Grado de Medicina

PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA

Nombre y apellidos...............................................................................
Laboratorio 1ª planta Antiguo Animalario (4)
Horario: 15:00-19:00
Material necesario: bata de laboratorio

PRÁCTICA 1

INTRODUCCIÓN TEÓRICA

Generación de anticuerpos en el laboratorio. Técnicas inmunológicas basadas en

la utilización de anticuerpos.

REACCIONES DE INMUNOPRECIPITACIÓN EN GEL

Una de las primeras observaciones de las reacciones antígeno-anticuerpo fue

su capacidad de precipitar en geles de agarosa cuando se combinan en
proporciones equivalentes. Este fenómeno es la base de muchas técnicas
inmunológicas entre las que se encuentra la doble difusión en gel (también llamada
técnica de Ouchterlony), la inmunodifusión radial simple o la contra-
inmunoelectroforesis.

1. Doble difusión en gel

En la doble difusión en gel, antígeno(s) solubles y anticuerpo(s) son
depositados en distintos pocillos de un gel de agarosa. Al difundir ambos en
sentidos opuestos y encontrarse, van reaccionando y precipitan en la zona de
equivalencia, dando lugar a la formación de bandas visibles.
Al tratarse de una doble difusión, el proceso es lento y las bandas se hacen
visibles al cabo de 48-72 horas. Se requiere además que antígenos y anticuerpos
se encuentren en concentraciones relativamente altas, del orden de mg/ml.
Esta técnica no permite hacer determinaciones de tipo cuantitativo y, por otra
parte, cuando se enfrentan mezclas complejas de antígenos y anticuerpos, es muy
poco resolutiva.
Cuando una misma preparación de antígenos ó anticuerpos es enfrentada a
distintos anticuerpos ó antígenos, las relaciones antígeno-anticuerpo pueden ser
determinadas a partir del patrón observado de bandas de inmunoprecipitación.

1A. Análisis de relaciones antigénicas entre distintas seroalbúminas animales

En esta práctica se van a analizar las relaciones antigénicas entre
seroalbúmina humana, de rata, de ratón y bovina (BSA), cuando son enfrentadas a
un suero policlonal de conejo anti-seroalbúmina humana (anti-SAH).

Técnica
1
1er día
1. Preparar el gel vertiendo 2 ml de agarosa (1% en PBS) fundida en la placa de
petri.
2. Esperar a que solidifique.
3. Hacer cinco pocillos según el esquema de abajo.
4. Depositar 15-20 l/pocillo de antisuero y de preparaciones antigénicas según
el esquema.
5. Cerrar con la tapa e incubar en un ambiente húmedo.

Diseño del experimento (tubos azules)

BSA O
O anti-SAH
suero humano 1:400 O O suero de ratón 1:25
O
suero de rata 1:25

Días posteriores
Observar el desarrollo de líneas de precipitación.

1B. Análisis de las relaciones antigénicas entre distintas IgGs animales

En esta práctica se van a analizar las relaciones antigénicas entre IgGs

humana, de rata y de ratón cuando son enfrentadas a un suero policlonal de conejo
anti-IgG de rata.

Técnica
1er día
1. Preparar el gel vertiendo 2 ml de agarosa fundida en la placa de petri.
2. Esperar a que solidifique.
3. Hacer cuatro pocillos según el esquema de abajo.
4. Depositar 15-20 l/pocillo de antisuero y de preparaciones de IgG según el
esquema.
5. Cerrar con la tapa e incubar en un ambiente húmedo.

Diseño del experimento (tubos negros)

anti-IgG de rata
O
suero humano O O suero de ratón 1:10
O
suero de rata 1:10

Días posteriores
Observar el desarrollo de líneas de precipitación.

2
2. Inmunodifusión radial simple
Las pruebas de inmunodifusión radial simple son un caso particular de
reacciones de inmunoprecipitación en gel.
En este tipo de ensayo, uno de los componentes de la reacción Ag-Ac está
homogéneamente presente en el gel. En los pocillos que se practican en el gel, se
depositan muestras del otro componente. Éste irá difundiendo por el gel, de manera
radial, a partir del pocillo, estableciéndose un gradiente. Se trata, pues, de una
difusión simple, porque sólo difunde uno de los componentes. En la zona de
equivalencia, se producirá con mayor intensidad la reacción Ag-Ac que dará lugar
a la precipitación; en este caso, por tratarse de una difusión radial, esa línea de
precipitación adoptará la forma de un anillo o círculo de precipitación. El diámetro
del anillo será función de la concentración inicial en el pocillo del componente que
ha difundido.
Como en la doble difusión en gel, Ag y Ac han de estar a concentraciones
relativamente altas, del orden de mg/ml. El desarrollo de los anillos es más rápido,
pero requiere al menos 24 horas.
Esta técnica no se utiliza con fines cualitativos, pero sí cuantitativos. A partir
de muestras estándar, con concentraciones conocidas del componente que
difunde, se puede establecer una recta patrón que relacione diámetro con
concentración. Las concentraciones del componente en muestras problemas se
pueden deducir por interpolación con referencia a la recta patrón a partir de las
medidas de los diámetros observados.

Práctica
Se trata de observar el desarrollo de anillos de precipitación cuando una
preparación de suero humano normal, a concentraciones distintas, difunde en un
gel que contiene anti-IgG humana.

Materiales
1. Placa de petri.
2. Agarosa fundida, a 45 ºC, conteniendo anti-IgG humana.
3. Suero normal humano diluido 1:200, 1:400 y 1:800.

Técnica
1. Preparar el gel vertiendo 2 ml de agarosa fundida en la placa.
2. Esperar a que solidifique.
3. Hacer tres pocillos espaciados según el esquema de abajo.
4. Depositar 15-20 l/pocillo de cada una de las tres preparaciones de suero
humano.
5. Cerrar con la tapa, e incubar en un ambiente húmedo.

3
 Diseño del experimento (tubos rojos)
Dilución 1:200
O

Dilución 1:800 O O dilución 1:400

Días posteriores
Observar el desarrollo de líneas de precipitación.

HEMAGLUTINACIÓN EN PORTA
Materiales

1. Suspensión de eritrocitos de oveja (SRBC) en PBS.

2. Anticuerpos 8.4A9.13 y 5C10.33.
3. Portas.
4. Micropipetas automáticas.

Técnica

1. En dos portas se depositan dos muestras de 10 l de la suspensión de

hematíes.
2. Al lado de una de estas muestras se depositan 100 l del anticuerpo 5C10.33,
y, al lado de la otra muestra, 100 l del anticuerpo 8.4A9.13.
3. Mezclar cada una de las muestras de eritrocitos con su correspondiente
sobrenadante, utilizando puntas amarillas de pipeta.
4. Una vez hechas las mezclas, balancear suavemente al porta y esperar a que
se produzca la aglutinación.
5. Observar y anotar los resultados.

Diseño de la prueba

5C10.33 hematíes 8.4A9.13 hematíes

4
PRÁCTICA 2

EXPLICACIÓN DE LOS FUNDAMENTOS Y RESULTADOS DE LAS PRUEBAS

DE INMUNODIFUSIÓN EN GEL OBTENIDAS EL DIA ANTERIOR

Demostración
Se observarán distintos tipos de placas de inmunodifusión radial en las que
se han desarrollado pruebas clínicas.

MICROHEMAGLUTINACIÓN EN PLACA

Cuando una preparación de anticuerpos específicos se enfrenta a un antígeno

particulado, pueden observarse reacciones de aglutinación. Si el antígeno particulado
es una suspensión de eritrocitos, se observará una hemaglutinación.
Si una serie de diluciones sucesivas de una preparación de anticuerpos anti-
eritrocitos se enfrenta a una cantidad constante de eritrocitos, se observará
aglutinación mientras la cantidad de anticuerpos presentes sea suficiente para aglutinar
a los eritrocitos, pero se alcanzará una dilución/concentración en que esa cantidad ya
no lo sea. De esta manera, se puede medir la cantidad de anticuerpos aglutinantes
existentes en una determinada preparación. Esto es lo que se llama titular un suero o
preparación de anticuerpos, en este caso referido a su capacidad hemaglutinante; el
título se define entonces como la inversa de la última dilución ensayada que aún mostró
actividad aglutinante.
En esta práctica se va a proceder a la titulación del antisuero de conejo anti-
eritrocitos de oveja (SRBC) en una placa de 96 pocillos. Las determinaciones se harán
por duplicado.

Materiales
1. Placas microtiter con pocillos de fondo en U.
2. Tampón fosfato salino PBS+ 0.1% azida sódica (PBS-AS).
3. Suero policlonal de conejo anti-SRBC.
4. Suspensión de SRBC al 1% en tampón PBS-AS.
5. Micropipetas.

Técnica
1. Depositar 200 ul/pocillo de suero de conejo anti-SRBC en dos pocillos, de fondo en
U de una placa microtiter, de la columna 1, según el esquema, y 100 ul/pocillo de PBS-
AS en los demás pocillos de las mismas filas y de las columnas 2 a 12, incluída.
2. Realización de diluciones seriadas 1:2 del antisuero policlonal.
Con una pipeta multicanal en la que se han insertado dos puntas amarillas de pipeta
en posiciones contiguas y en la que el volumen se ha ajustado a 100 ul/pocillo, tomar
100 ul/pocillo de los dos pocillos de la columna 1 y pasarlos a los 3 pocillos de la
columna 2.

5
Pipetear con suavidad, arriba y abajo varias veces, para diluir el antisuero.
Tomar entonces 100 ul/pocillo de los dos pocillos de la columna 2, y pasarlos a los dos
pocillos de la columna 3.
3. Repetir sucesivamente el punto 2 hasta la columna 12.
4. Retirar 100 ul/pocillo de la mezcla de los dos pocillos de la columna 12 y desecharlos
junto con las puntas de pipeta.
5. Añadir finalmente 100 ul/pocillo de la suspensión SRBC a todos los pocillos.
6. Con suavidad dar golpecitos con la pipeta multicanal a lo largo de todo el perímetro
de la placa con objeto de que los SRBC se mezclen bien con las diluciones del
antisuero.
7. Dejar la placa incubando a 37ºC durante al menos 1 hora.
8. Dejar la placa a temperatura ambiente hasta el día siguiente.
9. Observar y anotar los resultados.

Diseño del experimento

6
PRÁCTICA 3

ELISA (enzyme-linked inmunoabsorbent assay)

El ELISA es una técnica de enzimoinmunoensayo que puede ser empleada

con fines analíticos o cuantitativos, tanto para determinar antígenos como
anticuerpos, y que, en consecuencia, admite distintas modalidades de ejecución.
Mientras que la técnica del Western-blot sólo es aplicable a proteínas que han
de ser desnaturalizadas, y, por lo tanto, está restringida al reconocimiento de
epítopos lineales, los ensayos ELISA pueden ser aplicados a otros tipos de
moléculas biológicas y no biológicas. Además, aquellas moléculas se adsorben a
las superficies o interaccionan con los anticuerpos sin perder su conformación, por
lo que en el ELISA se identifican epítopos conformacionales y lineales. El ELISA y
el Western-blot son técnicas mucho más sensibles que las de inmunoprecipitación
en gel.
En el ELISA, la positividad final del ensayo se pone de manifiesto mediante la
adición de un sustrato incoloro, específico para el enzima implicado, que rendirá un
producto coloreado soluble. El desarrollo de color, en medio líquido, puede ser
cuantificado midiendo su absorción óptica a una determinada longitud de onda.
En esta práctica, se va a estudiar el reconocimiento del lisado de eritrocitos
de oveja por el suero policlonal de conejo anti-SRBC. Como preparación de
anticuerpos control, se utilizará suero preinmune de conejo. Además, como
antígeno control negativo, se incluirá seroalbúmina bovina (BSA).
Las determinaciones de harán por triplicado.

1er día (adsorción de antígeno(s) a los pocillos)

1. Rellenar los pocillos con 100 l de solución de Ag siguiendo el esquema
inferior:
6 pocillos (de dos filas por tres columnas) con lisado de hematíes SRBC; y
6 pocillos (de dos filas por tres columnas) con solución de albúmina (BSA).
2. Incubar a 37ºC durante 1 hr.

Diseño del experimento

Antígenos
lisado de hematíes Albúmina
(SRBC) (BSA)

     
     

3. Desechar los 100 l/pocillo de las soluciones antigénicas, invirtiendo con

rapidez la placa,
4. Lavar 3 veces -200 l/pocillo- con PBS-Tw (PBS + 0.05% Tween 20, pH final
7.3)
7
 5. Rellenar los pocillos con 200 l de BSA (PBS 10mM+ 1% BSA, pH final 7.3).
6. Incubar a 37ºC durante 1hr y luego dejar en la nevera durante al menos una
noche.

CITOTOXICIDAD MEDIADA POR EL COMPLEMENTO

La formación de complejos antígeno-anticuerpo conduce a la activación del

complemento sérico por la vía clásica en presencia de Ca2+ y Mg2+. Si estos
complejos se forman en la superficie celular, la activación del complemento
desemboca en el desarrollo de complejos de ataque a la membrana que determinan
la lisis celular. Algunos componentes del complemento son termolábiles, de tal
manera que el complemento sérico puede ser inactivado mediante calentamiento
de los sueros a 56ºC durante al menos 30 minutos.
En esta práctica, se va a ensayar la actividad hemolítica de suero
preinmune de conejo; y de los sueros policlonal nativo y descomplementado de
conejo anti-SRBC. Las determinaciones se harán por triplicado.
Materiales
1. Hematíes de carnero al 1% (SRBC).
2. Tampón PBS con Ca2+ y Mg2+.
3. Suero policlonal nativo de conejo anti-hematíes (anti-SRBC nativo).
4. Suero policlonal descomplementado de conejo anti-hematíes (anti-SRBC
descomplementado).
5. Suero de un conejo preinmune.
6. Placas microtiter con pocillos de fondo en U.
Técnica
1. Depositar 50 l/pocillo de una suspensión de hematíes (SRBC) en una placa
microtiter, según el esquema abajo indicado.
2. Añadir 50 l de cada uno de los sueros de conejo: Suero anti-SRBC nativo,
descomplementado y preinmune (dilución 1:25) a tres pocillos y resuspender
bien, pipeteando con suavidad, unas cinco veces.
3. Incubar a 37 C durante 1 hora y observar los resultados.

Diseño del experimento

Suero nativo (Ac+SC)

Suero
descomplementado (Ac)

suero preinmune (SC)

8
PRÁCTICA 4

Observación de los resultados del test de citotoxicidad de

complemento
Anotar e interpretar los resultados.

CONTINUACIÓN DEL ELISA

3er día

1. Lavar 3 veces -200 l/pocillo- con PBS-Tw (PBS + 0.05% Tween 20, pH 7.3).
2. Rellenar los pocillos con100 l de la solución de las diferentes Acs primarios
según el esquema inferior: Suero de conejo anti-SRBC (1:1000) en la fila de
arriba y suero de conejo preinmune (1:1000) en la de abajo.

Diseño del experimento:

Antígenos
lisado hematíes (SRBC) Albúmina (BSA)
Anticuerpo primario
Suero conejo anti-SRBC      
Suero conejo pre-inmune      
3. Incubar a 37ºC durante 30 minutos en la estufa.
4. Lavar 3 veces -200 l/pocillo- con tampón para la fosfatasa alcalina (50 mM
TBS+ 0.05% Tween-20, pH 7.5).
5. Rellenar los pocillos con 100 l de la solución de Ac secundario: anti-IgG de
conejo conjugado a fosfatasa alcalina (dilución 1:2000) en tampón de incubación.
6. Incubar a 37ºC durante 30 minutos en la estufa.
7. Lavar 3 veces -200 l/pocillo- con tampón para la fosfatasa alcalina pH 7,5 .
8. Preparar la solución sustrato de pNPP y añadir 100 l/pocillo.
9. Observar el desarrollo de color.
10.Opcional: (Detener la reacción con 100 l/pocillo de NaOH 3M)
11.(Leer la absorbancia óptica a 492 nm (620nm de referencia).

Solución sustrato de pNPP (preparada inmediatamente)

Disolver 1 tableta de 20 mg de pNPP (Sigma) en 20 ml de buffer sustrato

(dietanolamina 1M + Cl 2Mg 0.5 mM, pH 9.8), precalentado a 37ºC.

DURANTE LAS INCUBACIONES SE EXPLICARÁN LOS FUNDAMENTOS

TÉCNICOS DEL ELISA Y DE TÉCNICAS RELACIONADAS

9
PRÁCTICA 5

HISTOCOMPATIBILIDAD DE LOS TRASPLANTES

En esta práctica se estudiará como se realiza el tipaje de las moléculas HLA

para aumentar la compatibilidad entre el donante y receptor de un trasplante, y la
determinación de los anticuerpos anti-HLA y sus implicaciones clínicas antes y
después de relaizar un trasplante.

Las moléculas del MHC o HLA son moléculas de membrana cuya función
biológica consiste en presentar a los linfocitos T péptidos derivados de las proteínas
intracelulares. Existen dos tipos de moléculas de MHC denominadas de clase I
(presentes en todas las células nucleadas del organismo) y de clase II (que están
en las células presentadoras de antígeno). Las moléculas de MHC son poligénicas,
es decir, existen diversas moléculas tanto de MHC de clase I como de clase II
diferentes. Existen tres loci de clase I, denominados HLA-A, HLA-B y HLA-C; y otros
tres de clase II, llamados HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Estas moléculas tienen una
característica que las diferencia del resto de las proteínas de los vertebrados y es
su extremado polimorfismo, siendo las proteinas más polimórfica descritas hasta la
actualidad en los seres humanos.

Los trasplantes se empezaron a generalizar a partir de los años 60. Los

primeros trasplantes fueron un fracaso, ya que el huésped producía una reacción
inmunológica (denominada rechazo) que destruía el órgano transplantado. La diana
antigénica de la respuesta inmunológica del rechazo son fundamentalmente las
moléculas de MHC (siempre que haya compatibilidad ABO). Esto se debe a que
debido a su extremado polimorfismo es muy poco probable una identidad o
compatibilidad entre las moléculas HLA entre el donante y receptor, y por tanto, el
sistema inmune reconoce las moléculas MHC polimórficas como extrañas y las
destruye. Por ello, para realizar un transplante es necesario que exista la mayor
compatibilidad posible entre las moléculas de MHC del donante y receptor. Esta
compatibilidad puede variar según el tipo de trasplante, y no hay las mismas
exigencias para un trasplante de riñón que para uno de progenitores
hematopoyéticos.

Para realizar un trasplante con éxito es necesario determinar que moléculas

de MHC o HLA tiene el donante y posteriormente seleccionar el receptor con la
mayor homología o compatibilidad posible. La determinación de las moléculas de
HLA se denomina tipaje HLA y supone una gran dificultad debido al extremado
polimorfismo de estas moléculas. Clásicamente, el tipaje de HLA se realizaba
mediante técnicas serológicas, pero hoy en dia en los laboratorios de Inmunología
se utilizan mayoritariamente técnicas de Biología Molecular.

Además del tipaje HLA, es necesario determinar la presencia de anticuerpos

anti-HLA preformados en el receptor frente a las moléculas HLA de donante y
realizar una prueba cruzada entre donante y receptor, antes de considerar la
idoniedad del trasplante. Una vez realizado el trasplante, la monitorización de

10
anticuerpos anti-HLA generados de novo es esencial para determinar la evolución
del trasplante y prevenir el rechazo agudo y crónico.

En la práctica de hoy se explicarán los fundamentos y las técnicas

necesarias para realizar:
- 1.- Tipaje HLA
- 2.- Determinar la presencia de anticuerpos anti-HLA
- 3.- Prueba cruzada donante-receptor
- 4.- Trasplante de progenitores hematopoyecticos
- 5.- Casos practicos para seleccionar el receptor o el donante más compatible
en un trasplante renal y de progenitores hematopoyéticos, respectivamente.

11
PRÁCTICA 6
__________________________________________________________

SEPARACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES

DE SANGRE PERIFÉRICA HUMANA

El objetivo de esta práctica es adquirir el conocimiento de las principales

técnicas para el aislamiento de poblaciones celulares específicas a través de sus
características fisicoquímicas.

En concreto:

1.-Se realizará el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica

mediante gradiente de densidad, y contaje celular (opcional)
2.-Se explicará el aislamiento de células sanguíneas en base a su
inmunofenotipo a través del uso de anticuerpos monoclonales, mediante:
2.1.- Técnicas de inmunofluorescencia (Introducción a la citometria de flujo y
Sorting)
2.2.- Técnicas inmunomagnéticas (Introducción a la tecnología MACS- magnetic-
activated cell sorting).

1.- Aislamiento de células monocleares por gradiente de densidad

En esta práctica a partir de sangre périferica humana, separaremos las células

mononucleares mediante gradiente de densidad con Ficoll. Posteriormente, estas
células mononucleraes serán visualizadas al microscopio (opcional) y
determinaremos como pueden ser cuantificadas en una cámara de contaje celular.

La separación de componentes celulares de sangre periférica a través de un

gradiente de densidad es una técnica muy sencilla que consiste en mezclar la
sangre con un tampón de densidad adecuada (Lymphoprep™ ó Ficoll-Hypaque,
que contiene diatrizoato sódico y sacarosa de densidad: 1.077 g/ml) que permitirá
la separación física de las células mononucleares de los polimorfonucleares y
hematíes (de mayor densidad y que quedaran en la parte inferior).

Materiales:

 Preparado de células de sangre periférica diluidas 1:2 en PBS (tampón fosfato

salino, pH 7.3).
 Solución LymphoprepTM (densidad 1,077 g/ml)
 Tubos de centrífuga.
 Pipetas Pasteur.
 Tampón PBS.

12
 Esquema de la
separación por
gradiente de
densidad

Técnica:

1.- Se añaden 3 ml de la Solución LymphoprepTM a un tubo de centrífuga

utilizando una pipeta Pasteur)
2.- Sobre esta solución, y con mucho cuidado de no romper el gradiente, se van
añadiendo con una pipeta Pasteur limpia 6 ml de células de sangre periférica.
Es aconsejable hacer resbalar la sangre por las paredes del tubo para no
romper la interfase entre ambas soluciones.
3.- Centrifugar el tubo 20 min a 2000 r.p.m.
4.- Una vez centrifugado, recoger con una pipeta Pasteurel el halo en el que se
encuentran las células mononucleares y pasarlo a un tubo limpio.
5.- Lavar las células llenando el tubo de PBS (unos 5 ml) y agitando con la pipeta
Pasteur. Centrifugar 10 min a 1600 r.p.m.
6.- Retirar el sobrenadante y lavar otra vez las células repitiendo el paso 5.
7.- Retirar el sobrenadante y añadir  3 ml de PBS. Disgregar bien las células con
una pipeta Pasteur.
8.- Determinar la densidad celular mediante el contaje en cámara Neubauer
(opcional)

CONTAJE EN CÁMARA DE NEUBAUER

Para determinar la densidad celular en una suspensión se emplean diferentes

técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje celular, de la que existen
numerosas variantes entre ellas la que emplearemos en esta práctica (cámara de
Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular. El contaje con cámaras
nos proporciona un método para contar células efectivo y de bajo coste.

La cámara de Neubauer consiste en una placa gruesa de cristal en forma de

porta, cuya porción central está dividida en tres bandas perpendiculares al eje
longitudinal de la cámara. Cada uno de los ejes a su vez se subdivide en pequeños
cuadrantes de forma que deja 4 cuadrantes (azul) o cuadros grandes idénticos,
situados en los cuatro vértices. Cada uno de estos, a su vez están divididos en 16
cuadritos iguales (rojo) que se utilizan para el contaje de los linfocitos.

13
 Sobre esta cuadricula, se situa un cubre y en el medio se añade un volumen
determinado (10-15μl) de la suspensión celular que queremos cuantificar. Al
microscopio, se cuentan las células presentes en los 4 cuadrantes idénticos
(azules), contando en cada cuadrante los 16 cuadritos (rojo), y se divide entre 4 la
cifra obtenida (para obtener la media de los 4 cuadrantes). Esto número nos indica
el número de células medio en cada cuadrante (azul).

Como la longitud de cada uno de los lados de los cuadrantes es de 1 mm, y

la altura del espacio comprendido entre la superficie de la cámara y el cubre es de
0.1mm, el volumen del área del cuadrante (azul) será:

1mm x 1mm x 0.1 mm = 0.1mm3 = 0.1μl = 10-4 ml

Por lo tanto, el valor que obtenemos del contaje es el número de células en

10-4 ml (volumen del área del cuadrante). Para calcular el número de células por ml
(cels/ml) de nuestra suspensión celular utilizaremos la formula:

Nº cels/ml = nº de células medio en el cuadrante azul (cels) x 10-4 ml

2.-Aislamiento de células sanguíneas en base a su inmunofenotipo a través

del uso de anticuerpos monoclonales.

Las células inmunes poseen en su superficie receptores o moléculas

especificas de su proceso de diferenciación denominadas “cluster de
diferenciación” (CD). Algunas de estas moléculas son específicas de cada
población celular y otras se encuentran en más de una población celular. Estas
moléculas permiten caracterizar fenotípica y funcionalmente las diversas
poblaciones celulares inmunes mediante el uso de anticuerpos monoclonales.

Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo producido por un solo clon de

linfocitos B que se une específicamente con aquella molécula con carácter
antigénico frente a la que fue generado. Estos anticuerpos pueden marcarse con

14
determinadas estrategias (fluorocromos / unidos a microesferas) para poder
separar de manera específica células que presenten en su superficie la proteína
que reconocen.

Según la estrategia con la que está marcada el anticuerpo, podemos utilizar

diferentes técnicas para aislar las poblaciones celulares que expresen las
moléculas (CD) que reconoce ese anticuerpo de forma especifica. Entre las más
utilizadas están:

2.1.- Técnicas de inmunofluorescencia (Introducción a la citometria de flujo y

Sorting): La Citometría de flujo consiste en el análisis rápido de células en
suspensión dentro de un sistema de flujo laminar, sobre el que incide un haz de
luz que proporciona información acerca de sus características físico-químicas.
En esta práctica se explicarán los fundamentos básicos de un citometro de flujo
y las aplicaciones para identificar poblaciones inmunes.
Además, estas células/poblaciones inmunes identificadas pueden ser aisladas
utilizando sofisticados aparatos de Citoemtria de Flujo denominados “Cell
Sorters”

2.2.- Técnicas inmunomagnéticas (Introducción a la tecnología MACS-

magnetic-activated cell sorting): El método MACS permite que las células se
separen mediante el uso de nanopartículas magnéticas recubiertas con
anticuerpos contra un antígeno de superficie particular. Esto hace que las células
que expresan este antígeno se adhieran a las nanopartículas magnéticas.
Después de incubar ambas, la solución se transfiere a una columna en un campo
magnético fuerte. En este paso, las células unidas a las nanopartículas (que
expresan el antígeno) permanecen en la columna, mientras que otras células
(que no expresan el antígeno) fluyen a través de ellas. Con este método, las
células se pueden separar positiva o negativamente con respecto al antígeno(s)
particular(es).

15
PRÁCTICA 7
_______________________________________________________________

Observación de las pruebas de inmunoprecipitación en gel

Observación de la prueba de hemaglutinación y del resto de las pruebas
realizadas en estas prácticas
Interpretación de resultados

REVISIÓN FINAL DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LAS PRÁCTICAS

El alumno deberá responder por escrito a las preguntas que le haga el

profesor. Para responder las preguntas podrá utilizar apuntes, libros y el material
empleado durante las prácticas.

16