%. Incubar a 37º C durante 24 horas en atmósfera ambiente.
7. Hacer un frote de las colonias, teñir con Gram y observar la morfología colonial.
8. Realizar una prueba de catalasa (anexos).
RESULTADOS
1. Hacer la descripción de la morfología colonial, observar el tipo de hemólisis, la
morfología microscópica y resultado de la prueba de catalasa.
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Streptococcus
pyogenes
Streptococcus
agalactiae
Streptococcus bovis
Streptococcus
pneumoniae
Enterococcus
faecalis
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Streptococcus
pyogenes
Streptococcus
agalactiae
Streptococcus
bovis
Streptococcus
pneumoniae
Enterococcus
faecalis
INTERPRETACIÓN:
SENSIBILIDAD A BACITRACINA Y SXT
Principio
La susceptibilidad a bajas concentraciones del antibiótico polipeptídico bacitracina (0.04
unidades) y a la combinación del trimetroprima-sulfametoxazol (SXT) proporciona un
método sencillo y económico para la identificación presuntiva de los estreptococos
betahemolíticos de los grupos A y B. Los estreptococos del grupo A son sensibles a
concentraciones relativamente bajas de bacitracina y resistentes a la SXT. Los
estreptococos del grupo B son resistentes a ambos antibióticos. Otros estreptococos -
hemolíticos muestran sensibilidad variable a la bacitracina pero estos microorganismos
son habitualmente sensibles a la SXT. Por lo tanto, la realización de SXT junto con la
prueba de bacitracina aumenta la sensibilidad y el valor pronóstico de la prueba de
bacitracina.
Procedimiento
1. Tomar tres o cuatro colonias aisladas de estreptococos betahemolíticos y estriar el
inóculo hasta el centro de la mitad de una placa de agar sangre.
2. Con un hisopo estéril o un asa diseminar el inóculo sobre toda la mitad de la placa.
3. Colocar en forma aséptica un disco de bacitracina “A” y un disco de SXT sobre el
área sembrada. Asegurarse de que los discos estén igualmente separados. Utilizando
pinzas flameadas, golpear con suavidad los discos para que se adhieran a la
superficie de agar.
4. Incubar la placa en aire ambiente a 37°C.
Interpretación
Sensible (S) Cualquier tamaño de halo alrededor de cualquiera de los discos
Resistente (R) Desarrollo hasta el borde del disco.
CAMP
La actividad hemolítica de la β-hemolisina producida por la mayoría de los
Staphylococcus aureus es intensificada por una proteína extracelular producida por los
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
estreptococos del grupo B. La interacción de la β-hemolisina con este factor produce una
hemólisis sinérgica, que puede observarse fácilmente en una placa de agar sangre.
1. Hacer en el centro de una placa de agar sangre una única estría en línea recta con
Staphylococcus aureus productor de β-hemolisina.
2. Teniendo cuidado de no tocar la estría del estafilococo, realizar una estría de los
estreptococos betahemolíticos a identificar, en forma perpendicular a la estría de
estafilococos. Realizar estas estrías de tal manera que, después de la incubación, el
desarrollo de los microorganismos no se junte. La estría de estreptococos debe ser de
3 a 4 cm de longitud, en la misma placa debe sembrarse en forma similar cepas
conocidas de Streptococcus del grupo A y grupo B como controles negativos y
positivos respectivamente.
3. Incubar las placas a 37°C en are atmosférico durante 18 a 24 horas.
Interpretación
Se observa una zona de mayor hemólisis cuando la β-hemolisina secretada por el
estafilococo y el factor CAMP secretado por los estreptococos del grupo B se intersectan.
SOLUBILIDAD EN BILIS
Las sales biliares, específicamente el Desoxicolato de sodio y el taurocolato de sodio,
poseen la propiedad de lisar selectivamente a Streptococcus pneumoniae cuando se
agregan las bacterias en fase de crecimiento activo en medios agar o caldo. S.
pneumoniae produce enzimas autolíticas (autolisinas) que son las responsables de la
depresión o umbilicación característica de las colonias viejas de neumococos en medios
de agar. El agregado de sales biliares activa las autolisinas y aceleran la reacción lítica
natural observadas en los cultivos del neumococo.
La prueba de solubilidad en bilis se puede realizar con un cultivo líquido del
microorganismo o con colonias que se desarrollan en medio agar. Si el microorganismo es
soluble, la turbidez del cultivo en caldo líquido se aclara visiblemente cuando se agregan
sales biliares. En medios de agar las colonias solubles en bilis desaparecen cuando se
coloca una gota del reactivo sobre ellas. Debido a que el Desoxicolato de sodio puede
precipitar a pH de 6.5 o menor, el caldo utilizado debe ajustarse a pH de 7.0 para evitar
las reacciones negativas falsas.
Prueba en caldo
1. Transferir aproximadamente 0.5 mL de un caldo de cultivo de 18 a 24 horas a dos
tubos de ensayo limpios, Alternativamente puede prepararse una suspensión del
microorganismo en solución fisiológica tamponada con fosfato a pH de 7.0, a partir del
desarrollo en medio de agar.
2. Agregar una gota de indicador rojo de fenol a cada tubo.
24
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
3. Agregar NaOH 0.10 N para corregir el pH a 7.0 (el indicador vira a un color rosa
pálido).
4. Agregar 0.5 mL de Desoxicolato de sodio al 10% a uno de los tubos (marcado
prueba)
5. Agregar 0.5 mL de solución fisiológica estéril al otro tubo (marcado control).
6. Agitar suavemente ambos tubos y colocarlos en estufa o baño maría a 35°C durante
tres horas, observando cada hora.
Prueba en placa
1. Colocar una gota de desoxicolato de sodio al 2% sobre una pocas colonias bien
aisladas del microorganismo a probar desarrollado sobre el agar sangre de carnero.
2. Sin invertir la placa, colocar en una estufa a 35°C durante 30 minutos.
Interpretación
Prueba en caldo
Reacción positiva (solubles en bilis): Hay un aclaramiento visible de la suspensión del
tubo que contiene desoxicolato de sodio sin cambio enla suspensión control.
Reacción negativa (Insoluble en bilis): No hay cambios en la turbidez de la suspensión
del tubo que contiene desoxicolato de sodio, en comparación con la suspensión control.
Prueba en placa
Reacción positiva (solubles en bilis): Las colonias sobre las cuales se ha colocado el
reactivo desaparecen y dejan una zona parcialmente hemolisada en el lugar donde
estaban.
Reacción negativa (Insoluble en bilis): Las colonias sobre las cuales se ha colocado el
reactivo permanecen intactas y visibles.
HIDRÓLISIS DE ESCULINA
Esta prueba se basa en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los
estreptococos del grupo D y especies de Enterococcus, de hidrolizar esculina en
presencia de bilis al (4 % de sales biliares o 40% de bilis). La esculina es un
derivado glucosídico de la cumarina (6-β-glucósido-7-hidroxicumarina). Los dos residuos
de la molécula (glucosa y a glucona 7 – hidroxicumarina) se encuentran unidos por una
unión éster de oxígeno. Para esta prueba la esculina se incorpora a un medio que
contenga 4% de sales biliares.
Las bacterias bilis esculina positivas son primero de nada capaces de desarrollarse en
presencia de sales biliares. La hidrólisis de la esculina en el medio da como resultado la
formación de glucosa y un compuesto denominado esculetina. Esta a su vez reacciona
con los iones férricos (aportado por el componente de citrato férrico en el medio
inorgánico) para formar un complejo negro que se difunde.
1. Sembrar el microorganismo en el pico de flauta del medio bilis esculina con un
movimiento en S o estriar la superficie de una placa.
2. Incubar el tubo o la placa a 35°C durante 24-48 horas.
Interpretación
El ennegrecimiento difuso de más de la mitad del pico de flauta dentro de las 24-48
horas indica la hidrólisis de la esculina.
TOLERANCIA A LA SAL
25
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Interpretación
Una prueba positiva se manifiesta por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el
medio. Si el microorganismo es bilis esculina positivo y se desarrolla en caldo con 6.5%
de NaCl, pertenece a una especie de Enterococcus. Si es bilis esculina positivo, pero no
se desarrolla en caldo con 6.5% de NaCl, es un estreptococo del grupo D.
SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA
El clorhidrato de etilhidroxicupreína (Optoquina), un derivado de la quinina, inhibe
selectivamente el crecimiento de S. pneumoniae a concentraciones muy bajas (5µg/ml o
menos). Asimismo, la optoquina puede inhibir asimismo otros estreptococos del grupo
viridans, pero sólo a concentraciones mucho más altas. La prueba tiene una sensibilidad
de más del 95%, es barata y sencilla de realizar.
La optoquina es soluble en agua y difunde con rapidez en el medio de agar. Por lo tanto,
los discos de papel de filtro impregnados con optoquina pueden colocarse directamente
sobre la superficie del agar al realizar esta prueba. Las células de S. pneumoniae
alrededor del disco son lisadas debido a cambios en la tensión superficial y se produce
una zona de inhibición del crecimiento.
1. Mediante el empleo de un asa de inoculación seleccionar tres o cuatro colonias bien
aisladas del microorganismo de prueba y estriar en una mitad a un tercio de la placa
de agar sangre de carnero al 5%.
2. Colocar el disco de optoquina en el tercio superior del área sembrada. Presionar
suavemente el disco, para que se adhiera a la superficie del agar.
3. Incubar a 35oC durante 18 a 24 horas con vela o en incubadora de CO 2.
Interpretación
Un estreptococo del grupo viridans puede identificarse en forma presuntiva como S.
pneumoniae si muestra una zona de inhibición de 14 mm o más alrededor de un disco de
optoquina de 6 mm o una zona de 16 mm o más si se utiliza un disco de 10 mm. Los
estreptococos que muestran zonas de diámetro menor deben ser sometidos a la prueba
de solubilidad en bilis.
26
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
27
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
28
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PRACTICA No. 5
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTERIAS
HABILIDADES
INTRODUCCIÓN
Las pruebas utilizadas ampliamente en los laboratorios clínicos incluyen la siguiente serie:
Utilización de hidratos de carbono
Actividad de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG)
Producción de indol
29
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Rojo de metilo
Producción de acetoína ( Voges Proskauer )
Utilización de citrato
Producción de ureasa
Descarboxilación de la lisina, ornitina y arginina
Producción de fenilalanina desaminasa
Producción de gas sulfuro de hidrógeno
Movilidad
Para la determinación de estas pruebas bioquímicas se pueden utilizar medios
únicos o simples (demuestran una determinada característica del microorganismo),
medios múltiples o combinados (destacan varias características en forma simultánea). En
la práctica se utilizan preferentemente medios combinados, los más utilizados para la
identificación de Enterobacterias son: Agar hierro de Kligler (KIA) o agar hierro triple
azúcar (TSI), Agar hierro lisina (LIA), Agar citrato de Simmons, Medio MIO (movilidad-
indol-ornitina), Medio rojo de metilo- Voges Proskauer (RM-VP), Caldo Urea, caldo base
rojo de fenol más carbohidratos, agar Fenilalanina, Gelatina.
MATERIAL
RESULTADOS
MICROORGANISMO
KIA
Fermentación de glucosa
Fermentación de lactosa
Producción de H2S
Producción de gas
MEDIO LIA
Descarboxilación de la lisina
Desaminación de la lisina
MEDIO MIO
Movilidad
Descarboxilación de la ornitina
Producción de Indol
30
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
RM
VP
Fenil alanina desaminasa
CITRATO
Hidrólisis de urea
CALDO BASE ROJO DE FENOL
Fermentación de glucosa
Producción de gas
PRACTICA No. 6
IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS MEDIANTE SISTEMAS MINIATURIZADOS
API 20E
HABILIDADES
Usa métodos semiautomatizados para la identificación rápida de enterobacterias y
otros bacilos gramnegativos, y evalúa sus ventajas y desventajas, tomando como
referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo
en los centros de trabajo; y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud
Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de
manejo.
INTRODUCCIÓN
Actualmente, muchos laboratorios clínicos utilizan uno o más sistemas comerciales
de determinaciones múltiples disponibles para la identificación de ciertos
microorganismos. Numerosas pruebas en laboratorios diagnósticos y de investigación han
demostrado una concordancia del 95% o mayor entre la mayoría de estos sistemas de
identificación y los métodos convencionales para la identificación de microorganismos. La
batería de pruebas API20E es un sistema estandarizado que permite la identificación
rápida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram negativas
no exigentes. Básicamente consta de 21 pruebas bioquímicas estandarizadas y
miniaturizadas, y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido,
eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20
microtubos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica
distinta. La prueba número 21, la oxidasa, se hace de forma independiente a la tira.
31
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
.
MATERIAL Y MÉTODOS
Equipo: Incubadora, Micropipetas
Material: Placas de EMB, Mac Conkey, SS, XLD, Agar sangre
Galerías API 20E
Reactivos: Reactivo de Kovac, cloruro férrico, alfa – naftol al 5 % y solución de KOH al
40 %.
Biológicos: Cultivo de 24 horas de diferentes especies de Enterobacterias.
PROCEDIMIENTO
32
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial de cada cepa, en cada uno de los medios de cultivo.
M.O. EMB Mc Conkey SS XLD Agar sangre
Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se obtiene
un código de 7 cifras.
33
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
3. Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata, para
realizar esta operación hay programas informáticos.
4. Compara los resultados de la morfología colonial y las pruebas Bioquímicas con las
reportadas en la Bibliografía
5. ¿Cuáles son las ventajas de utilizar un sistema automatizado?
6. ¿Qué diferencias hay entre las pruebas Bioquímicas y convencionales y los
automatizados?
7. Analizar resultados
8. Hacer discusión y conclusiones
PRACTICA No. 7
BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES
HABILIDADES
34
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
INTRODUCCIÓN
Los bacilos Gramnegativos no fermentadores, constituyen un grupo de bacilos no
esporulados aerobios, que no utilizan hidratos de carbono como fuente de energía o los
degradan a través de vías metabólicas distintas de la fermentación. Dentro de este grupo
existen varios géneros y especies de bacterias con requerimientos especiales de
crecimiento. El microbiólogo puede sospechar de un bacilo Gram negativo desconocido
es miembro del grupo no fermentador al observar una o más de las siguientes
características: falta de evidencia de fermentación de glucosa (KIA alcalino/alcalino),
reacción de citocromo oxidasa positiva y falta de crecimiento en agar Mac Conkey. La
mayoría de los no fermentadores tienen su hábitat natural en varios microambientes que
sirven como posibles reservorios de infecciones humanas como agua prevalentes en
hospitales: Humificadores, nebulizadores, baños de agua, soluciones desinfectantes y de
irrigación, vías de agua destilada, crema para manos, lociones corporales, etc. Por lo que
estos microorganismos se pueden aislar de casos de septicemia, neumonías, bronquitis,
artritis séptica, infecciones urinarias, infecciones de heridas posoperatorias o
postraumáticas y conjuntivitis.
Tres son las especies más comúnmente aisladas en los laboratorios: Pseudomona
aeruginosa, Acinetobacter baumannii y Stenotrophomonas matophiliai. La mayoría de las
cepas pueden identificarse con facilidad solo sobre la base de algunas observaciones y
pruebas bioquímicas.
Más del 95% de las cepas P. aeruginosa aisladas de muestras clínicas pueden
identificarse observando la presencia de las siguientes características primarias: colonias
grandes con olor similar a uvas, productoras de pigmento (piocianina) verde azulado
hidrosoluble y oxidasa positivas. Algunas cepas de P. aeruginosa pueden producir
pigmentos con otros colores. Piorrubina (rojo), piomelanina (pardo o negro) y pioverdina
(amarillo). La producción de fluoresceína se observa bajo la luz ultravioleta. Las siguientes
características adicionales son útiles para identificar cepas de P. aeruginosa que no
producen pigmento: crecimiento a 42°C, alcalinización de acetamida, desnitrificación de
nitratos a nitritos, móviles con flagelos polares o monótricos. Para identificar otras
especies de Pseudomonas se utiliza la misma bacteria de pruebas bioquímicas de las
enterobacterias, adicionando otra prueba más que es la de OF. Especies de importancia a
nivel clínico:P. aeruginosa, P. fluorecens, P. cepacea, P. putida, P. maltophila, P. stutzeri, P.
pseudomallei, P. mallei, P. picketti.
La identificación presuntiva de Acinetobacter baumannii puede ser con las siguientes
características: Las colonias en agar Mac Conkey pueden tener una tinción ligeramente
rosadas, aparecen como cocos o cocobacilos en la tinción de Gram, no producen
citocromo oxidasa, muestran una rápida utilización de glucosa y lactosa al 10% con
producción de ácidos en el medio OF, son inmóviles y son resistentes a la penicilina.
S. maltophilia es el tercer fermentador en frecuencia hallado en muestras clínicas. Las
siguientes son las características por medio de las cuales se puede hacer la identificación
presuntiva: Buen crecimiento en agar Mac Conkey o agar sangre, no produce citocromo
oxidasa, Produce ácido en OF maltosa pero puede ser negativa en OF glucosa, lisina
descarboxilasa positiva, DNasa positivo y algunas cepas tienen pigmento amarillo.
35
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
MATERIAL
Equipo y materiales: Incubadora, Microscopio y material de apoyo del laboratorio de
microbiología.
Medios de cultivo: Placas de agar Mac Conkey, Mueller Hinton, Agar sangre, Pruebas
bioquímicas (Kligler, LIA, MIO, caldo nitrato con campana, caldo urea, medio OF con
glucosa, medio OF con maltosa),
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram, Reactivo de Kovacs, reactivo de oxidasa,
Alfanaftilamina, ácido sulfanílico, aceite mineral estéril, y solución de KOH al 40 %.
Biológicos: Cultivo de 24 horas de diferentes especies de Pseudomona aeruginosa,
Acinetobacter baumannii y Stenotrophomonas maltophilia
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar las cepas proporcionadas por estría cruzada en agar sangre, agar Mac
Conkey y agar Mueller-Hinton.
2. Inocular cada cepa en la batería bioquímica proporcionada.
3. El medio OF sembrar por picadura en duplicado y agregar aceite mineral a un tubo.
4. Incubar los cultivos a 35oC, durante 24 horas.
5. Describir la morfología colonial y cambios observados en cada uno de los medios
utilizados.
6. Hacer un frotis, teñir con Gram y observar al microscopio.
7. Realizar la prueba de oxidasa (apéndices)
8. Revisar las pruebas metabólicas e identificar al microorganismo en estudio
comparando con tablas de identificación.
RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial de cada cepa, en cada uno de los medios de cultivo.
Medio Pseudomona Acinetobacter Stenotrophomans
aeruginosa baumannii maltophilia
Agar Sangre
Agar Mac Conkey
Agar Mueller Hinton
(Pigmento)
36
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Oxidasa
Kligler
Fermentación de glucosa
Fermentación de lactosa
MEDIO MIO
Descarboxilación de Lisina
Movilidad
Indol
Medio OF
Metabolismo de glucosa
Metabolismo de Lactosa
Metabolismo de Maltosa
Lisina descarboxilasa
Reducción de nitrato
Gas de nitrato
Hidrólisis de urea
PRACTICA No. 8
BACILOS GRAM NEGATIVOS OXIDASA (+) Y FERMENTADORES DE LACTOSA
HABILIDADES
37
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
INTRODUCCIÓN
Los principales géneros de importancia clínica que se caracterizan por ser bacilos
gramnegativos fermentadores, oxidasa negativos son: Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas y
Cromobacterium.
Las especies de Vibrio tienen tanto interés histórico como contemporáneo, V.
cholerae es el agente etiológico del cólera asiático en los seres humanos, una
enfermedad diarreica potencialmente grave, que se caracteriza por la aparición brusca de
diarrea acuosa y abundante, vómito, deshidratación rápida, acidosis, colapso circulatorio y
en casos no tratados se produce la muerte dentro de las primeras 24 horas. Los Vibrios
que se aíslan en seres humanos pueden dividirse en dos grupos: Vibrio cholerae y los
vibriones no coléricos. Las cepas de V. cholerae pueden ser divididas con base a su
antígeno somático en 139 serogrupos diferentes. Las cepas pandémicas se han
designado 01 y pueden separarse, además, en uno de los tres serotipos: Inaba. Ogawua
e Hikojima. Las cepas epidémicas serogrupo 01 pueden dividirse a su vez en
biovariedades, el clásico y El Tor.
La mayoría de los casos de vibriones no coléricos son menos graves y de menor
duración. Las afecciones extraintestinales producidas por Vibrio con más frecuencia son
infecciones de heridas cutáneas u otitis externa, por contaminación de la piel al nadar o
navegar en aguas marinas o después de manipulas mariscos crudos contaminados. Los
vibriones crecen fácilmente en los medios aislamientos utilizados (Agar sangre y
MacConkey), el crecimiento de todas las especies aumenta con el agregado de NaCl al
1% al medio. Las colonias son lisas, convexas, de consistencia cremosa, blanco
grisáceas y de bordes enteros. El TCBS es un medio diferencial útil para la identificación
presuntiva de V. cholerae, V. alginolyticuas, V. parahaemolitico y V. vulnificus. Los Vibrios
fermentadores de sacarosa forman colonias amarillas en el medio TCBS. Desde el punto
de vista microscópico, se observan bacilos gramnegativos, rectos o curvos.
El hábitat natural de las especies de Aeromonas es el agua dulce o el agua salada,
donde suelen causar enfermedades infecciosas en animales acuáticos de sangre fría.
Pueden causar cuatro categorías de infecciones humanas: gastroenteritis, celulitis e
infecciones de heridas, septicemia y otras infecciones.
El término Plesiomonas deriva de la palabra griega “vecino”, lo que indica una
estrecha relación con Aeromonas. P. shigelloides es ubicuo en las aguas superficiales y
en los suelos, e infecta distintos animales de sangre fría. Las Plesiomonas están
relacionadas con gastroenteritis en los seres humanos. Son bacilos Gramnegativos
móviles, rectos, redondeados y cortos con flagelos polares y generalmente lofótricos.
Algunas cepas de Cromobacterium son fermentadoras oxidasas positivas y pueden
confundirse con especies de Aeromonas, Vibrios o Plesiomonas. Cromobacterium
violaceum es la especie encontrada con mayor frecuencia en los laboratorios de análisis
clínicos, aunque rara vez se asocia con enfermedad humana. Crece bien en agar sangre
y la mayoría de las cepas producen abundante pigmento violeta.
MATERIAL
Equipo y materiales: Incubadora, Microscopio y material propio del laboratorio de
microbiología.
38
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Medios de cultivo: Placas de Mac Conkey, TCBS, Agar sangre. Pruebas bioquímicas
(Kligler, LIA, MIO, caldo base rojo de fenol con glucosa + campana, Caldo base rojo de
fenol sacarosa, Caldo nutritivo, Caldo nutritivo + NaCl al 6%)
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram, Reactivo de Kovacs, oxidasa.
Biológicos: Cultivo de 24 horas de Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides,
Cromobacterium violaceum y Vibrio cholerae.
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar cada cepa por estría cruzada en los medios proporcionados.
2. Inocular cada cepa en la batería bioquímica proporcionada.
3. Incubar los cultivos a 35oC, durante 24 horas.
4. Describir la morfología colonial y cambios observados en cada uno de los medios
utilizados.
5. Hacer un frotis, teñir con Gram y observar al microscopio.
6. Realizar la prueba de oxidasa (apéndice).
7. Revisar las pruebas metabólicas e identificar al microorganismo en estudio
comparando con tablas de identificación.
RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial de cada cepa, en cada uno de los medios de cultivo.
Microorganismo Agar Agar Mac Conkey Agar TCBS
Sangre
Aeromonas hydrophila
Plesiomonas shigelloides
Cromobacterium violaceum
Vibrio cholerae
39
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Lisina descarboxilasa
Crecimiento NaCl 0%
Crecimiento NaCl 6%
PRACTICA No. 9
GÉNERO: Haemophilus spp
HABILIDADES
Aplica las características morfológicas (Macroscópicas y microscópicas) y
bioquímicas de las bacterias para identificar las principales especies de Haemophilus,
tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-
Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico OLYMPUS
y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-Residuos
peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Haemophilus, son bacilos Gram negativos, inmóviles y
no esporulados. En materiales biológicos presentan un pleomorfismo que va desde
40
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
41
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
MATERIAL
Equipo y materiales: Incubadora, Microscopio y material de apoyo del laboratorio de
microbiología.
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram,
Biológicos: Cultivo de 24 horas de:
- Haemophilus influenzae
- Haemophilus parainfluenzae
- Staphylococcus aureus hemolítico
-
Medios de cultivo:
- Agar sangre
- Agar Soya tripticaseína
Otros materiales.
- Colorantes para la tinción de Gram
- Microscopios
- Aceite de inmersión
- Mecheros
PROCEDIMIENTO
1. En una placa de gelosa sangre y en otra de agar Soya tripticaseína, inocular
profundamente por estrías la cepa de Haemophilus influenzae.
42
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
2. Con el asa de inocular trazar una estría única, angosta de Staphylococcus aureus
hemolítico, atravesando el área donde se ha sembrado la cepa de Haemophilus
influenzae
3. Incubar a 37º C durante 24 a 48 horas en tensión de CO2.
4. Después del periodo de incubación buscar colonias muy pequeñas como gotitas de
rocio, que crecen en la Zona hemolítica (esto en el agar sangre) de la línea del
estafilococo. Las colonias del haemófilo se desarrollan como satélites y a este
fenómeno se le denomina satelitismo. Las colonias del haemófilo se hacen más
pequeñas a medida que aumenta su distancia de la línea de crecimiento del
Staphylococcus aureus. También se debe buscar el crecimiento de Haemophilus en
agar soya tripticaseína.
5. Realizar el mismo procedimiento con la cepa de Haemophilus parainfluenzae
6. De las colonias de haemófilos, hacer la descripción de la morfología colonial.
7. Hacer un frotis, teñir con Gram y observar al microscopio con el objetivo de inmersión
8. Hacer esquemas de todas las observaciones
9. Hacer prueba de oxidasa y catalasa.
PRACTICA No. 10
BACILOS GRAM POSITIVOS (Bacillus subtilis y Listeria spp)
HABILIDADES
Aplica las características morfológicas (Macroscópicas y microscópicas) y
bioquímicas de las bacterias para identificar las principales especies de Bacillus subtilis y
Listeria spp, tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección
personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico
OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-
Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
INTRODUCCIÓN
43
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Bacillus
Características generales
Bacillus anthracis
El carbunco o ántrax (evitar la confusión con el término carbunclo) fue una de las
primeras infecciones bacterianas para las cuales se estableció definitivamente la causa.
Dio lugar al desarrollo de la primera vacuna bacteriana que fue desarrollada por Louis
Pasteur. Es una enfermedad que afecta sobre todo a animales herbívoros, en particular
ovinos y bovinos. El hombre la adquiere de forma accidental: en el contexto agrícola como
una infección cutánea local, en el contexto industrial (manipuladores de cuero y pelo de
animal) como una neumonía (poco frecuente). Es entonces, una zoonosis y una
enfermedad laboral. Por producir endosporas altamente resistentes y ser capaz de
producir infecciones respiratorias graves, es un arma biológica potencial. De hecho, es
conocido el episodio de bioterrorismo que ocurrió en Estados Unidos hace algunos años,
que dio lugar a varias muertes y que alarmó enormemente al mundo entero.
Otros Bacillus de importancia
B. cereus
Es agente de toxiinfección alimentaria, es capaz de producir una
enterotoxina termoestable que produce vómitos y una termolábil responsable del
síndrome diarreico. El arroz y otros vegetales son los principales vehículos de
transmisión. En Uruguay, entre 1995 y 2001, se notificaron 3 brotes de
enfermedad transmitida por alimentos (ETA). Morfológicamente es similar a B.
anthracis pero se diferencia por ser móvil y resistente a la penicilina. Produce una
βlactamasa y es también resistente al trimetoprim-sulfametoxazol
.
44
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Listeria
El género Listeria incluye bacilos Gram-positivos cortos, no esporulados, que aparecen
solos o en cortas cadenas. Las colonias son pequeñas, lisas y de color gris. Las especies
del género Listeria crecen en un rango de temperatura de 1-45oC, con una temperatura
óptima entre 30 y 37oC, y producen colonias pequeñas, lisas y de color grisáceo. Tienen la
capacidad de crecer en un rango de pH de 5.5-9.5 y a una concentración de NaCl de
hasta 10%. Su metabolismo es anaerobio facultativo. Las especies de Listeria presentan
un movimiento rotatorio de un extremo a otro a temperatura ambiente (22-25 oC), pero no
a 37oC. La gran mayoría de los aislamientos son catalasa-positiva y oxidasa-negativa. La
clasificación antigénica se basa en la tipificación de los antígenos O y H. Actualmente se
han descrito las siguientes especies en el género Listeria:
L. grayi
L. innocua
L. ivanovii
L. monocytogenes
L. murrayi
L. seeligeri
L. welshimeri
Todas las especies de Listeria son de amplia distribución en la naturaleza y se
encuentran en suelos y plantas, así como también contaminando vegetales, aguas,
carnes, mariscos, productos lácteos, etc. Solamente la especie L. monocytogenes puede
provocar infecciones en seres humanos, mientras que L. monocytogenes y L. ivanovii se
pueden aislar de animales. L. monocytogenes produce principalmente septicemia,
meningitis y encefalitis en adultos ancianos o con algún tipo de compromiso inmunológico
con baja inmunidad celular, como trasplantes, linfomas y SIDA. En mujeres embarazadas
producen bacteriemia y aborto y en neonatos provocan prematuridad, granulomatosis
infantisepticum y meningitis.
Corynebacterium
El género Corynebacterium está constituido por un gran número de especies con gran
heterogeneidad genética y fenotípica, y se caracterizan por ser bacilos Gram-positivos,
pleomóficos, no-esporulados, no-encapsulados, no-móviles, que pueden presentar
gránulos metacromáticos visibles mediante tinción con azul de metileno. Las especies de
Corynebacterium son catalasa-positiva y están ampliamente distribuidas en el ambiente,
pudiéndose encontrar en suelos y agua, como también constituyen parte importante de la
flora normal en piel y mucosas del ser humano y de animales. La especie más importante
es C. diphteriae, la cual es el agente responsable de la difteria, una infección del tracto
45
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
46
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PROCEDIMIENTO
- Marcar los medios y Sembrar las cepas proporcionadas por estría en agar Soya
tripticasa, Agar sangre ( Sellar y colocar en frasco con vela (CO2) y Soya con almidón
- Inocular cada cepa en la batería bioquímica proporcionada.
- Hacer un frotis de las cepas proporcionadas y teñir con Gram y observar al
microscopio.
- Para la tinción de Lactobacillus, EL FROTIS SE FIJARÁ COLOCANDO LA
PREPARACIÓN EN LA ENCUBADORA DURANTE 5 MINUTOS, PASADO EL
TIEMPO COLOCAR 2 GOTAS DE METANOL A LA PREPARACIÓN dejar que actúe
durante 1 a 2 min y enseguida lavar el frotis, CONTINUAR CON LA TINCIÓN DE
GRAM.
LECTURA E INTERPRETACIÓN
PROCEDIMIENTO
1. Estriar las pacas con agar con cultivo bacteriano por división. (Ver figura)
2. Incubar a 37º C durante 24 horas
3. Al término del periodo de incubación, colocar unas gotas de solución de Lugol
alrededor del crecimiento (en cada estriado). Y en una zona en donde no haya
inoculado al microorganismo.
4. El almidón intacto toma una coloración azul violácea con el Lugol.
INTERPRETACION
DIGESTION DEL ALMIDON POSITIVO: Aparición de un halo claro alrededor de la estría.
47
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
TABLA DE RESULTADOS:
M.O.
PRUEBAS
Tubo con Glucosa
Tubo con Maltosa
Tubo con Sacarosa
Tubo con Manitol
KLIGLER
Glucosa
Lactosa
Gas
H2S
Citrato de Simmons
Caldo urea
Caldo Nitrato
48
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Bilis esculina
Prueba de oxidasa
Prueba de catalasa
PRACTICA No. 11
CORINEBACTERIAS o EXUDADO FARÍNGEO
HABILIDADES
INTRODUCCIÓN
49
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
MATERIAL
Equipo y material: Incubadora, Microscopio y material propio del laboratorio de
microbiología.
Medios de cultivo: Placas de agar sangre. Pruebas bioquímicas (Caldo urea, caldo
nitrato, medio SIM, caldo base rojo de fenol con glucosa, maltosa, sacarosa y xilosa)
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram, Peróxido de hidrogeno 30%.
Biológicos: Cultivos de 24 horas de especies de Corynebacterium xerosis
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la cepa proporcionada por estría cruzada en agar sangre.
2. Inocular la cepa en el medio SIM, urea, caldo nitrato, maltosa, glucosa, lactosa y
xilosa.
3. Incubar los cultivos a 35oC, durante 24 horas.
4. Hacer un frotis, teñir con Gram y observar al microscopio.
5. Realizar la prueba de catalasa (apéndice 1)
6. Leer pruebas bioquímicas
RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial, microscópica y el tipo de hemólisis que presente.
50
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Prueba Bioquímica
Catalasa
Medio SIM
Producción de H2S
Producción de Indol
Movilidad
Hidrólisis de urea
Reducción de nitratos
Ácido producido en anaerobiosis de:
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
Xilosa
PRACTICA No. 12
BACILOS GRAM POSITIVOS POCOS FRECUENTES (Microaerófilos)
(Gardnerella vaginalis y Lactobacillus)
HABILIDADES
Aplica las características morfológicas (Macroscópicas y microscópicas) y
bioquímicas de las bacterias para identificar, tomando como referencia NOM-017-STPS-
2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo;
Manual-Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección
ambiental-Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y
especificaciones de manejo.
INTRODUCCIÓN
Gardnerella vaginalis
51
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Lactobacillus:
Son bacilo microaerófilos, Gram positivos y catalasa negativos, estos organismos forman
ácido láctico como producto principal de la fermentación de los azúcares. Los
Lactobacilos homofermentativos dan lugar a ácido láctico como producto principal de
fermentación. Este grupo está integrado por Lactobacillus caucasicus, Lactobacillus
bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus delbrueckü. Los
Lactobacilos heterofermentativos producen además de ácido láctico, dióxido de carbono
etanol y otro productos volátiles; Lactobacillus fermenti es heterofermentativo y es capaz
además, de dar buen crecimiento a temperaturas elevadas (45 ºC, 113 ºF).
52
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Homofermentati Heteroferment
vos ativos
53
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Cultivo a 15º - - - - - + + - +
45º + + + + + - - + -
Resistencia a 60º / 90 + - + - - - - -
min
65º / 30 - - + - - - - -
min
1,2 –
Ácido (%) en la leche 2,7 2,7 1,7 1,7 0,8 0,3 – 1,2 0,5 0,5
1,5
Producción CO2 - - - - - - - + +
de (azúcares)
NH3 - - - - - - - + +
(arginina)
Cultivo en NaCl 2% - - - + + + + +
presencia de
NaCl 4 & - - - - + + + +
Teepol 0,4 - + - +
%
Fermentación de - - - - - - +/- - +
pentosas b)
1,2,3,4 1,2,3,4 1,2,3,4
Fermentación de otros 1 (4) - 1,2,3, , 1, (4,5),8 1,5
azúcares c) (4) 4 (5), 6, 7 5,6,7,8,
6,7,9,0
9,0
Grupo Serológico A A E E ¿ B, C D F E
(Sharpe)
MATERIAL
54
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial y microscópica de cada uno de los microorganismos
en los diferentes medios y el tipo de hemólisis que presenten.
55
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Hidrolisis del
Microorganismo Catalasa hipurato
Gardnerella
Lactobacillus
PRACTICA No. 13
NEISERIAS
HABILIDADES
Conoce la morfología microscópica y colonial de las Neiserias patógenas y
saprofitas, así como sus características diferenciales tomando como referencia NOM-017-
STPS-2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de
trabajo; Manual-Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección
ambiental-Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y
especificaciones de manejo.
INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Neisseria son microorganismos Gramnegativos
baciliformes o con forma de cocos que por lo general se encuentran en pares o cadenas
cortas. Las especies diplococos tienen sus caras adyacentes aplanadas, lo que les
confiere el aspecto de granos de café. Todas las especies del género Neisseria viven en la
superficie de las mucosas de huéspedes de sangre caliente. Estos microorganismos son
inmóviles, no forman esporas, y la mayoría de las especies crecen en forma óptima entre
35°C y 37°C. Son capnófilos y se desarrollan mejor en ambientes húmedos. Las especies
56
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
MATERIAL
Equipo y material: Incubadora, Microscopio y material propio del laboratorio de
microbiología.
Medios de cultivo: Placas de agar sangre Agar chocolate suplementado, agar nutritivo
Pruebas bioquímicas (Agar CTA con glucosa, CTA con maltosa, CTA con fructosa, CTA
con lactosa)
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram, Peróxido de hidrogeno 30%, reactivo de
oxidasa.
Biológicos: Cultivos de 24 horas de especies de Neisseria
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar las cepas proporcionadas por estría cruzada en las placas de agar chocolate,
agar sangre, y agar nutritivo.
2. Inocular cada una de las cepas en el medio CTA más maltosa, glucosa, fructosa y
lactosa.
3. Incubar los cultivos a 35oC en tensión de CO2, durante 24 horas.
4. Hacer un frotis de cada microorganismo, teñir con Gram y observar al microscopio.
5. Realizar la prueba de catalasa (apéndice)
6. Realizar la prueba de oxidasa (apéndice)
57
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
RESULTADOS
8. Describir la morfología colonial y microscópica de cada uno de los microorganismos en los
diferentes medios y el tipo de hemólisis que presenten.
58
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
59
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
60
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis de las cepas proporcionadas y teñirlas con Gram. Observar al
microscopio y anotar la morfología de las bacterias.
2. Sembrar las cepas proporcionadas por dispersión, agregando una gotas del cultivo en
las placas de agar sangre y la caja con gelosa bilis esculina,
3. Incubar en anaerobiosis a 37º C durante 48 horas.
4. Describir la morfología colonial y el tipo de hemólisis en caso de presentarse
5. Confirmar la presencia de anaerobiosis realizando las pruebas de aerotolencia
6. Para hacer la identificación bioquímica confirmativa, propagar la colonia aislada del
microorganismo problema en un tubo con caldo Tioglicolato enriquecido.
7. Sellar el tubo con aceite mineral estéril en la parte superior e incubar a37ºC por 24-48
horas.
8. Realizar la lectura de las pruebas bioquímicas tomando 2 gotas de cada reactivo e
identificar al microorganismo.
9. Analizar los resultados
10. Hacer la discusión y conclusiones
61
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PRACTICA No. 15
TINCION DE ZIEHL NEELSEN
HABILIDADES
El estudiante
- Aplica el mecanismo de la tinción de Ziehl Neelsen, con microorganismo conocidos y
desconocidos.
- Utiliza una técnica de coloración para la diferenciación de microorganismo ácido
alcohol resistente, tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de
protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-
Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-
Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y
especificaciones de manejo.
NORMATIVIDAD Y BIOSEGURIDAD
- NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los
centros de trabajo.
- NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos
peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
- Manual. Microscopio óptico OLYMPUS.
INTRODUCCION
La tinción de Ziehl Neelsen es otro tipo de coloración diferencial que separa los
géneros Mycobacterium y Nocardia del resto de las bacterias.
Los géneros mencionados presentan característicamente un alto contenido de
ácidos grasos de cadena muy larga, los ácidos micólicos y nocardicos respectivamente.
Estos ácidos parecen jugar un papel fundamental en la respuesta de las bacterias a esta
coloración.
En esta técnica se utiliza fucsina básica o fenicada como colorante primario, esta
solución se aplica con calentamiento a emisión de vapores. Como agente decolorante se
aplica una mezcla de etanol y ácido sulfúrico o ácido clorhídrico. El azul de metileno es el
colorante secundario.
62
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
MATERIAL
- Cultivos bacterianos mixtos de 24 horas en tubo de bacterias ácido alcohol resistentes
(baar) y no ácido alcohol resistentes (no baar).
- Cepas puras de 24 horas con crecimiento masivo de bacterias ácido alcohol
resistentes placas (Mycobacterium y Nocardia) y no ácido alcohol resistentes
- Incluir Vibrio cholerae
- Microscopios suficientes REACTIVOS PARA TINCION DE
- Mecheros ZIEHL NEELSEN:
- Aceite de inmersión - Fucsina fenicada o básica
- Papel seda para lentes -Alcohol ácido
- Puente para tinción - Azul de metileno.
- Frasco gotero con agua destilada
PROCEDIMIENTO
1. Hacer 2 frotis de las cepas proporcionadas, dejar secar al aire y fijarlos al calor
(como se indicó en la práctica anterior).
2. Colocar el frotis sobre el puente para tinción
3. Cubrir la preparación con solución de FUCSINA FENICADA O FUCSINA BASICA
DURANTE 5 MINUTOS A EMISION DE VAPOR.
Es decir calentar suavemente el portaobjeto con la flama de mechero o bien pase la
flama utilizando un rollo de algodón humedecido con alcohol y sostenido con una
pinza de disección. Hasta que desprenda vapor.
4. Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos. Observar que el colorante no
debe secarse ni hervir (añadir más colorante si es necesario).
63
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
RESULTADOS:
INTRUCCIONES:
- Hacer 2 preparaciones de los cultivos proporcionados.
- Observar una preparación fija
- Tomar fotografía de la morfología observada de cada uno de los especímenes para su
reporte
- Quitar el aceite del objetivo con papel seda para lentes.
- Limpiar los objetivos del microscopio con algodón humedecido con alcohol.
- Colocar el microscopio en el lugar indicado.
64
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Klebsiella pneumoniae
Lactobacillus
LITERATURA CITADA
INFORME.
MORFOLOGIA MICROSCOPICA
FORMA AGRUPACION ZIEHL NEELSEN MICROORGANISMO
(BAAR O NO BAAR)
65
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
66
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
67
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
68
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
ANEXOS
Anexo 1
1. ALCOHOL ACETONA
Acetona .........................................................................50 ml
Alcohol etílico.................................................................50 ml
Mezclar los ingredientes respectivos
2. ALCOHOL ÁCIDO
HCL concentrado ...........................................................3 ml
Alcohol etílico al 70 %.....................................................100 ml
Agregar lentamente el ácido en el alcohol.
3. ÁCIDO SULFANILICO
Ácido sulfanílico..............................................................0.8 g
Ácido acético (5N), 30 %...............................................100 ml
Agregar el ácido sulfanílico en el acético.
4. ALFA-NAFTILAMINA
Alfa- naftilamina..............................................................5 g
Ácido acético (5N), 30 %................................................100 ml
Agregar el alfa-naftilamina en el ácido.
5. ALFA-NAFTOL
Alfa- naftol......................................................................5 g
Alcohol etílico absoluto...................................................100 ml
Disolver el alfa-naftol en el alcohol. Proteger de la luz y refrigerar.
6. AZUL DE METILENO
Azul de metileno.............................................................0.3 g
Alcohol etílico al 95 %.....................................................30 ml
Agua destilado................................................................100 ml
7. CARBOLFUCSINA
Cristales de fenol...........................................................2.5 g
Alcohol al 95%................................................................5 ml
Fucsina básica................................................................0.5 g
Agua destilada................................................................100 ml
Disolver la fucsina en el alcohol y el fenol en el agua, mezclar las dos soluciones.
8. CRISTAL VIOLETA
Cristal violeta..................................................................2.0 g
Alcohol etílico al 95 %.....................................................20 ml
Oxalato de amonio..........................................................0.8 g
agua destilada................................................................100 ml
Disolver el cristal violeta en el alcohol y el oxalato de amonio en el agua. Mezclar
las dos soluciones.
69
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
9. CLORURO FERRICO
Cloruro férrico.................................................................10 g
HCL concentrado ...........................................................2.5 ml
Agua destilada................................................................100ml
13. LUGOL
Yoduro de potasio ..........................................................2.0 g
Cristales de yodo...........................................................1.0 g
Agua destilada................................................................1.0 g
Mezclar bien y conservar en un frasco ámbar con tapón esmerilado.
15. SAFRANINA
Safranina O ...................................................................2.5 g
Alcohol etílico al 95 %.....................................................100 ml
Disolver la safranina en el alcohol. La solución de trabajo se prepara diluyendo 10 ml
de la solución madre en 100ml de agua destilada.
70
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Anexo 2
NEFELOMETRICO DE Mc FARLAND
1. Utilizar 11 tubos de ensaye de igual tamaño y buena calidad que hallan sido
cuidadosamente lavados y enjuagados.
Cloruro de bario 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
(ml)
Acido sulfurico 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9
Anexo 3
71
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
TINCIONES
TINCIÓN DE GRAM
Anexo 4
72
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Este medio es útil para la detección selectiva de estreptococos del grupo D. Determina si
un microorganismo es capaz de hidrolizar la esculina en presencia de bilis.
Agar 15.00 g
Extracto de carne 3.00 g
Peptona 5.00 g
Bilis de buey 40.00 g
Esculina 1.00 g
Citrato férrico 0.5 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.0
Agar 15.00 g
Azul de bromotimol 0.08 g
Citrato de sodio 2.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Fosfato dihidrogenado de amonio 1.00 g
Fosfato dipotásico 1.00 g
Sulfato de magnesio 0.20 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 6.9 + 0.2
Preparación: Suspender 24.2 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5
a 10 minutos. Mezclar y calentar agitando hasta ebullición, dejar enfriar a 50° C y ajustar
el pH indicado. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121°
C por 15 minutos, enfriar en posición inclinada.
Agar Columbia
Medio para aislar Gardnerella vaginalis. Se le adiciona sangre humana debido a que este
microorganismo es -hemolítico en este tipo de sangre, pero no en sangre de otros
animales.
73
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Agar 15.00 g
Azul de metileno 0.065 g
Eosina 0.04 g
Fosfato dipotásico 2.00 g
Lactosa 5.00 g
Saxarosa 5.00 g
Peptona especial 10.00 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.2 + 0.2
74
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Agar fenilalanina
Agar 12.00 g
DL-fenilalanina 2.00 g
Extracto de lelvadura 3.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Fosfato de sodio 1.00 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.3
Agar gelatina
Preparación: Suspender 128 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5
a 10 minutos. Mezclar y calentar agitando hasta ebullición, dejar enfriar a 50° C y ajustar
el pH indicado. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121°
C por 15 minutos, enfriar en posición recta
Agar 15.00 g
Citrato de amonio férrico 0.50 g
Extracto de levadura 3.00 g
Glucosa 1.00 g
L-lisina 10,00 g
75
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Preparación: Suspender 34.5 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5
a 10 minutos. Calentar cuidadosamente agitando con frecuencia y hervir durante un
minuto, o hasta la disolución completa del agar, dejar enfriar a 50° C y ajustar el pH
indicado. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C
por 15 minutos, enfriar en posición inclinada.
Agar 12.00 g
Peptona 15.00 g
Peptona proteosa 5.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Extracto de carne 3.00 g
Lactosa 10.00 g
Glucosa 1.00 g
Tiosulfato de sodio 0.3 g
Sulfato ferroso 0.2 g
Rojo de fenol 0.024 g
Agua destilada 1000 mL
Preparación: Suspender 51 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5 a
10 minutos. Mezclar y calentar agitando hasta ebullición, dejar enfriar a 50° C. Distribuir
en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C por 15 minutos, enfriar
en posición inclinada.
Agar 13.50 g
Peptona de gelatina 17.00 g
Mezcla de peptonas 3.00 g
Mezcla de sales biliares 1.50 g
Lactosa 10.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Rojo neutro 0.03 g
Cristal violeta 0.001 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.1 + 0.2
76
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Agar 14.00 g
Azul de bromotimol 0.04 g
Azul de timol 0.04 g
Bilis de buey 5.00 g
Citrato férrico 1.00 g
Citrato de sodio 10.00 g
Cloruro de sodio 10.00 g
Desoxicolato de sodio 3.00 g
Extracto de levadura 5.00 g
Polipeptona 10.00 g
Sacarosa 20.00 g
Tiosulfato de sodio 10.00 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 8.6+0.2
77
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
45° C. Ajustar al pH indicado con NaOH 1 N y vaciar en cajas de Petri estériles, 30 mL por
placa. No se esteriliza.
Agar 13.50 g
Extracto de carne 5.00 g
Peptona 5.00 g
Mezcla de sales biliares 8.50 g
Lactosa 10.00 g
Citrato de sodio 8.50 g
Tiosulfato de sodio 8.50 g
Citrato férrico 1.00 g
Rojo neutro 0.025 g
Verde brillante 0.33 g
Agua destilada 1000 mL
Agar 15,00 g
Extracto de carne 1.00 g
Proteasa peptona 10.00 g
Manitol 10.00 g
Lactosa 10.00 g
Cloruro de sodio 75.00 g
Rojo de fenol 0.025 g
Agua destilada 1000 mL
Preparación: Rehidratar 111 g del medio de cultivo en un litro de agua destilada, remojar
bien durante 10 a 15 minutos. Calentar hasta el punto de ebullición para disolver el medio
por completo. Dejar enfriar aproximadamente a 50 ° C. Distribuir en matraces sin
sobrepasar las 2/3 partes del volumen del total del matraz, esterilizar a 121° C por 20
minutos. Dejar enfriar a 50° C y vaciar en cajas de Petri estériles.
78
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Es un medio altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella typhi, así como bacilos
entéricos de heces, aguas negras, aguas de bebidas y diversos alimentos.
Agar 20.00 g
Mezcla de peptonas 10.00 g
Extracto de carne 5.00 g
Dextrosa 5.00 g
Fosfato dipotásico 4.00 g
Sulfato ferroso 0.30 g
Indicador de sulfito de bismuto 8.00 g
Verde brillante (solución acuosa al 5%) 5.0 mL
Agua destilada 1000 mL
Agar Thayer-Martin
79
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Xilosa 3.50 g
L-lisina 5.00 g
Sacarosa 7.50 g
Lactosa 7.50 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Rojo de fenol 0.08 g
Extracto de levaduras 3.00 g
Desoxicolato de sodio 2.50 g
Tiosulfato de sodio 6.80 g
Citrato de hierro y amonio 0.80 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.4
Medio para aislar u cultivar diversos microorganismos. Al añadir sangre este medio puede
usarse para descubrir la actividad hemolítica y para aislar estreptococos y otros Gram
positivos.
Este medio puede usarse como base para determinar las reacciones de fermentación de
carbohidratos.
80
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Caldo nitrato
81
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Medio líquido empleado para efectuar las reacciones indicadas de rojo de metilo y acetil-
metil-carbinol del grupo Echerichia/Enterobacter.
Caldo tetrationato
Yodo en cristales 6g
Yoduro de potasio 5g
Agua destilada 20 mL
Caldo urea
82
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Preparación: Disolver 3.87 g del medio en 100 mL de agua destilada. Cuando el polvo se
ha disuelto, filtrar a través de un filtro bacteriológicol pH indicado. Distribuir en tubos de
13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C por 15 minutos, enfriar en posición
inclinada.
Gelosa chocolate
Se pueden utilizar como base los siguientes componentes:
Agar infusión de res
Agar base sangre
Agar Mueller-Hinton
Preparación: Adicionar un suplemento como el polienrriquecimiento liofilizado y
reconstituido de Bioxon. Preparar un volumen a doble concentración de la base y
adicionar volúmenes de suspensión de hemoglobina estéril al 2%.
Medio CTA
Cistina 0.50 g
Digerido pancreático de caseína 20.00 g
Agar 3.50 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Rojo de fenol 0.017 g
Sulfito de sodio 0.50 g
Agua destilada 1000 mL
Preparación: Para preparar 250 mL pesar 7.1 g del medio deshidratado y suspenderlo en
250 mL de agua destilada. Pasar a matraces de 50 mL y Esterilizar a 121° C por 15
minutos.
Preparar soluciones al 20% de los carbohidratos a usar: fructosa, lactosa,
sacarosa y maltosa, pesar 0.5 g del carbohidrato y suspenderlo en 2.5 mL de agua.
Colocar en condiciones asépticas a cada matraz, la solución de carbohidrato
correspondiente, la cual previamente se ha esterilizado por filtración de membrana de
0.45 de poro. Agitar y pasar 5 mL a tubos chicos con tapón de rosca y estériles. Rotular
los tubos con el carbohidrato que tienen. Una vez enfriados, se incuban a 35° C durante
24 horas, para comprobar su esterilidad. Finalmente se guardan en bolsas de plástico
bien cerradas y se conservan en refrigeración.
83
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Medio Stuart
84
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Anexo 5
85
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Burbuja en el medio
Desdoblamiento del medio
Desplazamiento completo del medio hacia arriba del tubo, dejando un área
clara.
c) producción de ácido sulfhídrico
La capacidad de ciertas bacterias para liberar azufre de aminoácidos y otros
compuestos que lo contienen, se detecta por la presencia de un precipitado de color
negro resultado de reaccionar el gas H 2S con un indicador como el sulfato ferroso. Puede
estar distribuido parcial o totalmente en toda la capa profunda o a lo largo de la picadura.
Interpretación
a) Descarboxilación de la lisina ( lisina positiva )
- Pico de flauta y fondo de color morado, reacción alcalina.
- Pico de flauta color morado ( alcalino ) y fondo transparente, reacción
intermedia o neutra.
b) No descarboxilación de la lisina ( lisina negativa )
- La presencia de cualquier reacción ácida ( amarilla ) ya sea en el
pico de flauta o en el fondo.
CAMP
86
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
1. Hacer en el centro de una placa de agar sangre una única estría en línea recta con
Staphylococcus aureus productor de -hemolisina.
2. Teniendo cuidado de no tocar la estría del estafilococo, realizar una estría de los
estreptococos betahemolíticos a identificar, en forma perpendicular a la estría de
estafilococos. Realizar estas estrías de tal manera que, después de la incubación, el
desarrollo de los microorganismos no se junte. La estría de estreptococos debe ser de
3 a 4 cm de longitud, en la misma placa debe sembrarse en forma similar cepas
conocidas de estreptococcus del grupo A y grupo B como controles negativos y
positivos respectivamente.
3. Incubar las placas a 37°C en are atmosférico durante 18 a 24 horas.
Interpretación
Se observa una zona de mayor hemólisis cuando la -hemolisina secretada por el
estafilococo y el factor CAMP secretado por los estreptococos del grupo B se intersectan.
Estreptococo no
Pertenece al grupo B
Estría de estafilococo
Estreptococos del
Grupo B
CATALASA
87
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Catalasa
H2O2 H2O + O2 (Burbujas de gas)
La prueba de catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos es muy
comúnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos
(positivos ) o especies de bacilos Grampositivos y micobacterias.
Procedimiento
1. Con una aguja de inoculación o un palillo de madera, transferir parte del centro de una
colonia bien aislada a la superficie de un portaobjeto.
2. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3 % y observar la formación de
burbujas.
Interpretación
La aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una
reacción positiva.. la observación de unas pocas burbujas pequeñas después de 20 a 30
segundos no se considera un resultado positivo. Debe tenerse cuidado de no tomar
eritrocitos junto con el material de la colonia.
COAGULASA
FOSFATASA ALCALINA
88
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
que contiene p- nitrofenilfosfato (0.495 mg/mL). Estos autores encontraron que el 83% de
S. epidermidis eran PNP positivos.
Procedimiento
1. Sembrar en forma de mancha el microorganismo en una placa de PNP.
2. Incubar de 18 a 24 horas a 35°C.
Interpretación
La presencia de un color amarillo brillante por debajo y alrededor del inóculo constituye
una prueba positiva.
FENILALANINA DESAMINASA
Interpretación
La aparición inmediata de un intenso color verde indica la presencia de ácido fenilpirúvico
y una prueba positiva.
FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS
89
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
HIDRÓLISIS DE ESCULINA
HIDRÓLISIS DE GELATINA
HIDRÓLISIS DE UREA
La urea es una diamina del ácido carbónico. Todas las amidas se hidrolizan
fácilmente, con liberación de amoniaco y dióxido de carbono. La ureasa es una enzima
que poseen muchas especies de microorganismos, que pueden hidrolizar la urea.
90
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
En el medio líquido se siembra con una asada del cultivo puro del microorganismo a
probar; la superficie de un pico de flauta de un medio sólido se estría con el
microorganismo a probar. Ambos medios se incuban a 25°C durante 24 horas.
Interpretación
POSITIVA: color rojo rosado intenso en el medio
NEGATIVA: No cambia de color el caldo ( color canela ).
MEDIO MIO
OXIDACIÓN – FERMENTACIÓN
91
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Se requiere de dos tubos para esta prueba inoculados por picadura por el organismo
desconocido. Cubrir el tubo con una capa de 1 cm de aceite mineral estéril, dejando el
otro tubo sin aceite.
Incubar los tubos a 37oC durante 48 horas o más.
La producción de ácido se detecta en el medio por la aparición de color amarillo y se
interpreta de la siguiente manera:
92
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
OXIDASA
REDUCCIÓN DE NITRATOS
1. Inocular el medio para nitratos con una asada del microorganismo en estudio e
incubar a 35°C, durante 18 a 24 horas.
2. Finalizada la incubación, agregar 1 mL de -naftilamina y 1 mL de ácido sulfanílico, al
medio de prueba, en ese orden.
Interpretación
La aparición de un color rojo en los 30 segundos posteriores al agregado de los
reactivos indica la presencia de nitritos y representa una reacción positiva. SI no aparece
el color, puede indicar que los nitratos no han sido reducidos (una verdadera reacción
negativa) o que han sido reducidos a otros productos, como amoniaco, nitrógeno
molecular, óxido nítrico u óxido nitroso e hidroxilamina. Dado que los reactivos de prueba
detectan sólo nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falso – negativa, por ende
es necesario agregar una pequeña cantidad de zinc a todas las reacciones negativas.
Los iones de zinc reducen los nitratos a nitritos y la aparición de color rojo después del
agregado del polvo de zinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma una
reacción negativa verdadera.
Se puede utilizar campana en el medio para la detección de gases.
ROJO DE METILO
93
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Interpretación
– Rojo de metilo positivo: El cultivo es lo suficientemente ácido como para
permitir que el indicador de rojo de metilo mantenga su color en la
superficie del medio (pH 4.4).
– Rojo de metilo negativo: Color amarillo en la superficie del medio (pH
6.0).
– Reacción retardada: Color anaranjado.
SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
Principio
Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y
resistentes a la novobiocina. Entre las especies resistentes a la novobiocina, S.
saprophyticus es el único que suele recuperarse en el hombre como causantes de
infecciones del tracto urinario. Por lo tanto el tamizaje de los estafilococos coagulasa
negativos aislados de cultivos cuantitativos de orina en lo que respecta a la
94
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA
El clorhidrato de etilhidroxicupreína (Optoquina), un derivado de la quinina, inhibe
selectivamente el crecimiento de S. pneumoniae a concentraciones muy bajas (5g/ml o
menos). Asimismo, la optoquina puede inhibir asimismo otros estreptococos del grupo
viridans, pero sólo a concentraciones mucho más altas. La prueba tiene una sensibilidad
de más del 95%, es barata y sencilla de realizar.
La optoquina es soluble en agua y difunde con rapidez en el medio de agar. Por lo tanto,
los discos de papel de filtro impregnados con optoquina pueden colocarse directamente
sobre la superficie del agar al realizar esta prueba. Las células de S. pneumoniae
alrededor del disco son lisadas debido a cambios en la tensión superficial y se produce
una zona de inhibición del crecimiento.
1. Mediante el empleo de un asa de inoculación seleccionar tres o cuatro colonias
bien aisladas del microorganismo de prueba y estriar en una mitad a un tercio de
la placa de agar sangre de carnero al 5%.
2. Colocar el disco de optoquina en el tercio superior del área sembrada. Presionar
suavemente el disco, para que se adhiera a la superficie del agar.
3. Incubar a 35oC durante 18 a 24 horas con vela o en incubadora de CO2.
Interpretación
Un estreptococo del grupo viridans puede identificarse en forma presuntiva como
S. pneumoniae si muestra una zona de inhibición de 14 mm o más alrededor de un disco
de optoquina de 6 mm o una zona de 16 mm o más si se utiliza un disco de 10 mm. Los
estreptococos que muestran zonas de diámetro menor deben ser sometidos a la prueba
de solubilidad en bilis.
95
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
SOLUBILIDAD EN BILIS
Las sales biliares, específicamente el desoxicolato de sodio y el taurocolato de
sodio, poseen la propiedad de lisar selectivamente a Streptococcus pneumoniae cuando
se agregan las bacterias en fase de crecimiento activo en medios agar o caldo. S.
pneumoniae produce enzimas autolíticas (autolisinas) que son las responsables de la
depresión o umbilicación característica de las colonias viejas de neumococos en medios
de agar. El agregado de sales biliares activa las autolisinas y aceleran la reacción lítica
natural observadas en los cultivos del pneumococo.
La prueba de solubilidad en bilis se puede realizar con un cultivo líquido del
microorganismo o con colonias que se desarrollan en medio agar. Si el microorganismo es
soluble, la turbidez del cultivo en caldo líquido se aclara visiblemente cuando se agregan
sales biliares. En medios de agar las colonias solubles en bilis desaparecen cuando se
coloca una gota del reactivo sobre ellas. Debido a que el desoxicolato de sodio puede
precipitar a pH de 6.5 o menor, el caldo utilizado debe ajustarse a pH de 7.0 para evitar
las reacciones negativas falsas.
Prueba en caldo
1. Transferir aproximadamente 0.5 mL de un caldo de cultivo de 18 a 24 horas a dos
tubos de ensayo limpios, Alternativamente puede prepararse una suspensión del
microorganismo en solución fisiológica tamponada con fosfato a pH de 7.0, a partir del
desarrollo en medio de agar.
2. agregar una gota de indicador rojo de fenol a cada tubo.
3. Agregar NaOH 0.10 N para corregir el pH a 7.0 (el indicador vira a un color rosa
pálido).
4. Agregar 0.5 mL de desoxicolato de sodio al 10% a uno de los tubos (marcado prueba).
5. Agregar 0.5 mL de solución fisiológica estéril al otro tubo (marcado control).
6. Agitar suavemente ambos tubos y colocarlos en estufa o baño maría a 35°C durante
tres horas, observando cada hora.
Prueba en placa
1. Colocar una gota de desoxicolato de sodio al 2% sobre una pocas colonias bien
aisladas del microorganismo a probar desarrollado sobre el agar sangre de
carnero.
2. Sin invertir la placa, colocar en una estufa a 35°C durante 30 minutos.
Interpretación
Prueba en caldo
Reacción positiva (solubles en bilis): Hay un aclaramiento visible de la suspensión del
tubo que contiene desoxicolato de sodio sin cambio enla suspensión control.
Reacción negativa (Insoluble en bilis): No hay cambios en la turbidez de la suspensión del
tubo que contiene desoxicolato de sodio, en comparación con la suspensión control.
Prueba en placa
Reacción positiva (solubles en bilis): Las colonias sobre las cuales se ha colocado el
reactivo desaparecen y dejan una zona parcialmente hemolisada en el lugar donde
estaban.
96
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Reacción negativa (Insoluble en bilis): Las colonias sobre las cuales se ha colocado el
reactivo permanecen intactas y visibles.
TOLERANCIA A LA SAL
Interpretación
Una prueba positiva se manifiesta por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el
medio. Si el microorganismo es bilis esculina positivo y se desarrolla en caldo con 6.5%
de NaCl, pertenece a una especie de Enterococcus. Si es bilis esculina positivo, pero no
se desarrolla en caldo con 6.5% de NaCl, es un estreptococo del grupo D.
VOGES PROSKAUER
Nos permite determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir un
producto final neutro, el acetil-metil-carbinol (acetoína), a partir de la fermentación de
glucosa.
1. Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro de microorganismos a probar
e incubar 24 horas a 35°C.
2. Finalizada la incubación, adicionar 12 gotas de -naftol al 5% y 6 gotas de KOH al
40%, en ese orden.
3. Agitar suavemente el tubo, para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejar el
tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.
Interpretación
POSITIVA: Color rojo rosado en la superficie del medio.
NEGATIVA: Color amarillo (mismo color del medio).
97
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
UTILIZACIÓN DE CITRATO:
Sirve para determinar la capacidad de un organismo de utilizar citrato de sodio como
única fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo.
Se siembra por estría el microorganismo en estudio en el pico de flauta del agar citrato de
Simmons. Incubar 24 horas a 35oC.
Interpretación
- Prueba positiva: Producción de un color azul en el medio.
- Prueba negativa : El medio permanece de color verde ( no hay crecimiento del
microorganismo )
REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS
1. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Bailey & Scott Diagnóstico microbiológico. 12ª
edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina 2009.
6. Winn WC, Allen SD, Janda WM, Koneman EW, Procop CW, Schreckenberger PC,
Woods GL. Koneman Diagnóstico Microbiológico: Texto y atlas en color. 6ª. Edición.
Editorial Médica Panamericana. Argentina 2008.
98
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PRÁCTICA No. 11
AISLAMIENTO DE BACTERIAS A PARTIR DE PRODUCTOS BIOLÓGICOS
(TOMA DE EXUDADO FARINGEO)
HABILIDADES
El estudiante, conoce algunas técnicas y medios de cultivo para el aislamiento y
cultivo de microorganismos a partir de productos biológicos (toma de exudado faríngeo).
.
INTRODUCCIÓN
Los seres vivos se encuentran conviviendo en relaciones ecológicas que van
desde el parasitismos hasta la simbiosis obligadas. En particular los microorganismos se
pueden encontrar viviendo en los tegumentos, mucosas, cavidades y hasta dentro de
algunos tejidos de plantas, animales y del hombre. Constituyendo lo que se llama
microbiota normal. Las funciones de estas microbiota son variadas, siendo frecuente
que la salud, la resistencia a infecciones, o funcionamiento de organelos vitales del
organismo que la alberga dependan de la integridad de estos microorganismos asociados.
El estudio de la microbiota humana permite detectar individuos portadores de
microorganismos potencialmente patógenos para otros individuos.
En el hombre se pueden encontrar microorganismos de la microbiota normal,
como bacterias, hongos y protozoarios en cavidades como la nasal, bucal, vaginal y
otica, en la piel, en el tracto digestivo y respiratorio. En algunos casos, la cantidad de
microorganismo es muy abundante como en piel, cavidad bucal, oral y vaginal. En
individuos sanos
En individuos sanos no hay microorganismos en la sangre, líquido cefalorraquídeo,
orina y órganos internos y generalmente la presencia transitoria de éstos en esas
localización indica el desarrollo de un proceso infeccioso.
En el aislamiento de microorganismos a partir de productos biológicos se usan
varios medios de cultivos. La selección de estos depende de la cantidad y variedad de
microorganismos en la muestra original, del tipo de microorganismos que se prefiere aislar
y los y los que se quieren eliminar para que su abundancia no encubra o dificulte nuestras
preferencias. Para este propósito se usan una diversidad de medios de cultivos sólidos
entre los que se encuentran medios ricos con una abundancia en la cantidad, variedad y
calidad de los nutrientes.
La toma de las muestras a partir de fluidos y órganos puede ser una actividad muy
fácil, como la de exudado faríngeo (ver figura), la nasal y ótico, raspados dentales y bucal,
pero puede requerir también de instrumental médico y personal especializado para su
obtención como las tomas de líquidos cefalorraquídeo y amniótico, la punción de médula
ósea y el exudado nasofaríngeo –
Equipo y material:
- Mecheros
- Gradillas
- Incubadora a 37º C
- Microscopio
- Abatelenguas estériles (2)
Medios de cultivo:
- Placas de agar sangre.
- Agar Biggy
- Agar Sal y manitol
Pruebas bioquímicas:
- Reactivos:
99
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
1. Preparar el material estéril a utilizar y placas con medio de cultivo sin humedad.
2. Sentado el paciente en posición cómoda, llevar la cabeza ligeramente hacia atrás y
con un abatelenguas estéril presionar la lengua e introducir un hisopo estéril hasta las
amígdalas y se frota contra la parte posterior de la mucosa de un lado a otro o contra
cualquier mancha blanca o ulceración. No tocar la lengua, úvula o la zona periodontal.
3. Inmediatamente depositar la muestra del hisopo en Agar Sangre y Agar Mac Conkey
4. Con el asa aislar por estría cruzada los medios de cultivos antes mencionados,
5. Incubar 24-48 horas a 37°C.
6. Describir la morfología colonial y cambios observados en cada uno de los medios
utilizados.
7. Hacer un frotis de cada microorganismo, teñir con Gram y observar al microscopio
8. Observar en agar sangre la producción hemolítica
100
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
101
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
102
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
FORMA DE REPORTAR:
INFORME
Describa en la tabla siguiente, la morfología colonial y microscopia de
una colonia bacteriana aislada de cada medio de cultivo.
COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 1 COLONIA 2
CARACTERISTICAS
(Muestra en (Muestra en (Muestra en (Muestra en (Muestra en (Muestra en
agar sangre) agar sangre) Agar Biggy) agar Biggy) agar sal y agar sal y
manitol) manitol)
Microorganismo
Medio de cultivo
Tamaño (mm)
Forma
Elevación
Marge o borde
Color
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
MORFOLOGIA MICROSCOPICA
Tinción de Gram
Morfología
Agrupación
En agar sangre ver
el tipo de
HEMÓLISIS
LITERATURA CITADA
- Díaz; R. G. y Toñi, L.I. Manual Práctico de Microbiología (2009) Ed. Masón, Barcelona.
- Koneman, W. E. Aller, S.D. Jinda, W.M. Schreckenberger. P.C. (2008). Diagnóstico
Microbiológico; 5ª. ed; Ed. Panamericana; España.
- Pelczar, M.J.Jr., R.D. Reid y E.C.S. Chan., Microbiología, (2004) 4a. de. MacGraw-Hill-Book,
Company, Nueva York.
- Prescott, L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. (2000) Microbiología. McGraw-Hill Interamericana.
Madrid. .
- Manual de Prácticas de microbiología. (2017) ENCB del IPN. México, DF.
103
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
PRÁCTICA No. 12
AISLAMIENTO DE BACTERIAS A PARTIR DE PRODUCTOS BIOLÓGICOS
(TOMA DE EXUDADO OTICO)
HABILIDADES
- El estudiante, conoce algunas técnicas y medios de cultivo para el aislamiento y
cultivo de microorganismos a partir de productos biológicos (toma de exudado otico).
- Describe las condiciones adecuadas para la toma de muestra en los sitios anatómicos
relacionado con el exudado otico.
- Analiza macroscópicamente y microscópicamente la muestra en estudio.
- Valora el crecimiento obtenido en los distintos medios de cultivo.
.
INTRODUCCIÓN
Los seres vivos se encuentran conviviendo en relaciones ecológicas que van
desde el parasitismos hasta la simbiosis obligadas. En particular los microorganismos se
pueden encontrar viviendo en los tegumentos, mucosas, cavidades y hasta dentro de
algunos tejidos de plantas, animales y del hombre. Constituyendo lo que se llama
microbiota normal. Las funciones de estas microbiota son variadas, siendo frecuente
que la salud, la resistencia a infecciones, o funcionamiento de organelos vitales del
organismo que la alberga dependan de la integridad de estos microorganismos asociados.
El estudio de la microbiota humana permite detectar individuos portadores de
En el aislamiento de microorganismos a partir de productos biológicos se usan
varios medios de cultivos. La selección de estos depende de la cantidad y variedad de
microorganismos en la muestra original, del tipo de microorganismos que se prefiere aislar
y los y los que se quieren eliminar para que su abundancia no encubra o dificulte nuestras
preferencias. Para este propósito se usan una diversidad de medios de cultivos sólidos
entre los que se encuentran medios ricos con una abundancia en la cantidad, variedad y
calidad de los nutrientes.
La toma de las muestras a partir de fluidos y órganos puede ser una actividad muy
fácil, como la de exudado faríngeo (ver figura), la nasal y ótico, raspados dentales y
bucal, pero puede requerir también de instrumental médico y personal especializado para
su obtención como las tomas de líquidos cefalorraquídeo y amniótico, la punción de
médula ósea y el exudado nasofaríngeo. Flora habitual del oído externo La
microbiota general del oído externo es similar a la de la piel, predominando
Staphylococcus (coagulasa-negativo) y miembros del género Corynebacterium.
Con menos frecuencia se observan especies de Bacillus, Micrococcus y
Neisseria. En esta localización se han aislado también otros microorganismos
que colonizan la piel en forma transitoria como Streptococcus pneumoniae, P.
aeruginosa y especies de la familia Enterobacteriaceae, entre ellos, los géneros
Proteus, Escherichia, Enterobacter y Klebsiella. Estudios micológicos
demuestran que los siguientes géneros de hongos pertenecen a la microbiota
normal: Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Candida y Saccharomyces. Agentes
causales comunes
Equipo y material:
- Tubo de 13x100 con solución salina fisiológica estéril (SSF) 0.85% con 2ml.
- Mecheros
- Gradillas
- Incubadora a 37º C
- Microscopio
Medios de cultivo:
- Placas de agar sangre.
- Agar Biggy
104
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
Procedimiento
Toma de muestra del conducto auditivo externo:
1. Preparar el material estéril a utilizar y placas con medio de cultivo sin humedad.
2. El paciente debe estar sentado en posición cómoda con la cabeza hacia un lado. Es
necesario contar con una buena iluminación para observar el canal auditivo.
3. Introducir con cuidado un hisopo delgado estéril impregnado con solución salina
fisiológica estéril (SSF) y tomar la muestra del conducto auditivo externo del oído.
4. Al Introducir el hisopo, este debe de rotarse lentamente. Sacar lentamente el hisopo.
5. Hacer un examen directo (frotis) y colorearlo con la tinción de Gram y enseguida
inocular los medios de cultivos. (agar Biggy, sal y manitol, Mac Conkey y agar sangre).
Descartar los hisopos una vez utilizados.
6. Dispersar el inoculo en cada medio de cultivo y posteriormente con el asa aislar
mediante estría cruzada.
7. Incubar a 37º C durante 24-48 horas. El agar sangre se incuba en tención de CO2.
8. Describir la morfología colonial y cambios observados en cada uno de los medios
utilizados.
Observar al microscopio los frotis teñidos
9. Observar en agar sangre la producción hemolítica
105
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
106
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
107
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I
FORMA DE REPORTAR:
INFORME
i. Describa en la tabla siguiente, la morfología colonial y microscopia de
una colonia bacteriana aislada de cada medio de cultivo.
COLONIA COLONIA COLONIA COLONIA COLONIA COLONIA
COLONIA COLONIA
1 2 1 2 1 2
1 2
CARACTERISTICAS (Muestra en (Muestra (Muestra (Muestra (Muestra (Muestra
(Muestra (Muestra
Agar en en agar sal en agar sal en agar en agar
en agar en agar
Biggy) Agar y manitol) y manitol) Mac Mac
sangre) sangre)
Biggy) Conkey) Conkey)
Microorganismo
Medio de cultivo
Tamaño (mm)
Forma
Elevación
Marge o borde
Color
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
MORFOLOGIA MICROSCOPICA
Tinción de Gram
Morfología
Agrupación
En agar sangre
ver el tipo de
HEMÓLISIS
LITERATURA CITADA
- Díaz; R. G. y Toñi, L.I. Manual Práctico de Microbiología (2009) Ed. Masón, Barcelona.
- Koneman, W. E. Aller, S.D. Jinda, W.M. Schreckenberger. P.C. (2008). Diagnóstico
Microbiológico; 5ª. ed; Ed. Panamericana; España.
- Pelczar, M.J.Jr., R.D. Reid y E.C.S. Chan., Microbiología, (2004) 4a. de. MacGraw-Hill-Book,
Company, Nueva York.
- Prescott, L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. (2000) Microbiología. McGraw-Hill Interamericana.
Madrid. .
- Manual de Prácticas de microbiología. (2017) ENCB del IPN. México, DF.
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