Proyecto Micropropagacion

PROYECTO INTEGRADO MICROPROPAGACION EESN°21 PLATANOS
PROFESORE/S
MOGENSEN GERONIMO CURSO: 6°1° MATERIA: AMBIENTE

DESARROLLO
ROMERO ANALIA CURSO:6°1° MATERIA: BIOLOGIA GENETICA
CURSO: 6°2° : AMBIENTE DESARROLLO
GAVILAN EVA CURSO:6°2° MATERIA: BIOLOGIA GENETICA
FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS

La reproducción asexual es utilizada para obtener una gran cantidad de plantines a partir
de una única planta. Dependiendo del caso, se aprovechan bulbos (cebolla), cormos
(gladiolos), rizomas (helechos), tubérculos (papas), tallos (banana), raíces (batata o
boniato, manzana, mora), hojas (begonia, espada de San Jorge), estacas (vid), etc. Las
plantas obtenidas por propagación asexual o vegetativa son idénticas a la planta madre e
idénticas entre sí. En otras palabras, son clones.

Se denomina totipotencia a la capacidad de una célula de generar réplicas del organismo
del cual deriva. Restringida en animales, esta propiedad característica de las plantas
permite la supervivencia en condiciones ambientales desfavorables o luego del ataque de
herbívoros, plagas y patógenos.

El cultivo in vitro o la micropropagación se inicia con la extracción de pequeños
fragmentos de tejido tomados de diversas partes de la planta, tales como hojas, raíces,
segmentos nodales y yemas axilares, yemas florales y apicales (Figura 1). Una vez
limpios y desinfectados, los explantes son transferidos en condiciones asépticas a un
medio de cultivo adecuado. Subcultivos periódicos de dichos explantes permiten la
amplificación del material y, más tarde, su diferenciación de modo de generar una planta
completa.

Figura 1. Las diversas partes de una planta angiosperma.
El cultivo in vitro puede desarrollarse inicialmente en un espacio reducido e

independientemente de factores climáticos y estaciones del año. Se calcula que 10 m2 de
estantes son suficientes para el cultivo de 20.000 plantines.El número de individuos que
se produce por cultivo in vitro es mucho mayor al número de individuos que podría
obtenerse por el método de multiplicación tradicional. El cultivo de una gema de eucalipto
puede originar en un año 75 trillones de mudas en vez de las 100 o 200 que se obtienen
habitualmente por estaquillado. Estos resultados son de gran interés para las industrias
del papel, celulosa y maderera.

El cultivo in vitro permite la producción y distribución de mudas libres de patógenos a
partir de tejidos meristemáticos, que no están infectados por virus. Un ejemplo es la
producción de tubérculos de papa libres de virus para la inclusión en programas de
certificación de papa-semilla.

También permite la producción de semillas sintéticas, que consisten en un embrioide
formado a partir de una masa de tejidos obtenida in vitro, envuelta en una sustancia
gelatinosa con nutrientes y cubierta por un plástico biodegradable. El conjunto constituye
una semilla artificial que se desarrolla normalmente cuando se siembra en la tierra.
Lanzada desde aviones, estas semillas facilitan la reforestación en regiones degradadas
de difícil acceso.

Las técnicas de cultivo in vitro de vegetales fueron asimiladas rápidamente por las
empresas e instituciones de investigación y desarrollo, porque facilitan el mejoramiento
genético de las variedades comerciales y, también, porque representan una etapa
indispensable en la obtención de una planta transgénica.
ACTIVIDADES A DESARROLLAR DURANTE EL PROYECTO
 PREPARADO DE INVERNACULO
 ACTIVIDADES DE INDAGACION SOBRE ANATOMIA Y FISIOLOGIA VEGETAL
 ACCION DE FITOHORMONAS
 PRACTICAS DE REPRODUCCION VEGETAL ASEXUAL
 PREPARADO DE MEDIOS DE CULTIVO IN VITRO
 PRACTICAS DE REPRODUCCION IN VITRO
 PRACTICA DE CROMATOGRAFIA
EVALUACION:
Actividad 1: clonación de planta

Ensayos de propagación de plantas
MATERIAL DE TRABAJO:
PLANTAS DE: BEGONIA, LAZO DE AMOR, BULBOS Y TUBERCULOS (CEBOLLA,
PAPAS, BATATAS)
TRINCHETA
SUSTRATO (TIERRA FERTIL)
RECIPIENTES (VASOS, MACETAS)
AGUA
HORQUILLA DE ALAMBRE O ESTACA DE MADERA
HERRAMIENTAS DE JARDINERIA
TERMOMETRO
PROCEDIMIENTO
MULTIPLICACION DE BEGONIA:
1) CORTAR TROZOS DE HOJAS (CADA TROZO DEBE LLAVAR COMO MINIMO
UN NERVIO PRINCIPAL) O EMPLEAR HOJAS ENTERAS A LOS CUALES SE
LES DA PEQUEÑOS CORTES EN LOS NERVIOS PRINCIPALES.
2) COLOCAR ENCIMA DE UN SUSTRATO COMPUETO POR TURBA Y PERLITA
3) ENRRAIZAMIENTO LA TEMPERATURA DEBE SER DE 25 A 28° C. UN
ESQUEJE PUEDE DAR DE 1 A 4 BROTES ADBENTICIOS, Y ENRRAIZAN A 25°
C EN UNAS SEMANAS.
4) REQUIERE ABUNDANTE LUZ, PERO NO LA INSOLACION DIRECTA.
MULTIPLICACION LAZO DE AMOR: ESTA Planta se reproduce principalmente por
estolones y da origen a una planta nueva que está unida a la planta madre:
1) Elegir una rama nueva, larga, flexible que soporte el arqueo.
2) Doblar en U el sector del tallo que se entierra, raspar o hacer una pequeña incisión
y colocar hormonas energizantes.
3) Mantener en su lugar sujetando con una horquilla de alambre o con una estaca de
madera.
4) La nueva planta enraizara
5) Una vez que se desarrolla, cortar el lado de la rama que se conecta con la planta
madre y trasladar a la maceta o tierra
RESULTADOS
REALIZAR UN CUADRO PARA EL REGISTRO ORDENADO DE LOS
RESULTADOS (PUEDE CONTENER LA SIGUIENTE INFO): TIPO DE PLANTA,
CARACTERISTICAS DE LA PLANTA, MECANISMOS DE REPRODUCCION
ASEXUAL, CONDICIONES DEL MEDIO DE CULTICO, LUZ, TEMPERATURA,
ETC, OBSERVACIONES (FECHA, CAMBIOS OBSERVADOS, PLANTAS
SOBREVIVIENTES, ETC
CONCLUSIONES:
REALIZAR UNA PUESTA EN COMUN CON LOS DIFERENTES GRUPOS
ANALIZAR.
a) En qué casos se logró la multiplicación, cuantas plantas sobrevivieron.
b) Como fue el proceso de desarrollo de la nueva planta (estructuras que se
desarrollaron)
c) Cuáles fueron las dificultades en la realización de la experiencia
d) Cuáles son las condiciones más adecuadas para el crecimiento de cada tipo
de planta (comparar entre los diferentes tipos)
e) Que características presentes la nueva planta respecto de la planta original
f) Cada grupo presentara un informe de laboratorio
PRACTICA N°2 GERMINACION DE POROTOS DE SOJA IN VITRO
Esta actividad experimental incluye varios pasos, por lo que se sugiere una lectura previa
con los alumnos de toda la experiencia, antes de ir al laboratorio para interpretar cada
etapa, familiarizarse con la metodología a emplear, conocer los objetivos de la
experiencia, y las observaciones y registros que deberán realizar. Al llegar al laboratorio,
es importante identificar los materiales, organizar la tarea y ordenar el trabajo en los
grupos de manera de hacer un trabajo seguro y controlado tomando todos los recaudos
necesarios, fundamentalmente, al trabajar con fuego. Si los grupos deben compartir
elementos de trabajo, es importante que el docente ordene los grupos para trabajar de
manera organizada, sin que se amontonen alumnos y se corran riesgos.
a. Preparación de medio de cultivo Materiales:
- 1 sobre de gelatina sin sabor, cantidad para 1 litro de gelatina.
Nota: en el práctico se lo disuelve con menos líquido para que resulte más consistente.
- 20 g de azúcar
- 750 ml. de agua caliente
- Mechero de Bunsen
- Olla a presión
- 2 botellas de litro de vidrio resistente al calor, con tapa
Procedimiento
1. Dividir el agua en dos botellas de litro de vidrio y agregar la gelatina sin sabor de forma
equitativa en los dos frascos.
2. Agregar en cada frasco 10 g de azúcar y mezclar hasta que la mezcla quede
homogénea.
3. Esterilizar en olla a presión durante 20 minutos con las tapas de los frascos flojas Nota:
si las botellas están cerradas corren riesgo de explosión. Nunca llenar las botellas por
completo con el medio de cultivo porque se derramará y además no alcanzará la
temperatura de esterilización necesaria.
4. Apagar el fuego y dejar que se iguale la presión interna de la olla con el exterior.
5. Abrir la olla y cerrar las botellas.
A. Preparación de material de vidrio para distribuir el medio de cultivo Materiales:
Frasquitos de vidrio estériles con tapa
b. Preparación de material de vidrio para distribuir el medio de cultivo Materiales:
Frasquitos de vidrio estériles con tapa
Procedimiento
1. Distribuir 50 o 100 ml de medio de cultivo, preparado y esterilizado, en los frasquitos
(según el volumen de los mismos).
2. Realizar este procedimiento por delante de un mechero prendido, abriendo los frascos
y botella cerca de la llama (no hablar ni soplar para no contaminar).
3. Distribuir e inmediatamente cerrar los frascos también cerca de la llama.
4. Dejar que la preparación se solidifique y enfríe.
c. Desinfección de granos o porotos de soja
Materiales:
- Granos de soja comercial
- Alcohol 70% (70 ml de alcohol diluido en 30 ml de agua)
- Lavandina 20% (20 ml de lavandina comercial diluida en 80 ml de agua)
- Agua estéril (esterilizar de la misma forma que el medio de cultivo)
- Pinza de metal
- Recipientes bien limpios para desinfectar las semillas Procedimiento
1. Usando una pinza estéril, pasar los granos de soja durante un minuto por una solución
de alcohol 70%.
2. Luego sumergirlos en lavandina al 20% durante 15 minutos y, por último, darles 4
lavados en agua estéril.
Nota: Tanto para la desinfección como para la siembra, la pinza se esterilizará de la

siguiente manera: mojar la pinza en alcohol puro, quemarla a rojo en el mechero,
dejar enfriar Esto se realizará al inicio de cada etapa que requiera el uso de la pinza.
Si la pinza se usa muchas veces para lo mismo, solo se mojará la pinza con alcohol
y se quemará sin llevar a rojo. No usar guantes mientras se trabaja con el mechero.
d. Siembra
1. Sembrar con pinza estéril 4 granos por frasco de modo que el hilio (punto
oscuro) quede hundido en el medio de cultivo y el resto del grano por encima del
mismo.
2. Asegurarse de que los porotos queden firmes o agarrados al medio, pero no
totalmente hundidos (por lo menos la mitad del poroto debe salir hacia la
superficie, de lo contrario no germinará).
Nota: Esta etapa se realizará cerca del mechero. Esterilizar la pinza cada vez que
tomo un nuevo grano
3. Tapar cada frasco con papel film (el de envolver alimentos) y dejar a una
temperatura entre 24 º y 26º (no debe ser menor a 20ºC), en un lugar donde reciba
luz directa durante el día.
e. Observaciones y Registro Desde el comienzo de la actividad se aconseja que
los alumnos diseñen un cuadro de 10 filas en el cual registrarán los cambios que
observen durante 10 días: - Si hay imbibición de las semillas (si absorben líquido y
se hinchan);
- Si hay emergencia de raíces
- Cuál es la longitud de la raíz y cómo va variando a lo largo de los días.
- Una vez obtenida la germinación completa, se les pedirá a los alumnos distinguir
los cotiledones (hojas de reserva) del resto de las hojas, si hay presencia de pelos
en las hojas, etc.
Preguntas para el análisis de la experiencia:
1. ¿Qué contiene un medio de cultivo?
2. ¿Por qué se esteriliza el medio de cultivo?
3. ¿Cómo se esteriliza el medio de cultivo cuando se prepara y cuando se vierte
en los frascos?
4. ¿Por qué se deben esterilizar las semillas?
5. ¿Por qué debe colocarse la semilla con el hilio hacia el medio de cultivo?
6. ¿Cuáles son las condiciones de crecimiento requeridas por estas semillas?
PRACTICA N°3
. Laboratorio. Extracción de pigmentos de plantas verdes
El objetivo de esta experiencia es extraer los pigmentos de las hojas de una planta
verde y separarlos sobre distintas superficies, papel y tiza. Para eso emplearán
una técnica que se denomina cromatografía. Los pigmentos se separan a
diferentes alturas según su afinidad al papel (o tiza) o al alcohol.
Materiales
Mortero
Embudo
Frasco
Papel de filtro
Tiza blanca
Alcohol
Hojas de espinaca ü
Gotero
Otras hojas verdes
Procedimiento:
1. Lavar las hojas de espinacas, cortarlas en pedacitos, y colocarlas en un
mortero, junto con el alcohol.
2. Triturar la mezcla hasta que el disolvente adquiera un color verde intenso.
3. Filtrar con un embudo y papel de filtro. Se puede colocar esta solución a baño
María durante unos minutos para concentrarla.
A) Separación en tiza
1. Colocar medio centímetro de altura del filtrado en una placa de Petri.
2. Sumergir dentro del extracto la base ancha de la tiza, y dejarla entre 3 y 5
minutos.
3. Pasado ese lapso, retirar la tiza, y colocarla en un vaso que contenga ½
centímetro de altura de alcohol.
Atención: es importante que la línea de extracto en la tiza no quede sumergida en
el alcohol.
4. Dejar la tiza en el alcohol y observar qué sucede.
B) Separación en papel de filtro
1. Cortar una tira de papel de filtro de unos 10 centímetros de alto.
2. Colocar con el gotero una gota del extracto, a un centímetro del borde. Dejarlo
secar. Colocar luego sobre esa gota otra, y dejarla secar. Repetir esto, colocando
entre 8 y 10 gotas de extracto.
3. Sumergir la tira de papel en un frasco con alcohol y esperar una hora. Atención:
es importante que la línea de extracto en el papel no quede sumergida en el
alcohol.
4. Observar los resultados.
Resultados y Conclusiones
a) ¿De qué color es el extracto obtenido de la planta?
b) Según la respuesta anterior, ¿qué pigmento pueden asegurar que tiene este
extracto?
c) Según los resultados, ¿podrían decir que esta planta verde tiene otros
pigmentos? Averigüen los nombres de estos pigmentos.
d) ¿Por qué no se ven normalmente estos pigmentos? ¿Qué función cumplen?
PRACTICA N°4
CULTIVO IN VITRO DE ZANAHORIA
El consumo de la raíz de zanahoria (Daucus carota, familia Opiácea) data del tiempo de los
Romanos. Documentos del período medieval muestran que las zanahorias eran blancas o
púrpuras. En el siglo XVI, una mutación dio origen a una variedad de color naranja,
seleccionada por horticultores holandeses como homenaje a la casa de Orange. Hoy en día
dicha variedad es la que se encuentra con mayor frecuencia.

En 1958, cultivando explantes de zanahoria en agua de coco, dentro de un dispositivo
rotatorio, F. C. Stewart mostró la totipotencia de las células vegetales. Ese trabajo innovador
abrió las puertas al cultivo de tejidos vegetales y la regeneración de plantas modificadas por
ingeniería genética.
Muchas de las plantas cultivadas no pueden ser propagadas directamente por multiplicación
vegetativa. Sin embargo, explantes de raíz colocados en un medio con los nutrientes
adecuados pueden dar origen a un callo, que es una masa de células no diferenciadas. En el
callo aparecen, eventualmente, embriones que pueden ser transferidos a un medio de
diferente composición, donde se desarrollarán regenerando a planta entera.

Un corte longitudinal de zanahoria (Figura 1) muestra una epidermis fina con pelos
radiculares, el córtex de tejidos fundamentales y la endodermis. El cilindro vascular está
rodeado por el periciclo, que forma las raíces laterales. Dentro se encuentran los vasos de la
xilema y del floema, el cambio que los origina y tejido parenquimatoso.
OBJETIVO

Cultivar explantes de tejidos de zanahoria, in vitro.

MATERIALES

Zanahoria, cuchillo, azulejo, frasco desinfectante con agua sanitaria 50%, 3 frascos con agua
estéril, pinzas, papel toalla, vaso de precipitados con alcohol 95 %, dos placas de Petri con
papel toalla estéril, 4 frascos con medio nutritivo estéril *, palitos estéreles, alcohol 70%,
mechero Bunsen (opcional).

* El medio nutritivo (Murashige & Skoog o Taji) es una solución de sales minerales a la cual se
le agregara sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco.

PROCEDIMIENTO

La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos. El lugar de
trabajo será desinfectado con alcohol 70%.
Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de
pasarse alcohol 70%. ¡Cuidado! El alcohol es inflamable. Esterilizar el material contaminado
antes de descartarlo.

A. Esterilización de la superficie de la zanahoria.

1. En un azulejo bien limpio, cortar con un cuchillo un pedazo de zanahoria de 3 a 6 cm,
descartando ambas extremidades de la raíz.
2. Raspar para retirar la epidermis y marcar con algún corte la extremidad inferior de la raíz.

3. Desinfectar durante 20 a 30 minutos en agua sanitaria (hipoclorito de sodio) diluida al medio
(50%) y con una gota de detergente.

4. Lavar 3 veces en agua estéril durante 1, 3 y 5 minutos, teniendo la precaución de limpiar
previamente el frasco y la tapa con alcohol.

5. Agitar suavemente durante todo el procedimiento.

B. Obtención de los explantes

1. Siempre en condiciones asépticas, transferir el trozo de zanahoria a una placa de Petri con
papel toalla estéril para eliminar las partes quemadas, con un cuchillo o bisturí estéril.

2. Transferir nuevamente el trozo de zanahoria a una segunda placa de Petri con papel de
filtro estéril y cortar una rodaja fina de 1 a 2 mm de espesor.

3. Separar el cilindro vascular y cortarlo en 4 partes, como se indica a seguir.
C. Establecimiento del cultivo

En condiciones asépticas, sembrar los cuatro explantes manteniendo la polaridad, en los
frascos con medio nutritivo.

D. Incubación

A 25 grados Celsius, en la oscuridad

E. Subcultivo o repique

Siempre en condiciones asépticas, descartar mensualmente el tejido necrosado y transferir los
explantes a medio nuevo. Después de un tiempo, transferir los explantes a un medio nutritivo
que contenga sales minerales, pero sin agua de coco, e incubar en presencia de luz.

Se trata de un experimento clásico, que da buenos resultados. La principal dificultad reside en
la obtención del explante, porque una vez que se utiliza un medio que contiene sacarosa y
agua de coco, el trabajo tendrá que ser muy riguroso para mantener las condiciones asépticas
y evitar las contaminaciones.

Por otro lado, como puede resultar difícil diferenciar el crecimiento incipiente del callo de una
contaminación bacteriana, agregamos en la Figura 2 varias imágenes de callos en diferentes
etapas de desarrollo. A menos que se observe claramente una contaminación fúngica o
bacteriana es preferible esperar un poco antes de eliminar el material.

La zanahoria no es la única raíz que puede originar callos. Los ensayos con batata (boniato)
(Ipomoea batatas) fueron positivos (Figura 3).
Figura 2. Callos de zanahoria en diferentes etapas de desarrollo
OBJETIVO

Cultivar in vitro gemas de papa brotada.

MATERIALES

Papa brotada, azulejo, cuchillo, 1 frasco con solución desinfectante de hipoclorito de sodio
(agua sanitaria comercial diluida al medio), 3 frascos con agua estéril, 6 tubos de ensayo con
medio nutritivo* con agua de coco estéril, palitos esterilizados, alcohol 70º, mechero Bunsen
(opcional).

El medio nutritivo es una solución de sales minerales a la que se adiciona sacarosa (1 a 5%),
agar (0,7%) y agua de coco

PROCEDIMIENTO

La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos.
El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70%. Los participantes se lavarán muy bien
las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasar alcohol 70%. ¡Cuidado! El
alcohol es inflamable.
Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.

1. Separación de los explantes: En un azulejo bien limpio, disecar con cuchillos los brotes de
papa, de modo de separar fragmentos de aproximadamente 1,5 cm.

2. Desinfección de los explantes: Sumergir el explante en una solución desinfectante de
hipoclorito de sodio (agua sanitaria diluida al medio) con 1 gota de detergente, durante 10
minutos, agitando suavemente.

3. Lavados en agua destilada estéril: Tres lavados de 1, 3 y 5 minutos, agitando suavemente.

4. Establecimiento del cultivo: En condiciones asépticas, en tubos de ensayo con medio
nutritivo básico MS + sacarosa (3% m/v) + agar (0,7-0,8%) + agua de coco.

5. Incubación: A 20-25 grados Celsius, en presencia de luz.

6. Seguimiento: Registrar semanalmente las observaciones.

Esta actividad debe ser prevista con bastante anticipación. Elegir en el comercio local papas
sin ninguna alteración visible, que serán lavadas cuidadosamente y colocadas en la oscuridad,
en la parte inferior de la heladera, hasta que broten.

La desinfección es crítica, pero la manipulación es relativamente simple y los resultados
pueden ser espectaculares, mostrando inclusive el crecimiento de pequeños tubérculos
(Figura 2).

Figura 2. Cultivo in vitro de brotes de papa.
CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMAS PREFLORALES DE COLIFLOR O BRÓCOLI

La coliflor (Brassica oleraceae var. botrytis, família Brassicaceae) es una variedad de col
silvestre, originada en el Mediterráneo oriental entre 1500 y 2000 años atrás. Se trata de una
planta herbácea bianual, que se reproduce por semillas.

La parte comestible (“cabeza”) es una inflorescencia inmadura redondeada que se inserta en
un tallo corto. El color es blanco, amarillo o crema, pero también se comercializan coliflores
verdes o rosas. Por ser un órgano meristemático, la cabeza desarrolla tallos con flores
amarillas o blancas cuando la planta madura. Esas inflorescencias pueden llegar a medir 100
cm.

En condiciones experimentales, los meristemas revierten hacia la fase vegetativa y se
desarrollan como brotes con hojas. Las plantas regeneradas a partir de dichos brotes se usan
para la producción de semillas.
Por ser un material barato y fácil de obtener, varios protocolos para el cultivo in vitro de coliflor
en el laboratorio de enseñanza se encuentran en Internet. Las pocas diferencias entre ellos
parecen depender de la estructura del laboratorio y de la experiencia personal.

OBJETIVO

Cultivo in vitro de coliflor a partir de meristemas preflorales.

MATERIALES

Coliflor, azulejo, cuchillo, 1 frasco con agua sanitaria diluida al medio, 3 frascos con agua
estéril, placa de Petri con papel toalla estéril, bisturí estéril, 6 tubos de ensayo o frascos
pequeños con medio nutritivo* estéril, palitos estériles, mechero Bunsen (opcional).

* El medio nutritivo (Murashige & Skoog o Taji) es una solución de sales minerales a las
cuales se adiciona sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco

PROCEDIMIENTO

las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasar alcohol 70%. Cuidado! El

A. ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO ASÉPTICO

1. Separación de los explantes: En un azulejo bien limpio, disecar con un cuchillo varias
florcitas de coliflor (tamaño 3 x 5 x 5 mm); Lavar muy bien esos explantes.

2. Desinfección de la superficie de los explantes: Pasar rápidamente el material por alcohol

70% y sumergir el explante durante 10 minutos, en una solución de agua sanitaria diluida al
medio adicionada con 1 gota de detergente; agitar suavemente durante todo el proceso de
desinfección.

3. Lavados en agua destilada estéril: Hacer tres lavados de 1, 3 y 5 minutos, con agitación
suave.

4. Establecimiento del cultivo: En condiciones asépticas, transferir los explantes a los
recipientes con medio nutritivo.

5. Incubación: A 20-28 grados Celsius, en presencia de luz.

6. Seguimiento: Registrar semanalmente las observaciones.

B. REGENERACIÓN DE LA PLANTA

Luego del crecimiento y propagación, dividir el material y transferirlo a un medio fresco, de
modo de obtener numerosos subcultivos. Una vez desarrolladas, transferir las plántulas de los
subcultivos a un medio de enraizamiento sin agua de coco, donde, además de crecer las
raíces, se fortalecerá y comenzará a fotosintetizar. Siempre en condiciones asépticas.

Antes de transferir la planta a tierra, eliminar por lavado el agar y los vestigios de azúcar.
Controlar la humedad por un tiempo y proteger las plantas de la iluminación solar directa hasta
su adaptación a las condiciones ambientales
CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES DE MAÍZ

El maíz (Zea mays) es un cereal de la familia Graminaceae originario del continente
americano y actualmente cultivado en casi todo el mundo. Como en todas las
monocotiledóneas, el cotiledón tiene como función la transferencia de los nutrientes del

endosperma a la plántula en desarrollo. En el cultivo in vitro, el medio nutritivo sustituye al
endosperma, ya que el embrión es eliminado junto con el cotiledón (Figura 1).

En biotecnología vegetal, esta forma de cultivo in vitro permite rescatar embriones híbridos,
resultantes de cruzamientos incompatibles. También se utiliza para romper la dormición de las
semillas, acortando así el ciclo de vida de algunas plantas. Se trata de un buen modelo para
los estudios fisiológicos ligados a la germinación de las semillas o al desarrollo de las
plántulas.

Así como otros órganos de las plantas, los embriones pueden ser cultivados en un medio
nutritivo con agua, sales minerales, azúcar y agar.

Figura 1. El maíz y la estructura del grano.
OBJETIVO

Cultivar embriones de maíz, in vitro.

MATERIALES

1 trozo de espiga de maíz, tubos de ensayo con medio nutritivo* estéril, 1 cuchillo o 1 bisturí,
palitos estériles, agua sanitaria diluida al medio, 3 frascos de agua destilada estéril, alcohol
96%, alcohol 70º, mechero Bunsen (opcional).

* El medio nutritivo (Murashige & Skoog, Taji o Knop) es una solución de sales minerales a la
que se adiciona sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco, como se indica en
los FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMIENTO

las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasar alcohol 70%. Cuidado! El

1. Desinfección de los explantes

- Separar con un cuchillo los granos de maíz.

- Desinfectar los granos con solución de agua sanitaria (15 minutos), agitando suavemente.

- Lavar los granos tres veces con agua destilada estéril (1, 3 y 5 minutos)

2. Extracción del embrión

Cerca del mechero Bunsen y con mucho cuidado, presionar suavemente el grano de maíz
para facilitar la salida del embrión. Sujetar el embrión con un palito estéril (Participante A)
3. Sembrado del embrión

- Abrir el tubo de ensayo con medio de cultivo estéril y flamear la boca del tubo (Participante
B).

- Dejar caer el embrión dentro del tubo (Participante A).

- Flamear nuevamente la boca del tubo y cerrarlo (Participante B).

- A continuación, verificar que el embrión quede en contacto con el medio. Si no fuera así,
agitar suavemente el tubo de modo de acomodar el embrión en el medio.

4. Incubación

En presencia de luz, a temperatura ambiente.

5. Establecimiento del cultivo a cultura

Realizar mediciones semanales de la altura del epicótilo (mm).

Figura 2: Desarrollo in vitro del embrión de maíz.
MEDIOS DE CULTIVOS
Los medios de cultivo para micropropagación vegetal incluyen agua, una fuente de carbono,
compuestos inorgánicos (sales minerales), vitaminas, hormonas y factores reguladores del
crecimiento. Generalmente, el pH del medio es mantenido entre 5,0 y 6,5.

¿CUÁL ES EL ROL DE CADA COMPONENTE?

Agua destilada: Representa el 95% del medio nutritivo.

Fuente de carbono: Generalmente se utiliza sacarosa. La fuente de carbono es necesaria
porque los explantes no son totalmente autotróficos y la fotosíntesis in vitro no aporta las
necesidades de las células.

Compuestos inorgánicos: Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn,
Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción que depende de la planta elegida.

Vitaminas: Mioinositol, vitamina B1 (tiamina), ácido nicotínico (niacina), vitamina B6
(piridoxina), pantotenato de calcio, ácido fólico, vitamina B2 (riboflavina), vitamina C (ácido
ascórbico), vitamina H (biotina), ácido para-aminobenzoico y vitamina E (tocoferol).

Hormonas y reguladores de crecimiento
- Auxinas: Estas promueven el elongación celular, la formación de callos y de raíces
adventicias; inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, a veces, la embriogénesis
en suspensiones celulares. Ejemplos: IAA (ácido indol acético), NAA (ácido naftalenoacético),
IBA (ácidoindolbutírico), 2,4 D(2,4- diclorofenoxiacético).
- Citocininas: Estas promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los
tejidos vegetales. Ejemplos: cinetina, 2iP (2- isopentiladenina), BAP (benzilaminopurina),
ceatina.

Otros compuestos: giberelinas, ácido abcísico, etileno, etc.

Mezclas de compuestos poco definidos: Ejemplos: extracto de levadura, extractos vegetales,
hidrolizados de caseína, peptona y triptona. La tendencia actual en investigación es la de
sustituirlos por medios de composición definida.

Materiales inertes: Utilizados como soporte. Ejemplos: agar, agarosa, otros polisacáridos
(Gelrite, Phytagel), lana de vidrio, papel de filtro, arena, esponjas de poliestireno.

DIFERENTES FORMULACIONES

Existen diferentes formulaciones, desde las más sofisticadas a las más simples, siendo la más
antigua la solución de Knop, que incluso hoy en día es utilizada como base para los estudios
sobre los macronutrientes necesarios para las plantas. Actualmente, se admite que la
composición de un medio debe estar ajustada a las necesidades de cada especie.

Uno de los medios más utilizados es el de Murashige & Skoog (M&S), una mezcla compleja
de sales complementada con vitaminas, a la cual se agrega sacarosa y agar. Por ser bastante
concentrado, a veces se usa en una dilución del 50%. Su preparación figura en la siguiente.

El crecimiento y la diferenciación celular son controlados in vitro mediante modificaciones de
las proporciones de hormonas y reguladores de crecimiento. De un modo general, si la
proporción entre citocininas y auxinas es mayor que 1, se desarrollan brotes, si es menor,
raíces, y si son iguales, callos.

Sin embargo, la necesidad de utilizar medios bien definidos se aplica fundamentalmente a la
investigación científica. Para el horticultor o para el docente dicha necesidad es menor, y en
muchos casos, los medios alternativos son suficientes para obtener buenos resultados.
Algunos autores (Taji, Bridgen) diseñaron medios alternativos de composición simple:
fertilizante NPK 10:10:10 y vitaminas. En el laboratorio de enseñanza, tuvimos buenos
resultados con el medio de Taji. La información sobre su preparación se encuentra en la Guía

correspondiente.

La sacarosa puede ser reemplazada por azúcar cristal, en una concentración de 2 a 3%. El
medio solidifica con agar bacteriológico en una concentración de 0,6 a 0,8%. También se
puede experimentar con otros materiales (almidón, bolitas de vidrio, compost, papel de filtro,
arena, etc.).

Con excepción de la hormona de enraizamiento que es barata y fácil de encontrar en los
viveros, el precio de la mayoría de los factores de crecimiento es muy alto para un laboratorio
de enseñanza e inclusive para algunos laboratorios comerciales. Una posibilidad es la adición
de agua de coco a los medios, porque contiene reguladores del crecimiento análogos a la
cinetina, que estimulan la división celular.

Además del agua de coco, otras sustancias de origen vegetal interesantes son la pulpa de
banana y los jugos de tomate, naranja, uva y piña. Poco empleadas en la investigación
científica, estas sustancias alternativas de composición mal definida sustituyen, en el
laboratorio de enseñanza, algunos reactivos caros o de difícil obtención.

En Brasil, el agua de coco es un producto barato y fácil de encontrar, de modo que puede ser
incluido habitualmente en el medio para estimular el crecimiento de los explantes. Para inducir
la embriogénesis o la organogénesis del explante, se reemplaza el agua de coco por un
volumen equivalente de agua destilada.
MEDIO DE MURASHIGE & SKOOG
Preparación (100ml)

1. Pesar 0,43 g de medio M&S y disolver en 90 ml de agua destilada.

2. Agregar 2,5 g de sacarosa o de azúcar cristal.

3. Agregar 0,7 g de agar bacteriológico y calentar hasta que fundir (*).

4. Llevar a un volumen de 100 ml y mezclar bien.

5. Colocar en los frascos una capa de 2 cm de profundidad.

6. Cerrar los frascos y esterilizar en la olla a presión (20 a 25 minutos contados a partir del
momento en que la válvula deja escapar vapor).

(*) El agar funde cuando la temperatura pasa de 90 grados Celsius y solidifica cuando la
temperatura baja de 50 grados Celsius.

VARIACIONES DEL MEDIO DE MURASHIGE & SKOOG

Medio de M&S con la mitad de la concentración

Por ser un medio rico en sales, el medio de M&S puede ser utilizado con la mitad de la
concentración anterior. En este caso la formulación requiere 0,27 g de medio M&S en 100 ml
de agua destilada, manteniendo las mismas cantidades de sacarosa o azúcar cristal y agar.

Medio de M&S complementado con agua de coco

Preparación del agua de coco

Extraer, mezclar y filtrar el agua de 3 cocos verdes. Después de separarla en alícuotas,
guardarlas en el congelador hasta el momento de su uso.

Preparación de medio M&S con agua de coco (100ml)

1. Pesar 0,43 g de medio M&S y disolver en 40 ml de agua destilada.

2. Agregar 2,5 g de sacarosa o de azúcar cristal.

3. Agregar 0,7 g de agar bacteriológico y calentar hasta fundir (*).

4. Llevar a un volumen de 50 ml y mezclar bien.

5. Agregar 50 ml de agua de coco y mezclar bien.

6. Colocar en los frascos una capa de 2 cm de profundidad.

7. Cerrar los frascos y esterilizar en la olla a presión (20 a 25 minutos contados a partir del
momento en que la válvula deja escapar vapor).

(*) El agar funde cuando la temperatura pasa de 90 grados Celsius y solidifica cuando la
temperatura baja de 50 grados Celsius.

Observación: Otras sustancias de origen vegetal interesantes son el agua de coco, la pulpa de
banana y los jugos de tomate, naranja, uva y ananá (piña).

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