Biotecnología aplicada a la producción de

nitrilos: uso de dioxigenasas tipo Rieske

para la deshidratación de oximas.
Sofía Gasperi - Danilo Rodríguez

Tecnólogo en Biotecnología
Referente de Institución: Ma. Agustina Vila
Docente referente: César Iglesias Diciembre, 2020 1
 INTRODUCCIÓN: BIOCATÁLISIS

Condiciones suaves de
operación
Tecnología más verde Más eficiente en la obtención de
productos enantioméricamente puros

Biocatalizadores:
células enteras o enzimas libres, a veces
mejoradas por técnicas de ADN recombinante
para el bioproceso de interés
2
 DIOXIGENASAS TIPO RIESKE (RDox)
● Oxigenasas de hierro mononuclear no-hemo
● Utilizan poder reductor del NAD(P)H para
activar oxígeno molecular
● Tres componentes:

REDUCTASA Transfiere e- de NAD(P)H a FAD

centro Rieske [2Fe2S] por el que se
FERREDOXINA transporta e- de FAD de reductasa
a centro Rieske de oxigenasa
Componentes de la Bifenilo Dioxigenasa y transporte de electrones desde
NAD(P)H hasta la dihidroxilación del naftaleno.3
centro Rieske por el que se
OXIGENASA transporta e- al átomo de hierro
mononuclear del sitio activo 3
 NITRILOS: IMPORTANCIA Y APLICACIONES
● Material de partida para síntesis de diversos productos
farmacéuticos y de química fina 1

● Según reportes del año 2010, alrededor de 30 fármacos

conteniendo nitrilos se prescribían para una gran variedad
de indicaciones médicas, y más de 20 se encontraban en 2
desarrollo

Fadrozol monoclorhidrato (1) y letrozol (2),

AMINONITRILOS para BENZONITRILOS SUSTITUIDOS inhibidores de aromatasa utilizados como
tratamientos de diabetes y para enfermedades tratamiento adyuvantes para cáncer de mama

osteoporosis dependientes de estrógenos

4
NITRILOS: LA BÚSQUEDA DE SU OBTENCIÓN POR BIOCATÁLISIS

La principal ruta química sintética para la obtención de

nitrilo utiliza cianuro, un compuesto altamente tóxico Proceso enzimático libre de
cianuro, basado en el uso de
una aldoxima deshidratasa
(Oxd) como componente
biocatalizador para dar una
gama de productos de nitrilo

Surge la necesidad de encontrar vías más verdes

5
OBTENCIÓN DE NITRILOS CON RDox
Estudios con distintos sustratos para TDO
permitió descubrir otras actividades

BIOTRANSFORMACIÓN FORMACIÓN DE OXIMA

DE GRUPO AZIDA (2) A UN (4) Y POSTERIOR
NITRILO (3) DESHIDRATACIÓN

Primer reporte de actividad

Mecanismo propuesto para la biotransformación de aldoxima-deshidratrasa para una RDox
6
bencilazida a benzonitrilo en el sitio activo de TDO.6
 OBJETIVOS

Profundizar en el estudio de la actividad

oxima-deshidratasa en RDox para la obtención de
nitrilos.

Estudiar la capacidad de distintas Estudiar la especificidad de Escalar a 100 mL

RDox de deshidratar oximas, a sustrato con los biocatalizadores mejor combinación
distinta concentración del que muestren mejores conversiones biocatalizador-sustrato
biocatalizador, con/sin O2 y definir
condiciones más favorables
7
METODOLOGÍA
● Enzimas a estudiar ● TDO
● TDOM (Q215A, F366V, T365N y I324F) E. coli JM109
● CDO
● NDO E. coli JM109 DE3

● Se realiza el crecimiento de las células en

biorreactor modo fed-batch de 5 L y se cosechan
en su punto de máxima actividad, para luego
almacenar en freezer a -20°C para utilizarlas en el
momento de los ensayos

8
 METODOLOGÍA: PRODUCCIÓN DE BIOCATALIZADORES

1 colonia aislada a tubo LB+Amp. Preinóculo

Criotubos a -70°C Estriado en placa LB-Agar con Amp.

Descartar sobrenadante y Fraccionar en falcons de Biorreactor en

conservar en freezer a -20°C 50 mL y centrifugar Cosecha a las 26 horas modo fed-batch 5L
9
METODOLOGÍA: REACCIONES A PEQUEÑA ESCALA PARA BIOTRANSFORMACIÓN DE

I) REACCIÓN EN CONDICIONES AEROBIAS

Se realizan por
5 mM
quintuplicado para
cada biocatalizador, a
OD600=30 y OD600=60
II) REACCIÓN EN CONDICIONES ANAEROBIAS

5 mM
10
METODOLOGÍA: REACCIONES A PEQUEÑA ESCALA PARA BIOTRANSFORMACIÓN DE
Resuspender células en buffer M9+glucosa y ajustar a OD600 30 o 60
AEROBIAS ANAEROBIAS

Agregar sustrato
directamente Burbujear 10’ con Ar y luego
Fraccionar 3 mL en c/vial
agregar sustrato con jeringa

Shaker (28°C, 180 rpm, 20 hs)

Contenido de c/vial se divide en

tubos eppendorf de 1,5 mL
11
METODOLOGÍA: REACCIONES A PEQUEÑA ESCALA PARA BIOTRANSFORMACIÓN DE

AEROBIAS ➔ +500µL DCM ANAEROBIAS

Centrifugar ➔ 1’ vortex
➔ Centrifugar

Separar sobrenadante y congelar

➔ Extraer fase con DCM

➔ Secar con Na2SO4

Extraer con 1 mL de Filtrar

isopropanol HPLC Filtrar

ANALIZAR POR GC
Liofilizar ANALIZAR POR HPLC 12
METODOLOGÍA: ESTUDIO DE ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO
1) Determinar, mediante las reacciones a pequeña escala, los mejores
biocatalizadores

2) Con los mejores biocatalizadores, analizar la especificidad de sustrato con

distintas oximas

13
METODOLOGÍA: ESCALADO A 100 mL
DE BIOTRANSFORMACIÓN

100 mL de suspensión de células a

OD600=60,en baño a 30°C en
plancha con agitación magnética

1. Burbujear 15’ con Ar

2. Agregar sustrato (5mM)
3. Tomar muestra cada 15’ por 3 hs
4. Finalizar a las 20 hs

14
RESULTADOS: CRECIMIENTO DE BIOCATALIZADORES

Bcat. OD600f

NDO 31

CDO 96

TDO 68

TDO 66
F366V

TDO 89
T365N

TDO 68
I324F

Seguimiento de crecimiento de biocatalizadores 15

RESULTADOS: REACCIONES A PEQUEÑA ESCALA PARA BIOTRANSFORMACIÓN DE

16
Porcentajes de conversión relativa a benzonitrilo/diol benzonitrilo obtenidos con cada biocatalizador a OD600=30 y 60
RESULTADOS: ESTUDIO DE ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO

Porcentajes de conversión relativa a benzonitrilo obtenidos con TDO F366V, NDO y CDO a OD600=60 con 2-bromobenzaldoxima y 4-bromobenzaldoxima 17
RESULTADOS: ESCALADO DE LA BIOTRANSFORMACIÓN

BIOCATALIZADOR

TDO F366V

SUSTRATO

Benzaldoxima Concentración (mM) de benzonitirlo en función del tiempo 18

 Benzonitrilo

std int
std int benzaldoxima

benzaldoxima

OH
bencilico

Tiempo 0 2 horas

std int
Benzonitrilo

benzaldoxima

OH
bencilico
19
Final
 CIS-CICLOHEXADIENODIOLES
NO pueden obtenerse por métodos clásicos

Dihidroxilación de arenos por RDox

expresadas por células de E. coli
recombinantes

20
Producción de cis-ciclohexadienodioles por Dioxigenasas tipo Rieske.1 Reacciones que pueden llevarse a cabo sobre cis-ciclohexadiendioles de origen microbiano.1
 METODOLOGÍA: PRODUCCIÓN DE DIOLES EN EL BIORREACTOR
Crecimiento de E. coli JM109
(pDTG601) que expresa TDO
Seguimiento c/30 minutos
Al llegar al estado estacionario del
cultivo, agregar 4-iodotolueno en
solución de vaselina al 10%v/v
Se finaliza el proceso cuando
la absorbancia es constante

Centrifugar y separar fase acuosa

Liofilizar y lavar el sólido

obtenido con hexano
Extraer con acetato de etilo para extraer
diol, el cual luego se evapora y finalmente
se obtiene sólido cristalino
21
 RESULTADOS: PRODUCCIÓN DEL DIOL DE 4-IODOTOLUENO

Parámetro Valor
Producción de biomasa (g/L) 1,47
Concentración de diol (producto) 6,80
(g/L)
Velocidad de formación de 3,40
producto (g diol/Lh)
Coeficiente de rendimiento de 4,63
producto
por cantidad de biomasa
producida ( g diol/g biomasa)
Velocidad específica de 2,31
Biotransformaciónde 4-iodotolueno en diol mediante TDO expresada por E.coli JM109 (pDTG601) formación de producto (g diol/g
biomasa.h)
22
CONCLUSIONES
Las dioxigenasas tipo Rieske presentan actividad oxima-deshidratasa

Generalmente, a mayor concentración de biocatalizador, mayor

conversión de oxima a nitrilo

Anaerobiosis favorece reacción

Mejor biocatalizador ● Para benzaldoxima: TDO F366V

● Para 2-bromobenzaldoxima: NDO
● Para 4-bromobenzaldoxima: NDO
23
BIBLIOGRAFÍA
1. Vila, M. A. (2019) Dioxigenasas tipo Rieske: viejos biocatalizadores, nuevas reacciones (Tesis doctoral) Facultad de Química – UdelaR, Montevideo –
Uruguay.
2. Hinzmann, A. et al. Synthetic processes towards nitriles without cyanide: A biocatalytic concept based on dehydration of aldoximes in water. Chem. Eur.
J. 10, 1002. (2020).
3. Ferraro D., Gakhar L, Ramaswamy S. Rieske business: Structure–function of Rieske non-heme oxygenases. Biochemical and Biophysical Research
Communications 338, 175-190 (2005).
4. Hudlicky, T. & Reed, J. W. Special account on the merits of biocatalysis and the impact of arene cis-dihydrodiols on enantioselective synthesis. Synlett 5,
0685–0703 (2009).
5. Hudlicky, T. Benefits of Unconventional Methods in the Total Synthesis of Natural Products. ACS Omega 3, 17326–17340 (2018).
6. Vila, M. A. et al. Production of cis-1,2-dihydrocatechols of high synthetic value by whole-cell fermentation using Escherichia coli JM109 (pDTG601): A
detailed study. J. Mol. Catal. B Enzym. 96, 14–20 (2013).
7. Vila, M. A. et al. Toluene Dioxygenase-Catalysed Oxidation of Benzyl Azide to Benzonitrile: Mechanistic Insights for an Unprecedented Enzymatic
Transformation. ChemBioChem 17, 291–295 (2016).
8. Betke, T. et al. Biocatalytic Synthesis of Nitriles through Dehydration of Aldoximes: The Substrate Scope of Aldoxime Dehydratases. ChemBioChem 19,
768–779 (2018).
9. Plass, C. et al. Approaching Bulk Chemical Nitriles from Alkenes: A Hydrogen Cyanide-Free Approach through a Combination of Hydroformylation and
Biocatalysis. ACS Catal. 9, 5198–5203 (2019).
10. Vila, M.A. et al. Site-Directed Mutagenesis Studies on the Toluene Dioxygenase
Enzymatic System: Role of Phenylalanine 366, Threonine 365 and Isoleucine 324 in the Chemo-, Regio-, and Stereoselectivity. Adv. Synth. Catal., 359,
2149-2157 (2017).
11. Fleming, F. et al. Nitrile-containing pharmaceuticals: efficacious roles of the nitrile pharmacophore. J Med Chem. 53, 7902-7917 (2010). 24