Espectrofotometría del Visible:

Demostración de las leyes fotométricas

y error relativo de la concentración
Akira Liz Llanque J., Luis F. Rosado
Facultad de ciencias farmacéuticas, bioquímicas y biotecnológicas

Ingeniería Biotecnologica

R E S U M E N:

Una vez que se ha determinado la longitud de onda adecuada para realizar las mediciones,
se procede a calibrar el método midiendo una serie de patrones del componente en estudio.
Por lo general, se prepara una solución diluida de la sustancia que se desea determinar y se
toman cuidadosamente porciones de esta solución de diferentes volúmenes. Luego, se
agrega un reactivo que forma color y se ajustan las condiciones para que se desarrolle el
color de manera óptima. A continuación, cada solución se diluye a un volumen
predeterminado en una fiola y se mide la absorbancia de cada solución en la longitud de
onda analítica o de trabajo.

Palabras clave: Longitud de onda, color y volúmenes.

A B S T R A C T:
Once the appropriate wavelength to carry out the measurements has been determined, the
method is calibrated by measuring a series of patterns of the component under study.
Usually, a dilute solution of the substance to be determined is prepared and portions of
different volumes are carefully taken from this solution. A color-forming reagent is then
added, and conditions are adjusted for optimal color development. Next, each solution is
diluted to a predetermined volume in a vial and the absorbance of each solution is measured
at the analytical or working wavelength.

Keywords: Wavelength, color, and volumes.

1. Introducción

Para realizar estas mediciones de absorbancia, se utiliza comúnmente un blanco que

debe ser idéntico a la muestra en todos los aspectos, excepto que no contiene el
componente que se desea determinar. El blanco debe contener los mismos reactivos,
aditivos, disolvente, etc., en la misma naturaleza y concentración que se utilizan en cada
muestra desconocida en la que se desarrolle color. De esta manera, las lecturas de las
muestras se corrigen automáticamente para cualquier absorción pequeña causada por
los reactivos y el disolvente.
 Finalmente, se construye una curva de calibrado utilizando los datos de absorbancia
para las diferentes concentraciones de las series de patrones.

La Ley de Lambert-Bouguer se divide en dos partes. La primera parte establece que la

relación entre la energía radiante transmitida, P, y la energía incidente, Po, es una
constante denominada transmitancia (T), que se expresa matemáticamente como T =
P/Po. La segunda parte establece que la energía radiante transmitida disminuye en
progresión geométrica cuando la longitud del camino óptico aumenta en progresión
aritmética, y se expresa como log T = ab = A = -log (P/Po) = log (Po/P).

La Ley de Beer expresa la relación entre la transmitancia y la concentración del material

absorbente, lo que significa que la transmitancia disminuye en progresión geométrica
cuando la concentración aumenta en progresión aritmética. Por lo tanto, se expresa
como -log T = ac = A = -log (P/Po) = log (1/T) = -log T.

La Ley de Combinada Lambert-Beer se obtiene al combinar la Ley de Lambert con la

Ley de Beer, y se suele llamar simplemente Ley de Beer. Esta ley establece que la
cantidad de luz o energía absorbida o transmitida por una solución es una función
exponencial de la concentración de sustancia absorbente presente y de la longitud de la
trayectoria hacia la muestra. Las relaciones obtenidas son A = abc = -log T = -log (P/Po)
= log (Po/P) = log (1/T), donde T es la transmitancia, a es la absortividad del medio, b
es el trayecto óptico, P es el poder de radiación transmitida y Po es el poder de radiación
incidente.

La forma matemática de la Ley de Combinada muestra que la absorbancia A en función

de la concentración "c" es una línea recta de pendiente "a", y la representación de log T
frente a la concentración es una línea recta de pendiente negativa. Esta ley se representa
gráficamente mediante las representaciones de la Ley de Beer.

2. Metodología
Para demostrar la Ley de Beer y obtener la curva de calibrado, se lleva a cabo un
experimento preparando una serie de soluciones patrones. Luego se mide la absorbancia
de cada solución a la longitud de onda analítica, que es la longitud de onda en la que se
espera que el analito tenga su máxima absorción o la longitud de onda de trabajo. Los
datos de absorbancia se grafican en un sistema cartesiano junto con las concentraciones
de los patrones. Si la relación entre la absorbancia y la concentración cumple con la Ley
de Beer, la gráfica resultante será una línea recta con pendiente positiva.

2.1 Materiales

● Fiolas de 100 y 250 ml.

● Buretas por 25 ml.

2. 2 Reactivos

● Solución Stock O,100N de permanganato de potasio

● Solución madre de permanganato de potasio de 100 ppm .de manganeso
● Soluciones patrones de manganeso

2.3 Mediciones

Para esto al realizar la primera solución madre (S1) se tuvo que hacer cálculos para
poder determinar la ppm del reactivo (KMnO4 al 0.1 N). Los cálculos de este
procedimiento se encontrarán en la sección de cálculos y notas. Finalmente, para
 preparar la S1 se necesitaron 22,76 mL de KMnO4 y lo restante se llenó con H2O
hasta completar los 250 mL de la fiola.
Después de haber obtenido la S1 se procedió a calcular la cantidad de mL de reactivo
para los 14 derivados de la S1. Todo este procedimiento se trabajó con fiolas de 20
mL y con reactivo de la S1 que contenía 100 ppm en una solución de 250.
Para cada uno de los derivado se obtuvo diferente volumen que era extraído de la S1,
para esto se usó lo que es la fórmula de concentración (V1*C1=V2*C2) y se obtuvo
lo siguiente:

SOLUCION Ppm Reactivo en Agua en Absorbancia

(mg/L) (mL) (mL)
1 1 0.25 99.75 0.030
2 2 0.5 99.5 0.073
3 4 1 99 0.144
4 6 1.5 98.5 0.230
5 8 2 98 0.300
6 10 2.5 97.5 0.393
7 12 3 97 0.461
8 14 3.5 96.5 0.576
9 16 4 96 0.490
10 18 4.5 95.5 0.720
11 20 5 95 0.800
12 22 5.5 94.5 0.880
13 24 6 94 0.960
14 26 6.5 93.5 1.013

Tabla N°1: Obtención de los volúmenes requeridos para la practica

3. Resultados y discusión: Curva de calibración de todos los datos: Esta primera gráfica
se halló la curva de calibración a base de concentraciones muy diluidas y concentradas,
pero se evidencia una ligera desviación al inicio de la curva de calibración.

Grafica n°1: Gráfica sobre las catorce muestras patrón

- Obtención de Dc/c: Obtención del error relativo de los 14 patrones de Mn, usando la
siguiente fórmula.
𝛥𝐶 0.434𝛥𝑇
=−
𝐶 𝑡 ∗ 𝑙𝑜𝑔𝑡
Donde:
c/c = Error relativo de la concentración
T = grado de incertidumbre 1% (0.01)
t = transmitancia

4. Anexos:

Figura 1: (Fiola madre de 250 mL) Figura 2: (Fiolas de 20 mL)

Figura 3: (14 derivados de la S1 preparados)

5. Conclusión:

- Al realizar la práctica “Espectrofotometría del visible. Demostración de las leyes

fotométricas y error relativo de la concentración podemos concluir que: con las doce
soluciones de Mn cada una a diferente concentración la transmitancia aumentará de
acuerdo con si hay mayor o menor concentración. Es decir que la transmitancia
disminuye en progresión geométrica cuando la concentración aumenta en progresión
aritmética. Además, debemos tener en cuenta que si la solución a analizar está muy
diluida afectará a la curva de calibración. Debemos realizar un análisis estadístico para
poder elaborar una curva patrón óptima y para ello debemos tomar 6 datos que no
estén tan alejados entre ellos.
 - Se puede visualizar un pequeño error en la parte experimental (punto que no está en la
recta de los demás puntos) error en tabla N°2 en el número de patrón 8 y 9, se puede
suponer que no se sacó adecuadamente los cálculos o que nuestra muestra S1 estuco
mar realizado

6. Cuestionario:

a. ¿Qué son y cuáles son las leyes fotométricas?

Son un conjunto de leyes que describen cómo la luz se comporta cuando se
propaga a través del espacio y cómo se puede medir y cuantificar su intensidad
y brillo. Estas leyes se aplican en la fotometría, que es la rama de la física que
estudia la medición de la luz visible y sus propiedades.
Las leyes fotométricas más importantes son las siguientes:
- Ley del inverso del cuadrado: Esta ley establece que la intensidad de la luz
disminuye proporcionalmente al cuadrado de la distancia desde la fuente
de luz. Es decir, si la distancia se duplica, la intensidad de la luz disminuirá
a una cuarta parte de su valor original.
- Ley de Lambert: Esta ley establece que la cantidad de luz que incide sobre
una superficie es proporcional al coseno del ángulo formado entre la
dirección de la fuente de luz y la normal a la superficie.
- Ley de Beer-Lambert: Esta ley establece que la intensidad de la luz
disminuye exponencialmente a medida que atraviesa un material
absorbente. La cantidad de luz absorbida depende de la cantidad de
material y de la longitud de onda de la luz.
- Ley de Stefan-Boltzmann: Esta ley establece que la cantidad de energía
radiada por un objeto es proporcional a la cuarta potencia de su
temperatura absoluta. Es decir, si la temperatura se duplica, la energía
radiada aumenta a dieciséis veces su valor original.
Estas leyes fotométricas son fundamentales para comprender cómo la luz se
comporta y cómo se mide su intensidad en diferentes situaciones. Son aplicables
tanto en la física como en la astronomía y se utilizan para estudiar objetos como
estrellas, galaxias, planetas y otros cuerpos celestes.
-
b. ¿Cómo se obtiene y para que se utiliza una curva de calibración o de
trabajo?

Una curva de calibración o de trabajo es una herramienta utilizada en química y

análisis cuantitativo para relacionar la señal medida de un instrumento con la
concentración de una muestra. Esta curva se construye utilizando una serie de
estándares conocidos de concentración conocida, los cuales se miden utilizando
el mismo instrumento que se utilizará para medir las muestras desconocidas.
Para construir una curva de calibración, se mide la señal (por ejemplo, la
absorbancia en espectroscopía UV-visible) de una serie de soluciones estándar
con diferentes concentraciones conocidas. La señal medida se registra en un
gráfico de señal versus concentración, donde la concentración está en el eje x y
la señal está en el eje y. Luego, se ajusta una línea o curva que mejor se ajuste a
los datos. Esta curva se utiliza para determinar la concentración de las muestras
desconocidas midiendo su señal y luego extrapolando la concentración
correspondiente utilizando la curva de calibración.
La curva de calibración es útil para la cuantificación precisa de la concentración
de una muestra desconocida. Además, la curva de calibración también se puede
utilizar para determinar la sensibilidad del instrumento y la precisión de las
mediciones. La curva de calibración también puede ayudar a detectar problemas
 de instrumentación, como una desviación en la linealidad, que pueden requerir
calibración o ajuste del instrumento.

c. ¿Cómo comprobar experimentalmente la ley Beer?

● Preparar una solución de una sustancia absorbente, como una solución de
colorante.
● Preparar una serie de diluciones de la solución absorbente, de tal manera que
la concentración de la sustancia absorbente disminuya en cada dilución.
● Colocar cada solución en una celda de cuarzo o vidrio de longitud conocida,
por ejemplo, una celda de espectrofotometría.
● Medir la absorbancia de cada solución en una longitud de onda específica
utilizando un espectrofotómetro. La longitud de onda seleccionada debe ser
la longitud de onda en la que la sustancia absorbente presenta su máxima
absorción.
● Registrar los valores de absorbancia y concentración de cada solución.
● Graficar los valores de absorbancia versus concentración en un gráfico de
calibración.
● Verificar si los valores de absorbancia se ajustan a una línea recta en el gráfico
de calibración. Si la ley de Beer-Lambert se cumple, la gráfica de la
absorbancia versus la concentración debe ser una línea recta que pase por el
origen.

d. Señalar las razones por las cuáles se dan las limitaciones de la Ley de Beer
● Solo es válida para sustancias que absorben en el rango visible y ultravioleta:
La ley de Beer solo es aplicable para sustancias que absorben en el rango
visible y ultravioleta, y no es útil para la medición de la absorción en el rango
infrarrojo.
● Depende de la longitud de trayecto óptico: La ley de Beer asume que la luz
pasa a través de la solución en un camino recto, lo que implica que el valor
de la absorción depende de la longitud del camino óptico. Si la longitud del
camino óptico varía, entonces la absorción medida también variará.
● Sensibilidad a la temperatura y la presión: La ley de Beer es sensible a las
variaciones de temperatura y presión. A medida que la temperatura aumenta,
las moléculas se mueven más rápido y la absorción puede variar. Además, a
presiones más altas, la solución puede comprimirse, lo que puede afectar la
absorción de la luz.
● Suposición de homogeneidad: La ley de Beer asume que la solución es
homogénea y que la concentración de la solución es uniforme en todo el
volumen. En soluciones no homogéneas, la ley de Beer no es aplicable.
e. ¿A que se denominan y cuáles son los errores personales?

Los errores personales son aquellos que se derivan de la falta de habilidad,

experiencia o atención por parte del experimentador o de la persona que realiza
la medición. Estos errores también pueden ocurrir debido a prejuicios
personales, expectativas o falta de precisión en la técnica. Algunos ejemplos de
errores personales son:
- Error de paralaje: Este error ocurre cuando el experimentador no lee
correctamente una escala o un instrumento de medición debido a la posición
incorrecta de la vista.
- Error de percepción: Este error se produce cuando el experimentador ve lo
que quiere ver en lugar de lo que realmente está presente en la muestra. Por
 ejemplo, si el experimentador espera que una muestra tenga una
concentración alta, puede interpretar erróneamente los datos de la medición
para que coincidan con esa expectativa.
- Error de calibración: Este error ocurre cuando los instrumentos de medición
no están correctamente calibrados o si el experimentador no utiliza los
estándares de calibración adecuados.
- Error de precisión: Este error se debe a la falta de precisión en la técnica de
medición o al uso inadecuado de los instrumentos.
- Error de lectura: Este error ocurre cuando el experimentador lee
incorrectamente los datos de la medición debido a la falta de atención o la
fatiga.
- Error de estimación: Este error ocurre cuando el experimentador no puede
medir con precisión una cantidad pequeña o una fracción de la muestra.
Es importante minimizar los errores personales para obtener mediciones precisas
y confiables. Los experimentadores pueden minimizar estos errores a través de
la práctica, la atención y el uso adecuado de los instrumentos de medición.

f. ¿Qué criterios se manejan para seleccionar las soluciones patrones para

ser utilizadas en un método espectrofotométrico?

La selección de soluciones patrones para un método espectrofotométrico es un

proceso crítico que afecta la precisión y exactitud de las mediciones. Los
siguientes criterios se utilizan comúnmente para seleccionar soluciones
patrones:
- Pureza: La solución patrón debe ser una sustancia pura y homogénea.
Cualquier impureza o contaminante en la solución puede afectar la
precisión de las mediciones.
- Estabilidad: La solución patrón debe ser estable durante el período de uso.
La degradación de la solución puede afectar la precisión de las mediciones.
- Disponibilidad: La solución patrón debe estar disponible en cantidades
adecuadas y ser asequible.
- Compatibilidad: La solución patrón debe ser compatible con el método
espectrofotométrico utilizado, es decir, no debe reaccionar con otros
reactivos o interferir en la medición.
- Rango de concentración: La solución patrón debe estar disponible en un
rango de concentración adecuado para cubrir el rango de medición
deseado. Además, el rango de concentración de la solución patrón debe
incluir la concentración de la muestra desconocida.
- Longitud de onda: La solución patrón debe absorber a la misma longitud
de onda que la muestra desconocida. La elección de la longitud de onda
depende del cromóforo presente en la muestra y de las características del
método espectrofotométrico utilizado.
- Exactitud y trazabilidad: La solución patrón debe tener un valor conocido
y trazable. La exactitud de la solución patrón se puede verificar mediante
la comparación con una solución patrón de referencia o mediante la
preparación de la solución patrón a partir de un material de referencia
certificado.
En concreto, la selección adecuada de soluciones patrones para un método
espectrofotométrico es crítica para la precisión y exactitud de las mediciones.
Los criterios de selección incluyen la pureza, estabilidad, disponibilidad,
compatibilidad, rango de concentración, longitud de onda y exactitud y
trazabilidad de la solución patrón.
g. Representar en forma gráfica el error relativo de la concentración
considerando el 0.5 % de error fotométrico si las lecturas son de 1, 5, 10,
20, 30 ,40, 50, 60, 70, 80, 90, y 95 % de transmitancia

% TRANSMITANCIA DC/C

1 0.1085

5 0.0334

10 0.0217

20 0.0155

30 0.0138

40 0.0136

50 0.0144

60 0.0163

70 0.0200

80 0.0280

90 0.0527

95 0.1025

h. Dar razones porque en espectroscopia se utilizan soluciones diluidas

● La absorción de la luz es proporcional a la concentración: La ley de Beer
establece que la absorción de la luz es proporcional a la concentración
de la solución.
● La linealidad del espectro: En soluciones diluidas, la relación entre la
absorción y la concentración es lineal.
● Evita efectos de autoabsorción: En soluciones concentradas, la
interacción entre las moléculas puede afectar la absorción de la luz y
producir efectos de autoabsorción. En soluciones diluidas, la interacción
 entre las moléculas es mínima, y por lo tanto, la absorción de la luz es
más precisa y confiable.
● ara ampliar el rango de medición: Al diluir la muestra, se puede ampliar
el rango de medición. Esto se debe a que la relación entre la absorbancia
y la concentración no es lineal y tiene un límite superior. Al diluir la
muestra, se puede ampliar el rango de medición sin alcanzar este límite
superior.
● Para facilitar la preparación de la muestra: Al diluir la muestra, se facilita
la preparación de la muestra. La dilución puede ayudar a disolver la
muestra, lo que facilita la preparación de la muestra y reduce la
posibilidad de errores durante la preparación.
i. ¿Cuándo una curva de calibración no parte del origen, señalar las razones
que determinan este tipo de curva?

Una curva de calibración no parte del origen cuando existen factores adicionales
que contribuyen a la señal medida además de la concentración de la muestra. A
continuación, se mencionan algunas de las razones por las cuales una curva de
calibración puede no partir del origen:
- Fondo de la muestra: La presencia de una señal de fondo en la muestra
puede causar que la curva de calibración no parta del origen. Este fondo
puede ser el resultado de la absorción de la luz por moléculas presentes en
la muestra, como disolventes, impurezas o contaminantes.
- Ruido de fondo: El ruido de fondo, que puede ser causado por factores como
la fuente de luz, la electrónica de detección o la fluctuación de la
temperatura, puede contribuir a una señal medida que no es cero. Este ruido
puede ser más prominente a bajas concentraciones de muestra y puede
afectar el punto de intersección de la curva de calibración con el eje y.
- Reacciones químicas: Algunos compuestos pueden sufrir reacciones
químicas con la matriz de la muestra o con otros reactivos utilizados en el
proceso de medición, lo que puede cambiar la señal medida en comparación
con la muestra sin la presencia de estos reactivos.
- Absorción cruzada: La presencia de otras sustancias en la muestra que
absorben a la misma longitud de onda que el analito de interés puede afectar
la señal medida y causar una curva de calibración no lineal.
En resumen, una curva de calibración no parte del origen cuando existen factores
adicionales que contribuyen a la señal medida, como el fondo de la muestra, el
ruido de fondo, las reacciones químicas o la absorción cruzada. Es importante
considerar estos factores al realizar una curva de calibración y ajustar
adecuadamente la ecuación de calibración para obtener resultados precisos y
exactos.

j. Señalar los rangos de transmitancias y absorbancias de los patrones y de

la muestra coloreada donde el error relativo es mínimo.

Se seleccionó los patrones del 5-10, ya que dentro de este rango es donde se
comprende un % de transmitancia entre 20 a 60%, por lo tanto sus absorbancias
van entre 0.245 a 0.669, mientras que su transmitancia oscila entre 56.89 a 21.43.
Por ende, estos patrones son aquellos en donde el porcentaje de error relativo es
mínimo y aceptable.

7. Bibliografía :
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