PRÁCTICA 7.

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

PRESENTADO POR
MARIA CAMILA ARCINIEGAS MORENO
MARIA JULIANA MARTINEZ ARCILA
LIZBETH JOHANA PERALTA

ENTREGADO A
ELIANA MENDOZA MENDOZA

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE MANIZALES

MANIZALES-CALDAS
BIOTECNOLOGÍA
2021
 PRÁCTICA 7. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

INTRODUCCIÓN
Los microorganismos han sido utilizados para modificar diversas materias primas y obtener
así bebidas fermentadas, las cuales constituyen un área extremadamente importante de la
industria alimentaria. Dichas modificaciones ocurren mediante un proceso denominado
"fermentación alcohólica", en donde a través de levaduras como Saccharomyces cerevisiae
y de bacterias como Zymomonas mobilis, se asimila la glucosa presente en los zumos de
frutas y/o en los desechos orgánicos, para metabólicamente convertirlos en alcohol etílico y
otros productos secundarios. Un ejemplo práctico de lo anterior, en el cual centraremos
nuestro estudio será en la fermentación de jugo de uva para la elaboración del vino.
OBJETIVO GENERAL
Realizar el seguimiento desde el punto de vista microbiológico y fisicoquímico de una
fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae para la obtención de vino.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

⮚ Aplicar las técnicas de análisis fisicoquímico para el seguimiento de la concentración

del sustrato y el producto a través de la fermentación.
⮚ Aplicar las técnicas de análisis microbiológico para el seguimiento de la
concentración de biomasa a través de la fermentación.
⮚ Cuantificar los rendimientos producto-sustrato y biomasa-sustrato como variables
fundamentales para el análisis de los procesos fermentativos.
RESULTADOS
Después de obtener un volumen del mosto de 720 mL se procedió a realizar análisis físico
químico y microbiológico a partir de 20 mL de muestra (mosto).

● Tiempo inicial
Fecha 25 de octubre de 2021
Hora: 11:00 AM
DENSIDAD: Por medio del picnómetro
𝑃𝑖𝑐𝑛𝑜𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑙𝑙𝑒𝑛𝑜 − 𝑃𝑖𝑐𝑛𝑜𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜
𝐷=
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑛𝑜𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜
14,69𝑔 − 8,17 𝑔
𝐷=
5 𝑚𝐿
𝐷 = 1,304 𝑔/𝑚𝐿
% SST: Por medio del refractómetro
%𝑆𝑆𝑇: 11,9%

% ACIDEZ LIBRE: % de ácido tartárico.

Volumen gastado en la titulación: 6,5 mL
Normalidad del titulante (NaOH): 0,1N
mEq = miliequivalentes/mg del ácido tartárico: 0,15009
Volumen de muestra: 5 mL

𝑉𝑡 ∗ 𝑁 ∗ 𝑚𝐸𝑞
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 = ∗ 100
𝑉𝑚
6,5 𝑚𝐿 ∗ 0,1 ∗ 0,15009
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 =
5 𝑚𝐿
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 = 0,019 ∗ 100

% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 = 1,95%

CUANTIFICACIÓN DE AZÚCAR:
Método DNS: Se realizó la lectura de la dilución 10-3 a 540 nm
Blanco: 0,000
Muestra (dilución 10-3): 1,501
Para determinar la concentración de azúcares reductores mediante el método del DNS se
emplea la ecuación de la curva de calibración obtenida en la Práctica N. 6.
 Y = 0,83x + 0,0277
Para la determinación de azúcares reductores de la muestra que se utilizó para la lectura en
el método DNS se despeja X. Según la ecuación generada en la curva de calibración de
azúcares reductores se debe hallar la concentración de X, se debe tener en cuenta que la
absorbancia de la muestra es 1,501, por lo tanto, la concentración que se obtiene es la
siguiente:
𝑌 = 0,83𝑥 + 0,0277
1,501 = 0,83𝑥 + 0,0277
1,501 − 0,0277 1,4733
𝑋= = = 1,77
0,83 0,83
𝑋 = 1,77 𝑝𝑝𝑚
La concentración de azucares reductores de la muestra de mosto de la dilución 10-3 es de:
1,77 ppm

%𝐴𝑧ú𝑐𝑎𝑟 = %𝑆𝑆𝑇 − %Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧

%Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 1,95

Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = = 1,49%
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 1,304
%𝐴𝑧ú𝑐𝑎𝑟 = 11,9% − 1,49%
%𝐴𝑧ú𝑐𝑎𝑟 = 10,41%

MICROBIOLÓGICO:
Recuento en placa
Se realizó siembra por superficie de las diluciones 10-2, 10-3, 10-4.

2
3
1

Imagen 1: Dilución 10-2 Imagen 2: Dilución 10-3 Imagen 3: Dilución 10-4

Con base en las imágenes la dilución que se aproxima al rango microbiológico (10-100) es
la dilución 104, sin embargo, supera el rango se estima un recuento de 280 colonias, por lo
tanto, el reporte definitivo sería el siguiente:

⮚ Se aplica la fórmula N x Inv.dil. x 10

280 x 104 x 10
⮚ El reporte debe ser dos cifras significativas, por lo tanto, quedaría así:
28 x 106
⮚ Reporte definitivo: 28 x 106 UFC/mL. Conteo estimado

Recuento en Cámara de Neubauer

Recuento en la dilución 10-3, en el cuadrante C

Recuento No.1 Recuento No.2

22 14 11 15 20 12 20 15 23 18
19 12 24 21 17 21 14 20 19 25
16 24 10 19 23 16 22 12 15 24
12 22 18 20 14 23 11 14 21 25
15 14 16 22 12 21 12 14 16 17

Reporte:
Promedio del recuento No.1 y No.2
1: 450
2: 432
882
450 + 432 = = 441
2
Se aplica la siguiente formula:
Células/mL = N * Inv. dilución * Fc
Células/mL = 441 * 103 * 2,5 x 105
Reporte definitivo 1102.5 x 108 Células/mL
 ● Tiempo 2:

Fecha: 27 de octubre de 2021 (miércoles)

Hora de toma de muestra: 4:15 pm

Densidad: Picnómetro
𝑃𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑙𝑙𝑒𝑛𝑜 − 𝑃𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜
𝐷=
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜
14,59𝑔 − 9,23 𝑔
𝐷=
4 𝑚𝐿
𝐷 = 0,34 𝑔/𝑚𝐿

% SST: Refractómetro: 4%

% ACIDEZ LIBRE: % de ácido tartárico.

Volumen gastado en la titulación: 6,3 mL
Normalidad del titulante (NaOH): 0,1N
mEq = miliequivalentes/mg del ácido tartárico: 0,15009
Volumen de muestra: 5 mL

𝑉𝑡 ∗ 𝑁 ∗ 𝑚𝐸𝑞
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 = ∗ 100
𝑉𝑚
6,3 𝑚𝐿 ∗ 0,1 ∗ 0,15009
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 =
5 𝑚𝐿
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 = 0,0189 ∗ 100
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 = 1,89%

CUANTIFICACIÓN DE AZÚCAR:

Método DNS:

%Acidez: 1,89
0,34 = 5,55%

% AZÚCAR: cuantificación a partir de los grados BRIX:

%Azúcar: % SST - % acidez

4% - 5,55%
= 1,55

ETANOL GENERADO:

Porcentaje de etanol: Blanco: 0,00

M1 (miércoles): 2,385
10 minutos después: 2,548
Fórmula de cuantificación de etanol:

V = volumen final (ml)

MW = peso molecular de la muestra (g/mol)
v = volumen de la muestra
d = longitud que recorre la luz
E = coeficiente de extinción
𝝙A = variación de absorbancia

Variación de la absorbancia:

A= (2,548-2,385) – (0,00 – 0,00)

A= (0,163) – (0)
A= 0,163

𝑐= 3.150 * 46.07 x 𝝙A = 0,7256/E x 𝝙A [g etanol/l simple solución]

6.3 * 1.00 * 0.100 * 2 * 1000

= 0.7256 x 0,163
6.3

= 0,115 x 0,163
= 0,018 g etanol/L de solución

MICROBIOLÓGICO:
Recuento en placa:
Se realizó siembra por superficie de las diluciones 10-5, 10-6, 10-7.
 Dilución 10-7 Dilución 10-6 Dilución 10-5

Rango microbiológico: 10-100 colonias

Dilución escogida: 10-5

⮚ Se aplica la formula N x Inv.dil. x 10

34 x 105 x 10
⮚ El reporte debe ser dos cifras significativas, por lo tanto, quedaría así:
34 x 106
⮚ Reporte definitivo: 34 x 106 UFC/mL.

RECUENTO EN CÁMARA:

UFC/mL:

Recuento en la dilución 10-4

Reportes cuadrantes: 131

Reporte definitivo: 13x109 Células/mL

● Tiempo 3:

Fecha: 29 de octubre de 2021

Hora de toma de muestra: 3:30 pm

Densidad: Picnómetro:
𝑃𝑖𝑐𝑛𝑜𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑙𝑙𝑒𝑛𝑜 − 𝑃𝑖𝑐𝑛𝑜𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜
𝐷=
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑛𝑜𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜
 14,61𝑔 − 9,23 𝑔
𝐷=
5 𝑚𝐿
𝐷 = 1,076 𝑔/𝑚𝐿
% SST: Refractómetro: 4,2%

% acidez libre: % de ácido tartárico.

Volumen gastado en la titulación: 6 mL
Normalidad del titulante (NaOH): 0,1N
mEq = miliequivalentes/mg del ácido tartárico: 0,15009
Volumen de muestra: 5 mL

𝑉𝑡 ∗ 𝑁 ∗ 𝑚𝐸𝑞
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 = ∗ 100
𝑉𝑚
6 𝑚𝐿 ∗ 0,1 ∗ 0,15009 ∗ 100
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 =
5 𝑚𝐿
% Á𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 = 1,80%

Cuantificación de azúcar:

%Acidez: 1,80%
1,076 = 1,67%

%Azúcar: % SST - % acidez

4,2% - 1,80%
= 2,4 %

Etanol generado:
Porcentaje de etanol: Blanco: 0,00
M2 (viernes): 2,271
10 minutos después: 2,708
Fórmula de cuantificación de etanol:
V = volumen final (ml)
MW = peso molecular de la muestra (g/mol)
v = volumen de la muestra
d = longitud que recorre la luz
E = coeficiente de extinción
𝝙A = variación de absorbancia

Variación de la absorbancia:

A= (2,708-2,271) – (0,00 – 0,00)

A= (0,437) – (0)
A= 0,437

𝑐= 3.150 * 46.07 x 𝝙A = 0,7256/E x 𝝙A [g etanol/l simple solución]

6.3 * 1.00 * 0.100 * 2 * 1000

= 0.7256 x 0,437
6.3

= 0,115 x 0,437
= 0,050 g etanol/L de solución

Microbiológico:
Recuento en placa:
Se realizó siembra por superficie de las diluciones 10-5, 10-6, 10-7.

Dilución 10-7 Dilución 10-6 Dilución 10-5

Rango microbiológico: 10-100 colonias

Dilución escogida: 10-7

⮚ Se aplica la formula N x Inv.dil. x 10

188 x 107 x 10
⮚ El reporte debe ser dos cifras significativas, por lo tanto, quedaría así:
18 x 109
⮚ Reporte definitivo: 18 x 109 UFC/mL. Conteo estimado
Recuento en cámara:
UFC/mL:

Recuento en la dilución 10-4

Reportes cuadrantes: 165

Reporte definitivo: 16x109 Células/mL

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Para el seguimiento de la fermentación alcohólica se realizó un análisis físico-químico donde
se evaluaron los siguientes parámetros como: Densidad, porcentaje de sólidos suspendidos
totales (%SST), acidez libre, cuantificación de azúcar por el método DNS y el método por
grados Brix. En cuanto al parámetro microbiológico se evaluó el recuento por cámara de
neubauer y UFC.
Densidad
Realizar el constante seguimiento de la densidad del vino es una de las claves de procesos de
fermentación, ya que este parámetro nos ayuda a saber el grado alcohólico de un vino.
Gracias a esta es posible conocer la cantidad de azúcares que quedan todavía en un mosto
por fermentar. O, lo que es lo mismo, cuánto le queda a ese zumo de uva para convertirse por
completo en un alcohol, como se evidencia en los resultados obtenidos hubo un declive de
esa densidad por producir alcohol, exceptuando el día dos, es decir el miércoles, ya que no
se midieron los 5 mL, sino 4 mL.
1. 1,304 g/mL
2. 0,34 g/mL
3. 1,076 g/mL

%SST
La medición de los sólidos solubles representa uno de los principales análisis a realizar
durante el proceso de elaboración de vinos de frutas. Constituye la piedra angular del proceso
de acondicionamiento del mosto, con el cual se logran las condiciones ideales de
fermentación. Este parámetro se midió por medio de un refractómetro, por lo tanto, se basa
en los cambios del índice de refracción que sufre una sustancia cuando otra es disuelta en
ella. Si consideramos el jugo de fruta como una sustancia constituida por agua, su índice de
refracción será mayor cuanto mayor sea la cantidad de azúcar presente en ella. Con base en
los anterior el porcentaje sólidos suspendidos totales fue disminuyendo al realizar el
seguimiento por los tres días, debido a que, la levadura utiliza la sacarosa de la fruta con
fuente de carbono, es decir disminuyendo su concentración y produciendo etanol. Por esta
razón se evidencia un descenso del %SST.
 1. 11,9%
2. 4%
3. 4,2%

%Acidez libre

La acidez es uno de los elementos más importantes de la elaboración de un vino. La acidez

de un vino se compone de distintos ácidos, en estado libre o compuesto, unos derivados de
la uva (málico, tartárico y cítrico) y otros de los distintos procesos de fermentación
(succínico, acético y láctico). Las distintas fermentaciones de un vino contribuyen a la
transformación, desaparición o aparición de los distintos ácidos. En este caso se analizó el
porcentaje de la producción de ácido tartárico que es el ácido específico de la uva y el vino.
La acidez del vino depende mucho de su riqueza en ácido Tartárico por ser el mayor liberador
de iones H+, supone del 25 al 30% de los ácidos totales del vino y es el más resistente a la
descomposición por bacterias, que lo transforman en ácido Láctico y Acético. El aumento de
alcohol y las bajas temperaturas lo precipitan en forma de cristales de Bitartrato Potásico y
Tartrato Cálcico neutro por lo cual el vino contiene de dos a tres veces menos ácido Tartárico
que el mosto del que procede, por lo anterior, se evidencia una disminución en la producción
de ácido tartárico en el seguimiento de los tres días.
1. 1,95%
2. 1,89%
3. 1,80%
Cuantificación de azúcar
El proceso natural de fermentación ocurre por medio de las levaduras, que se alimentan del
azúcar, presente en el jugo, transformándolo en alcohol y dióxido de carbono, por lo tanto la
determinación de los azúcares es un análisis esencial para el control de calidad en la industria
vinícola, con base en esto se puede evidenciar una disminución del azúcar al realizar el
seguimiento por los tres día, debido a que Saccharomyces cerevisiae utiliza como única
fuente de carbono la sacarosa del jugo de uva y lo convierte en etanol como se observa en
los siguientes datos:
1. 10,41%
2. 1,55%
3. 2,4%
Microbiológico
Al desarrollarse un microorganismo en un medio o en este caso en un biorreactor, este cursa
por las siguientes etapas: Latencia, exponencial, estacionaria, y la muerte, todo depende del
microorganismo, del medio y las condiciones que le brindemos. El primer día el recuento por
cámara de neubauer fue menor que los siguientes, debido a que la levadura estaba
adaptándose al medio para empezar a multiplicarse en forma exponencial y empezar a utilizar
el sustrato. Entonces comparado con los dos siguientes días fue mayor el día dos y tres, donde
ya estaba en fase exponencial. Por lo tanto, si se hubiera seguido con el seguimiento se habría
podido identificar la fase estacionaria y de muerte donde la levadura gastó todo el sustrato y
muerte.

CONCLUSIONES

1. Las buenas prácticas en el laboratorio implican tener presentes las normas universales de
bioseguridad, pero también se debe tener un adecuado trabajo en el laboratorio nos asegura
resultados confiables y más aún en los seguimientos a un bioproceso.
2. Los análisis físico-químicos utilizados en la práctica son de gran utilidad en el seguimiento
de bioprocesos y requieren de personal con gran destreza para ser precisos en los resultados
y así tener un buen criterio de evaluación del proceso de transformación que se está generando
como es el caso de la fermentación en vinos.
3. La Biotecnología y aplicación de seguimiento a los bioprocesos nos permite obtener
productos libres de contaminantes, con potencial para producir metabolitos secundarios y
productos innovadores que sean rentables a partir de organismos vivos para la
comercialización.
4. La importancia del seguimiento a un bioproceso nos permite coordinar y establecer
protocolos para obtener mejores rendimientos y asegurar la calidad de los productos que
estarán en el mercado ayudando así a que se cumpla un requisito indispensable como lo es el
costo beneficio.