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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

También llamada filtración por gel o cromatografía de permeación por gel, las moléculas
pequeñas penetran en los poros pequeños de la fase estacionaria, pero no las moléculas
grandes. Puesto que las moléculas pequeñas tiene que recorrer un volumen realmente
mayor, las moléculas grandes se eluyen primero (Tabla1). Ésta técnica se usa mucho en
bioquímica para purificar macromoléculas.
Las sales de masa molecular baja (o las moléculas pequeñas) se pueden eliminar de
disoluciones de moléculas grandes por filtración por gel. Ésta técnica, llamada desalado, es
útil para cambiar la composición del tampón de una disolución de macromoléculas.
TABLA 1
COLUMNA A
Las moléculas grandes no pueden penetrar en los poros de
la fase estacionaria. Se eluyen con un volumen de
disolvente igual al volumen de la fase móvil.
COLUMNA B
Las moléculas pequeñas que se pueden encontrar dentro
y fuera del gel, necesitan un volumen mayor para eluirlas.
V1 es el volumen total de la columna ocupada por el gel
mas el disolvente. V0 cuyo valor puede tomarse también
como VM, es el volumen de la fase móvil VR = V0 es el
volumen ocupado por el gel mas su fase líquida interna.

Fase estacionaria
Entre los geles utilizados en columnas abiertas de exclusión molecular, a escala preparativa,
se encuentra el Sephadex cuya estructura se muestra en la Figura 1,Sephadex, y el Bio-Gel
P, que es una poliacrilamida entrecruzada con N’N’- metilenbisacrilamida Figura 2.

FIGURA 1 FIGURA 2

Estructura del Sephadex, un dextrano Estructura de la N’N’- metilenbisacrilamida.


entrelazado.
Los tamaños de poro más pequeños en los geles muy entrecruzados no permiten el paso,
excluyen, moléculas de masa molecular mayores o igual a 700, mientras que los tamaños
de poro más grandes excluyen las moléculas de masa molecular igual o mayor a 10 8 TABLA
2.
Cuanto menor es el tamaño de la partícula del gel, mayor es la resolución y más lento el
flujo a través de la columna.

TABLA 2
NOMBRE INTERVALO DE NOMBRE INTERVALO DE
FACCIONAMIENTO FACCIONAMIENTO
(MASA MOLECULAR) PARA (MASA MOLECULAR) PARA
PROTEÍNAS GLOBULARES PROTEÍNAS GLOBULARES
Sephadex G-10 a 700 Bio-Gel P-2 100-1800
Sephadex G-15 a 1500 Bio-Gel P-4 800-4000
Sephadex G-25 1000-5000 Bio-Gel P-6 1000-6000
Sephadex G-50 1500-30000 Bio-Gel P-10 1500-20000
Sephadex G-75 3000-80000 Bio-Gel P-30 2500-40000
Sephadex G-100 4000-150000 Bio-Gel P-60 3000-60000
Sephadex G-150 5000-300000 Bio-Gel P-100 5000-10000
Sephadex G-200 5000-600000 Bio-Gel P-150 15000-150000
Bio-Gel P-200 30000-200000
Bio-Gel P-300 60000-400000

En HPLC pueden utilizarse moléculas de poliestireno con tamaños de poro desde 5 nm hasta
centenares de nm. Las partículas de un diámetro de 5micrometros dan 8000 platos por
metro de longitud de columna. La sílice micro porosa de tamaño de poro controlado
permite 10000-16000 platos/metro TABLA 3. La sílice se recubre de una fase hidrófila que
minimiza la adsorción de solutos. Se puede usar una resina de poliéster hidroxilada de
tamaño de poro bien definido en el intervalo de Ph de 2 a12, mientras que las fases de sílice,
generalmente, no pueden usarse por encima de Ph 8. Las partículas con diferentes tamaños
de poro se pueden mezclar para dar un intervalo más amplio de separación de tamaños
moleculares.

TABLA 3
DESIGNACIÓN TAMAÑO DE INTERVALO DE MASA MOLECULAR
PORO (nm) PARA PROTEÍNAS GLOBULARES
G2000SW 13 500-60000
G3000SW 24 1000-300000
G4000SW 45 5000-1000000
G5000SW 100 >1500000
FASE MOVIL

Los empacamientos para la cromatografía de


FIGURA 4
exclusión molecular están formados por pequeñas
partículas de sílice o polímero que contienen una red
de poros uniformes a los que pueden difundir las
moléculas de soluto o de disolvente. Mientras están
en los poros, las moléculas son atrapadas y
removidas del flujo de la fase móvil. El tiempo de
residencia promedio de las moléculas de analito
depende de su tamaño. Las moléculas que son
significativamente más grandes que el tamaño de
poro promedio del empacamiento son excluidas y no
experimentan retención, lo que significa que viajan a
través de la columna a la velocidad de la fase móvil,
Figura 4. Las moléculas que son apreciablemente más
pequeñas que los poros pueden penetrar a través del
laberinto de poros, así que son retenidas por tiempos
mayores y son las últimas en eluir. Entre estos dos Flujo de la fase móvil en la cromatografía
extremos, existen moléculas de tamaño intermedio de exclusión molecular.
Las líneas roja, verde y azul representan
cuyo promedio de penetración en los poros del las posibles trayectorias de las moléculas
empacamiento depende de sus diámetros. El en la fase móvil que son
fraccionamiento que ocurre en este grupo de significativamente, más grandes que los
moléculas está directamente relacionado con su poros
tamaño molecular y con su forma molecular. Debe
notarse que las separaciones por exclusión molecular difieren de otros procedimientos
cromatográficos por el hecho de que no ocurren interacciones físicas o químicas entre los
analitos y la fase estacionaria, las cuales se evitan dado que llevan a eficiencias de columna
más bajas. A diferencia de otras formas de cromatografía, hay un límite superior en el
tiempo de retención debido a que ninguna especie de analito se retiene más tiempo que
las moléculas pequeñas que son permeables en la fase estacionaria.
Selección de la fase móvil
Las interacciones secundarias suelen ser un problema, por lo tanto podría ser necesario
realizar una optimización del método, pues las interacciones o reacciones secundarias
podrían hacer que un analito tarde más tiempo en eluirse de lo esperado y aparentar ser
de un peso molecular más bajo. Los ajustes en la composición de la fase móvil como ser;
pH, fuerza iónica o modificadores orgánicos, pueden ayudar a superar estas dificultades.
También podría ser necesario refinar la elección de tamaño del poro, combinar columnas
en serie, reducir la velocidad de flujo del análisis o cambiar la temperatura para conseguir
la separación deseada, se recomienda tomar en cuéntalos siguientes puntos:
• No alterar el analito para evitar degradación o agregación.
• La fase móvil debe contener tampón, para lo cual es recomendable una sal inerte para
evitar las interacciones iónicas.
• Usar la fase móvil lo más antes posible luego de su preparación, pues el crecimiento
bacteriano es rápido en tampón diluido almacenado a temperatura ambiente.
• La vida útil del tampón es de menos de 7 días salvo que se refrigere.
• Filtrar antes de usar para eliminar partículas en agua o en sales de tampón.
• Los tampones fosfato de pH alto pueden reducir significativamente la vida útil de la
columna si se usan columnas de sílice.
Tamaño de columna
Las columnas para SEC habitualmente son mucho más grandes que las utilizadas para otros
tipos de cromatografía y funcionan con velocidades de flujo relativamente bajas o
velocidades lineales bajas. Las dimensiones estándar de las columnas para SEC son 7,8 x
300 mm, trabajan a 1,0 ml/min; en comparación, las columnas de fase reversa son
normalmente de 2,1 o 4,6 x 150 mm y trabajan a velocidades lineales 2-3 veces superiores.
Esto no es un efecto del tamaño de columna, sino que se debe al mecanismo de la SEC. Con
la SEC, no se produce el incremento en la concentración de las muestras que suele verse
con otras técnicas cromatográficas debido a la absorción o a la interacción con la fase
estacionaria. En consecuencia, las muestras analizadas mediante SEC se inyectan en
volúmenes mucho mayores (5-20 µl), con frecuencia a altas concentraciones (1-4 mg/ml).
Los tiempos de análisis son normalmente de 10-12 minutos por columna (para una columna
convencional de 7,8 x 300 mm a 1,0 ml/min) y los picos son normalmente anchos, por lo
que no se requieren elevadas velocidades de adquisición de datos. Para la comparación o
cuantificación de agregación de proteínas, se utiliza software de HPLC. Para obtener
información sobre la distribución de pesos moleculares en polímeros polidispersados, se
usa software específico para SEC.
Parámetros de la columna
• Tamaño del poro: depende del rango de pesos moleculares de la muestra para evitar la
exclusión de los componentes de la muestra y maximizar el volumen en la región de
separación requerida
• Tamaño de la partícula: use partículas más pequeñas para aumentar la resolución (aunque
también aumentará la retropresión)
• Longitud de la columna: equilibrio entre resolución y tiempo de análisis
• Identificación de columna: use columnas más pequeñas para reducir el consumo de
disolvente y el volumen de inyección
ECUACIÓN DE ELUCIÓN
En cromatografía de exclusión molecular, el volumen de la fase móvil (V M) se llama,
normalmente volumen vacío V0. La cantidad KM se define como:

Donde VR: es el volumen de retención de un soluto


VT: volumen total de la columna (VT =πr2x longitud, donde r es el radio)
En el caso de moléculas grandes que no penetran en el gel, VR = V0 y KM = 0. En el caso de
una molécula pequeña que penetra libremente en el gel, VR = VT y KM ≈ 1. Las moléculas de
tamaño intermedio penetran en algunos poros del gel, pero no en otros, de forma que KM
tenga un valor entre 0 y 1. Idealmente, la penetración en gel es el único mecanismo por el
cual son retenidas las moléculas en este tipo de cromatografía. En realidad, siempre existe
algo de adsorción, de modo que KM puede adquirir valores mayores a 1.
El volumen vacio se mide haciendo pasar una molécula inerte grande a atreves de la
columna. Su volumen de elución se define como V0. Para este fin la molécula más utilizada
es el azul de dextrano 2000, un colorante azul de masa molecular 2*106.

DETERMINACIÓN DE MASAS MOLECULARES


La filtración por gel se usa FIGURA 3
principalmente para separar
moléculas de masas moleculares
significantemente distintas FIGURA
3. Para cada fase estacionaria, existe
un intervalo dentro del cual se da una
relación logarítmica entre la masa
molecular y el volumen de elución
FIGURA 4. Se puede estimar la masa
molecular de una sustancia
comparando su volumen de elución
con el de patrones. Sin embargo se
debe tener cuidado al interpretar los
resultados, porque moléculas con la
misma masa molecular, pero
Separación de proteínas por cromatografía de exclusión
diferentes formas, presentan
molecular con una columna TSK 3000 SW.
características distintas de elución. PICOS:
En el caso de proteínas, es 1) Glutamato deshidrogenasa (290000).
importante usar una fuerza 2) Lactato deshidrogenasa (140000).
electrónica bastante alta (mayor que 3) Enolasa quinasa (67000).
0.05M), para eliminar la adsorción 4) Adenilato quinasa (32000).
electrostática del soluto por puntos 5) Citocromo C (12400)
ocasionalmente cargados que existen
en gel.
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA DE EXCLUCION
MOLECULAR:

 La separación de dos grupos de sustancias con pesos moleculares muy diferentes.


 La técnica, conocida como desalinización, es útil, por ejemplo, para la separación
de hemoglobina y cloruro sódico.
 El fraccionamiento de mezclas más o menos complejas de cromatografía liquida
de diferentes materiales como péptidos, ácidos nucleicos, enzimas, polisacáridos,
etc.
 Determinación de pesos moleculares comparando los volúmenes de elución de
patrones.
 Cambios de buffers. Después de cromatografías de intercambio iónico, afinidad o
de interacción hidrofóbica.
 Desalado. Proteínas, polisacáridos, poli péptidos etc. Pueden ser desalados antes
de ser concentrados o liofilizados.
 Eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos nucleicos.
 Eliminación de compuestos de bajo peso molecular marcados. FITC de las
soluciones de marcaje de proteínas.
 Para reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo peso molecular.
 Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas.
 Purificación de macromoléculas.
 Determinación del peso molecular de las proteínas.

La separacion consiste en los siguientes pasos:


La cromatografía de exclusión molecular separa las proteínas en función de su radio
hidrodinámico, una propiedad determinada tanto por el tamaño como por la forma de la
molécula. A diferencia del resto de los procedimientos cromatográficos descriptos
previamente, las proteínas no se unen a la fase estacionaria en la CEM. En cambio, las
proteínas se separan por la velocidad a la cual navegan a través de la fase estacionaria
inerte. Especies oligoméricas moléculas de proteínas desplegadas y especies truncadas
pueden ser separadas de la proteína nativa al mismo tiempo que se cambian los
componentes del búfer. A menudo, la CEM se utiliza como un método más veloz y más
confiable que la diálisis, ya que es compatible con una gama de solventes más amplia y
además requiere de menos búfer. Un único solvente es utilizado a lo largo de todo el
proceso de CEM y las fases estacionarias comerciales disponibles son compatibles con la
mayoría de los componentes de los búferes más utilizados.
Tanto el tipo de fase estacionaria utilizada como el largo de la columna juegan un papel
crítico con respecto a la resolución de las proteínas separadas por CEM. Varios tipos de
fases estacionarias se encuentran disponibles a nivel comercial, y la mejor opción depende
tanto del peso molecular de las proteínas que requieren separación como de las
condiciones en las cuales se realizará la separación.
Superdex es en general la mejor opción para CEM típicas, ya que es compatible con la
mayoría de los solventes y ofrece la mejor resolución de todas las fases estacionarias
disponibles.
Al igual que con otros métodos cromatográficos, la CEM tiene ventajas y desventajas, y la
decisión de utilizar este método depende tanto de la proteína como de la aplicación que se
le pretende dar a la misma.
Ventajas de la CEM:
 Permiten el intercambio de búfer y la desalación.
 Permite la separación de especies similares (por ej. especies truncadas y oligómeros) que
pueden no ser separables mediante otras técnicas de purificación.
 Es compatible con muchos solventes.
 No depende de ninguna propiedad específica de la proteína para su retención y elución.

Desventajas de la CEM:
 Su rendimiento es muy sensible al empaque de la columna.
 Puede haber interacciones no específicas entre la proteína y la resina, lo que disminuye la
resolución.
 Baja resolución para mezclas complejas de proteínas.
 La muestra debe ser sembrada en un volumen pequeño para obtener una resolución
adecuada. Esto puede ser problemático para proteínas que precipitan en altas
concentraciones.

Condiciones que aumentan la resolución de la CEM:


 Minimizar el volumen de muestra. Mientras menor sea el volumen, menos difusas serán
las fracciones eluidas.
 Agregar sal al búfer. Una pequeña cantidad de sal ayuda a prevenir las interacciones no
específicas entre la proteína y la fase estacionaria.
 Utilizar una velocidad de flujo moderada. Una corrida muy rápida no permitirá a las
moléculas pequeñas entrar en los poros, mientras que una corrida muy lenta le dará más
tiempo a la muestra para difundir.
 Asegurarse que la viscosidad del solvente y la muestra sean similares. Ajustar las
condiciones de la muestra de tal manera que se asemejen a aquellas del búfer de corrida.
 Ajustar el largo de la columna. Una columna muy corta no permite una separación
adecuada de las proteínas. Por otro lado, una columna muy larga lleva a la difusión de la
muestra proteica.
 Reempaque la columna. El empaque de la columna puede tener efectos enormes sobre la
resolución de proteínas

Si las partículas no se encuentran bien dispersas, o si hay burbujas de aire atrapadas en la


columna, la navegación a través de la fase estacionaria no ocurrirá de manera adecuada.
Además, si se dejó secar la columna se la debe reempacar. Un mal empaque es, en general,
el culpable de una inexplicable baja resolución.
Debido a que la CEM no separa a las proteínas en base a su interacción con grupos
funcionales, todas las proteínas eluyen bajo las mismas condiciones y, por ende, solo se
pueden resolver proteínas de radio dinámico
muy diferente. Por lo tanto, la CEM no es una
técnica cromatográfica apropiada para etapas
iniciales del esquema de purificación cuando
hay muchas proteínas contaminantes. La CEM
si ofrece, sin embargo, una forma confiable y
rápida de remover sales y pequeñas moléculas
de una muestra en los pasos iniciales o
intermedios de la purificación. En las etapas
finales de la purificación, cuando solo existen
contaminantes en muy baja concentración, la
CEM es un método valioso para el aislamiento
de la proteína y su pasaje al búfer de
almacenamiento.
Métodos de elución de proteínas
Las proteínas que se unen a la fase estacionaria son eluidas con condiciones de solvente
que rompen esas interacciones. Estas condiciones de elución varían tanto con el tipo de
cromatografía como con las propiedades de la proteína de interés. Existen tres métodos
generales para la elución de proteínas: elución en grupo, elución por partes y elución en
gradiente lineal. El mejor método a elegir depende del tipo de cromatografía que se está
haciendo y de la resolución requerida.
 En grupo - una sola condición de elución desplaza a todas las proteínas unidas en un solo
paso. Este mecanismo funciona mejor para procedimientos cromatográficos basados en
una interacción específica (por ej. la cromatografía de afinidad). La elución en grupo no
ofrece ninguna resolución, pero es ideal para eliminar los contaminantes de manera
rápida. Requiere de un conocimiento previo de las condiciones de búfer necesarias para
desplazar la proteína de interés.
 En pasos - se realizan múltiples eluciones en grupo de manera secuencial, con condiciones
menos permisivas en cada caso. En la elución en pasos, el número de fracciones
colectadas depende del número de condiciones de eluciones secuenciales. La elución en
pasos provee mejor resolución que la elución en grupo, pero peor resolución que la
elución en gradiente lineal.
 Gradiente lineal - múltiples fracciones consecutivas son recolectadas mientras se ajustan
las condiciones de elución de manera lineal. Un gradiente lineal ofrece la mayor resolución
para las cromatografías de intercambio iónico y de fase reversa. Típicamente se recolectan
un gran número de fracciones consecutivas.

La cromatografía de exclusión molecular no requiere de ninguno de estos métodos de


elución, ya que las proteínas no interaccionan con la fase estacionaria. La proteína se
siembra en la columna y un gran número de fracciones se recolecta hasta que todas las
proteínas hayan eluido, sin alterar las condiciones del búfer a lo largo del
procedimiento.
Análisis de la pureza de las fracciones
Luego de cada separación cromatografía se deben analizar las fracciones para determinar
cuáles de ellas contienen la proteína de interés, y además la pureza de esas fracciones. Este
análisis es necesario luego de cada paso para decidir qué fracciones deben ser combinadas
para su uso posterior. Para determinar la pureza se requiere un ensayo que pueda medir la
cantidad de una proteína específica relativa a la cantidad de proteínas totales. Los
siguientes ensayos son utilizados de rutina para el análisis de pureza:
 Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE, por su sigla
en inglés) - un gel desnaturalizante que separa las proteínas en función de su tamaño.
Tinciones disponibles comercialmente permiten obtener una representación visual de todas
las proteínas en la muestra, permitiendo realizar una valoración cualitativa de la pureza
proteica EL SDS-PAGE no es ideal para el análisis de una alta cantidad de fracciones y puede
llevar varias horas; sin embargo, es el utilizado con mayor frecuencia debido a que es fácil,
económico y funciona para cualquier proteína.
 Espectroscopia - un método para analizar las propiedades ópticas de las proteínas. Esta
técnica para analizar la pureza de las proteínas solo sirve para proteínas que tienen una
característica espectroscópica única, tal como el citocromo P450s. Las proteínas de esta
familia absorben luz a una longitud de onda a la que otras proteínas no por ende, una
comparación entre la absorbancia a 420 nm y a 280 nm (la longitud de onda a la que
absorben todas las proteínas) puede proveer una medida cuantitativa de la pureza de la
proteína. Este método es rápido y apto para procesar una alta cantidad de muestras.
 Actividad de la proteína - una prueba enzimática que depende de la proteína de interés.
Este método para evaluar la pureza proteica es, a menudo, acoplado a otro método de
determinación de concentración de proteínas para calcular la actividad en función de la
concentración total de proteínas. Los ensayos de actividad solo son aptos para proteínas
con actividad que puede ser fácilmente determinada utilizando un ensayo de alta capacidad
de procesamiento, tal como las proteasas. Para algunas proteínas los ensayos de actividad
son un método rápido y confiable para la detección de la proteína. La medición de actividad
es, a menudo, ideal para enzimas, ya que las proteínas que han perdido actividad pueden
ser excluidas de los pasos siguientes.

Almacenamiento de la proteína purificada


La elección de un búfer de almacenamiento final es tan importante como la elección de los
búferes utilizados durante la purificación. Esta elección debe basarse en la estabilidad de la
proteína y de las condiciones requeridas para su posterior aplicación. A menudo, la
cromatografía de exclusión molecular es elegida como el paso final en el esquema de
purificación, ya que el búfer final de almacenamiento puede ser intercambiado
efectivamente en este paso cromatográfico. Las fracciones puras pueden ser combinadas
para su inmediato almacenamiento. Alternativamente, las fracciones finales que fueron
combinadas pueden ser dializadas en el búfer seleccionado, previo a su almacenamiento.
Las condiciones de almacenamiento de la proteína dependen de la proteína de interés y
deben ser optimizadas de manera tal que la proteína mantenga su estabilidad estructural y
funcional a lo largo de períodos de tiempo prolongados. A menudo se incluyen aditivos en
el búfer de almacenamiento para prolongar el tiempo de vida de las proteínas purificadas,
y generalmente se requiere de un proceso de prueba y error para determinar las
condiciones óptimas, ya que cada proteína se comporta de manera particular.
Otra aplicación importante de la cromatografía de exclusión molecular es la determinación
rápida de la masa molecular o de la distribución de masas moleculares de un gran número
de polímeros o productos naturales. La clave para dichas determinaciones es una
calibración de masa molecular precisa. La calibración se puede llevar a cabo mediante
estándares de masa molecular conocida (método de posición de pico) o por el método de
calibración universal.
Este último método se basa en el principio de que el producto de la viscosidad molecular
intrínseca h y la masa molecular M es proporcional al volumen hidrodinámico
(Volumen efectivo incluyendo la capa de solvatación). Idealmente, las moléculas
Son separadas mediante cromatografía de exclusión molecular de acuerdo al volumen
hidrodinámico.
BIBLIOGRAFIA
 F. james Holler, Stanley R. Crourch; 2015; Fundamentos de Química Analítica 9na Edición.
 https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jchemed.5b00396
 http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-028X2012000200002
 Guía práctica de Agilent sobre CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO PARA EL
ANÁLISIS DE BIOMOLÉCULAS
 https://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2099/13132/LA%20CROMATOGRAF%C3%
8DA%20DE%20EXCLUSI%C3%93N,%20AN%C3%81LISIS%20DE%20LA%20DISTRI
BUCI%C3%93N%20DE%20PESOS.pdf
 analisis-quimico-cuantitativo-daniel-c-harris-3ra-edicion/