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b- Inclusión en parafina.
c- Corte en el Microtomo
a- Contraste negativo.
b- Sombreado metalico.
c- Criofractura – réplica.
6. Citoquimica
7. Histoquímica.
8. Inmunohistoquimica.
9. Fraccionamiento Celular.
EL MICROSCOPIO
El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50 micras de diámetro ni consigue resolver dos
líneas separadas por menos de 100 micras (es decir, las ve como una sola línea).
Para observar elementos tan pequeños es necesario disponer de lentes de aumento. Estas lentes se
conocen desde tiempos de Arquímedes, pero la óptica como disciplina se comenzó a desarrollar en el
siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon.
Anton Van Leeuwenhoek (Holanda, 1632-1723), un pulidor de lentes aficionado, logró fabricar lentes lo
suficientemente poderosas como para observar bacterias, hongos y protozoos, a los que llamó
"animálculos".
El primer microscopio compuesto fue desarrollado por Robert Hooke. A partir de éste, los avances
tecnológicos permitieron llegar a los modernos microscopios de nuestro tiempo, los que existen de varios
tipos y son usados con diferentes fines.
TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIOS ÓPTICOS
Microscopio de contraste de fase: posibilita la observación de muestras sin colorear, por lo que
resulta útil para estudiar especímenes vivos.
Microscopio de interferencia: es una modificación del anterior que permite la cuantificación de masa
en los tejidos.
Microscopio de barrido confocal: se usa para estudiar la estructura de sustancias biológicas. Combina
partes de un microscopio de campo claro con equipo fluorescente y un sistema de barrido que emplea un
rayo láser. A través de una computadora se reconstruye la imagen tomada por planos, a una imagen
tridimensional.
Microscopio de luz ultravioleta: sus resultados se registran fotográficamente ya que la luz U.V. no es
visible y daña la retina. Se utiliza en la detección de ácidos nucleicos, que absorben esta luz.
Microscopio de luz polarizada: es una modificación del microscopio de campo claro. Debido al
fenómeno de birrefringencia se pueden observar sustancias cristalinas y moléculas fibrosas.
MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS
Microscopio electrónico de transmisión (MET): utiliza un haz de electrones para producir la imagen.
Permite la observación de detalles a escala macromolecular.
Es el principal medio que utilizaremos a lo largo de toda la materia para observar la morfología de los
tejidos a estudiar, por lo que debemos conocer en detalle sus partes y el funcionamiento de cada una de
ellas.
Sistema Mecánico
Pie
Vastgo o columna
Tornillos de ajuste macrométrico
Micrométrico
Tubo
Platina
Subplatina
Sistema Óptico
De Observación Ocular
Objetivo
De iluminación condensador
Espejo
Fuente de luz
SISTEMA MECÁNICO
Este sistema sostiene al sistema óptico y aloja los elementos necesarios para la iluminación y enfoque
del preparado.
Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que permite
el enfoque.
Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un
orificio central que permite el paso de la luz y un venier que posibilita la relocalización de los detalles de
interés.
Objetivo: está formado por un sistema de pequeñas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la
que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser
objetivos a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u objetivos
de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo índice de refracción es
muy similar al del vidrio).
Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior
se denomina lente ocular y la inferior lente colectora.
Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Debajo
de él se encuentra el diafragma iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador.
Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte inferior del aparato, en caso de no
poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa (lámpara incandescente común) aproximadamente a
30 cm. del espejo.
ESCALA DE REPRODUCCIÓN: relación lineal que existe entre el tamaño del objeto y su imagen, por
ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc.
LÍMITE DE RESOLUCIÓN: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan
visualizarse por separado.
PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles más finos. Está en
relación inversa con el límite de resolución.
AUMENTO TOTAL: Debemos notar que el ocular también tiene un aumento, por lo tanto el aumento
total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo:
si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento
de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400.
3. El condensador debe estar en la posición más alta y el diafragma abierto. Esto si el preparado está
coloreado, sino el diafragma debe estar cerrado.
6. Luego de estudiado el preparado con este objetivo, podemos pasar gradualmente a objetivos de
mayor aumento, corrigiendo la apertura del diafragma para cada uno de ellos.
7. En caso de utilizar el objetivo de inmersión, se coloca una pequeña gota de aceite sintético sobre el
preparado y luego se enfoca con sumo cuidado, recordando que este objetivo es el de menor distancia
frontal y corremos el riesgo de estropear el preparado y la lente frontal. Al finalizar el uso de este
objetivo se deben retirar los restos de aceite con un papel de carilina o una gasa embebida en xilol o
solvente especial para limpieza de lentes, nunca se debe dejar sucio el objetivo.
Se define técnica histológica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin
de posibilitar su estudio al microscopio.
El examen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa que la luz debe
"atravesar" el objeto a examinar para llegar, después de haber pasado por las distintas lentes del
aparato, a impresionar a nuestro órgano visual. Por esa causa, debe ser reducido a láminas muy
delgadas y transparentes, las cuales lograremos efectuando una serie de operaciones que serán
descriptas más adelante.
OBTENCIÓN DE LA PIEZA
El material a utilizar puede ser extraído de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de
material humano. Entre los animales de observación se eligen aquellos que por su semejanza con el ser
humano pueden sustituirlo sin grandes diferencias, y cuya obtención y crianza puede ser fácilmente
efectuada en el laboratorio.
- Muerte del animal: podemos producirla valiéndonos de un traumatismo brusco, o por la intoxicación a
causa de una dosis exagerada de narcótico.
- Extracción de los órganos: conociendo la anatomía del animal, debemos dirigirnos directamente a los
órganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos sean varios, es conveniente extraer primero
los que más fácilmente se descomponen, estos son el páncreas y la porción inferior del tubo digestivo.
- Reducción a piezas: teniendo en cuenta que para el tamaño de las piezas debemos considerar muy
especialmente las cualidades del fijador a usar, hablaremos de este asunto cuando tratemos la fijación.
El hombre no es sujeto de experimentación, esta verdad indiscutible hace que sólo en casos
excepcionales se pueda obtener material humano en condiciones de ser estudiado histológicamente. De
tres fuentes puede provenir el material humano: las necropsias, las biopsias y las piezas operadas. De
éstas, sólo la primera puede darnos material normal; las dos últimas proporcionarán tejidos patológicos.
- Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadáver. Para histología normal es necesario que se
trate de un cadáver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesión, por lo menos el órgano que se
quiere estudiar.
- Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al
microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico.
- Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas, generalmente
tumores u órganos inflamados, también pueden darnos material de investigación pero, como en el caso
anterior, sólo servirán para anatomía patológica.
FIJACIÓN
La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en
que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método histológico destinado a obtener
preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y química de las células y tejidos al
estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación
que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima.
Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan para tal fin.
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o
post-mortem (autólisis, desintegración, etc.).
2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la
pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior
(ejecución de cortes, coloración, etc.).
5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.
6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
Varía con la composición o naturaleza de los mismos: coagulando las proteínas sin combinarse con ellas
(alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas
(ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en contacto con las mismas y originando en su seno un
precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los
tejidos (recuérdese que éstos, en su mayoría, son reductores que muchos colorantes se transforman en
leucobases incoloras al combinar una molécula de hidrógeno con su cromóforo).
Fijadores químicos
Son los más utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y
fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitución.
FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga
de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios
histológicos topográficos.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea,
ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).
d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares.
FIJADORES COMPUESTOS:
En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin
de completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos.
FIJADORES FÍSICOS:
1. Desecación.
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.
5. Congelación y desecación.
Deshidratación
Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua;
impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los
tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por
una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol
etílico de graduación creciente.
Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol (este último es el
que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-
lechoso es que la deshidratación no ha sido bien lograda y debemos repetir el baño de alcohol absoluto
cerciorándonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no debe
enturbiarlo.
Penetración de la parafina
Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no
más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina.
En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo
punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se
pone el molde en heladera.
A los 15-30 minutos la parafina se habrá solidificado completamente, recortamos los bloques en forma
de pirámide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito de madera mediante una espátula
calentada con la llama de un mechero y ya podemos realizar los cortes con el micrótomo.
OBTENCIÓN DE CORTES
El objeto de la inclusión que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a
cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio.
Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de
espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones.
- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guías
especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.
- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, ésta
se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma
de cinta.
- Tipo congelación: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira
sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelación colocado
debajo de la platina que utiliza la expansión brusca del anhídrido carbónico contenido en un cilindro con
el cual se comunica.
- Crióstato: consta de un micrótomo tipo Minot incluido en una cámara de congelación. El volante de
inercia que controla la realización del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el
mecanismo de avance están situados dentro de la cámara fría (normalmente a -20º C). Pese a la
disposición horizontal de la cuchilla, la obtención de secciones seriadas es posible gracias a la existencia
de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los
modelos más modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, así como enfriar rápidamente
la muestra a -60º C gracias a la existencia de una placa de congelación instantánea. Frente al
micrótomo convencional de congelación, el crióstato posee la gran ventaja de permitir la obtención de
cortes mucho más delgados (por lo general de 4 µm y, en manos experimentadas, hasta 2 µm).
Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrótomo, en agua tibia contenida en un
cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos, previamente desengrasados, cubiertos con
una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histológica, se colocan los cortes sobre el
portaobjetos y a continuación se lo levanta.
COLORACIÓN
Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos.
Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el
color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante.
COLORANTES NATURALES:
- Animales (carmín)
- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)
- Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son
colorantes citoplasmáticos.
- Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de
metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el
citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del
líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).
HEMATOXILINA:
- Es un colorante vegetal.
- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios
meses de exposición) u oxidantes artificiales (óxido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato
potásico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilínicas (se utiliza
alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solución colorante), comportándose en
este caso como un colorante indirecto.
EOSINA:
- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos halogenados con tres grupos arilo).
- Presenta autofluorescencia espontánea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas.
MONTAJE
Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo, dado que
nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente
para evitar su deterioro.
La aclaración se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un
disolvente del Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere un índice de refracción semejante al
del vidrio.
Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de
Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto.
PROTOCOLO GENERAL
A continuación se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra cátedra para la técnica de
Hematoxilina - Eosína para preparados de uso didáctico:
I. Fijación
En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs.
II. Corte
Se le da el tamaño deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el fin de enjuagarla en
agua corriente durante, por lo menos, 15'.
III. Deshidratación
IV. Inclusión
V. Corte
VI. Coloración