UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PATAGONIA SAN JUAN BOSCO

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y CS DE LA SALUD

DPTO. BIOLOGIA Y AMBIENTE
TALLER DE CULTIVO DE MICROALGAS
PROFESOR: LAURA BEATRIZ PEREZ

AISLAMIENTO DE AGAS UNICELULARES

Las técnicas y los procedimientos que se usan con mayor frecuencia para aislar y
mantener organismos del fitoplancton son varios, aunque hay que mencionar que éstos
pueden variar de acuerdo a las características de cada especie (dependiendo del tipo de
alga que se pretende aislar, de su abundancia absoluta y relativa en el ambiente en el
cual se está colectando); del tipo de muestra, de los medios e instrumentos que cada
operador tiene a su disposición y de la finalidad del aislamiento

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO

Aislamiento con micropipetas

Este sistema de aislamiento permite obtener cultivos microalgales partiendo de

una muestra con diversidad poblacional. Permite un amplio intervalo de separación
entre microalgas móviles y no móviles, ya que las primeras son aisladas con mayor
facilidad por este método. Para realizar el aislamiento se parte de una muestra que
previamente es concentrada por centrifugación y que se mantiene en cultivo durante 48
horas.
Una gota del cultivo obtenido se coloca en el extremo anterior de un
portaobjetos y se sitúa en la platina del microscopio. Justamente al lado, se establece
una superficie larga y delgada hasta el extremo del portaobjetos de medio fresco y
ésteril. Posteriormente, se establece una delgada unión entre la gota del cultivo y la
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superficie con micropipeta cerrada. Observando con el microscopio el extremo de la
superficie de medio ésteril, se puede seguir el movimiento de los flagelados hasta el
extremo posterior del portaobjetos, donde se podrán recoger fácilmente las células que
llegan con un microcapilar (Fábregas, 1982). No se obtienen cultivos axénicos.

Figura 3. Aislamiento con pipeta. Las células bajo el microscopio se transfieren a un

portaobjetos con una gota de medio estéril o en láminas excavadas. Realizadas las
transferencias, la célula se coloca en una placa multipozos o en un tubo de ensaye.

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Diluciones seriadas

El material original puede ser diluido seriadamente varias veces en medio de

cultivo estéril y se toman pequeños volúmenes de cada dilución para transferir a
recipientes de cultivo, que se incuban con la luz y la temperatura adecuada.
Generalmente se dispone de una gradilla con tubos de ensayo llenos de medio de
cultivo. En uno de ellos se pone una gota del agua donde se supone que existen los
organismos que interesa aislar, se agita y se pasa una gota de esta mezcla al segundo
tubo, y así sucesivamente. De este modo se obtienen diluciones progresivamente
superiores. Después de varios días se detecta por examen microscópico de muestras de
cada contenedor aquel con cultivos unialgales.
Es un método que aunque resulta muy sencillo y poco laborioso no permite
conocer a priori que especie se va a aislar. Presenta el inconveniente de que siempre se
aíslan las especies más abundantes, por lo que puede resultar práctico para aislar
especies dominantes en un "bloom" microalgal. Como norma general se procura aislar
de muestras recién recolectadas, o bien de muestras que se enriquecen con nutrientes o
se pasan directamente a medios de cultivo.
El éxito de los aislamientos es bajo, entre 1-20%, por lo que conviene realizar un
número elevado de ellos. Suelen obtenerse mejores resultados pasando las algas recién
aisladas a tubos de ensayo con poco volumen de medio, y esperar a que alcancen un
número elevado de individuos antes de pasarlos a los frascos o cajas estándar.

Aislamiento en placas de agar

La mayoría de las microalgas crecen bien en una placa Petri o en tubo sobre agar
al 1-2% preparado con medio de cultivo. Si el material original se siembra por estría en
la superficie del agar con un asa curva será posible después de varios días de incubación
a la luz y con la temperatura adecuada, retirar colonias aisladas que se habrán formado a
partir de una única célula microalgal. Sin embargo, puede ser necesario repetir el
proceso 2 ó 3 veces hasta conseguirlo. Estas colonias unialgales pueden ser entonces
asépticamente transferidas a medio de cultivo ésteril.
Se colocan una o dos gotas, en las cajas con medio sólido, que se esparcen con
un asa para bacteriología o con una varilla de vidrio doblada, previamente esterilizadas.
La caja se cubre con su tapa, se invierte y se coloca en un ambiente con temperatura y
luz controladas; se incuba durante 4 a 8 días y posteriormente se observa al microscopio
invertido y/o estereoscopio y con la ayuda del asa se seleccionan las colonias libres de
otros microorganismos, que se transfieren a otra caja de Petri.

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 Esta tarea se realiza las veces que sea necesario hasta asegurar el éxito del
aislamiento de un solo tipo de microalga y para lograrlo con mayor seguridad se
recomienda utilizar esta técnica en combinación con la de diluciones seriadas que se
indicó anteriormente. En ocasiones es difícil obtener cultivos monoalgales debido a la
contaminación con otras algas como cianofitas o diatomeas. El crecimiento de las
diatomeas no deseables se puede controlar agregando 1 - 10 mg/L de dióxido de
germanio (Ge2O). Las cianofitas se pueden eliminar utilizando antibióticos (ej. 25 mg/L
de estreptomicina). Es recomendable probar diferentes concentraciones y tiempos de
exposición para cada especie.

Aislamiento en tubos con agar inclinado

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MICROALGAS: APLICACIONES Y CULTIVO

Una vez aisladas, los cultivos de microalgas pueden ser tratados para dejarlos
libres de contaminación bacteriana y obtener cultivos axénicos (Wiedeman et al. , 1964;
Droop, 1967), aunque esto probablemente no es necesario cuando estas especies se van
a utilizar para el cultivo masivo ya que es poco probable que éste se mantenga en
condiciones asépticas.
Para obtener los cultivos axénicos se pueden utilizar distintos sistemas, aunque
los más utilizados son cultivos en los que se añaden antibióticos a los medios Varias
especies de microalgas se pueden aislar mediante la técnica de rayado en estrías en una
caja de Petri con agar (Fig. 5). Este método también se emplea para purificar cultivos
contaminados con otros microorganismos.
No todas las especies se pueden mantener en medio sólido, especialmente
especies flageladas y algunas diatomeas (Hoshaw y Rosowski, 1973; Andersen y
Kawachi, 2005), pero esta técnica suele dar buenos resultados con especies bentónicas,
clorofitas, cocoidales y cianofitas. Se prepara el medio de cultivo apropiado, adicionado
entre 0.8 y 2 % de agar. Se esteriliza en autoclave a 120°C y 1.1 kg/cm2 de presión
durante 15 min. Posteriormente, se deja a temperatura ambiente y antes que se
solidifique se vacía en cajas de Petri estériles. Figura 4. Aislamiento por dilución
seriada. 1:10 1:100 1:1000 .

TRABAJO EN EL LABORATORIO

Materiales
• Pipetas de 1 ml y 10 ml • Erlenmeyer de 250 ml • Espátula • Agar plate count •
Espátulas de Drigalsky • Cajas de Petri • Estufa de cultivo • Recipientes para baño
maría • Ansa de platino • Agua destilada • Muestra a analizar • Tubos de ensayo de 10 y
20 ml • • Algodón y gasa

ACTIVIDADES

Aislamiento de organismos de muestras de plancton

1. Estirar microcapilares de 5 a 10 cm. de largo a partir del extremo mas largo de

la pipeta Pasteur con ayuda de un mechero Bunsen. Verificar con lupa o M.O.
que el extremo mas fino sea hueco.
2. Sobre un portaobjeto limpio depositar una gota de la mezcla a separar. Si es
demasiado densa diluir en con una gota de medio de cultivo.
3. Sobre otro portaobjeto depositar tres gotas separadas de medio de cultivo y
numerarlas.
4. Bajo la lupa o con el M.O. enfocar la gota de la mezcla y ubicar el espécimen
deseado (previamente se ejercitara su reconocimiento por su color, su forme , su
desplazamiento).
5. Tomar un microcapilar, ubicar su extremo aguzado en el campo visual sobre la
gota del material, después dirigirla con precisión sobre el blanco elegido y
aspirar rápidamente por capilaridad.
6. Soplar suavemente el líquido retirado en la gota estéril nº 1. Verificar en el
microscopio si el espécimen deseado esta presente.

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 7. Con un microcapilar nuevo retomar la célula de la gota nº 1 y transferirla ala
gota nº 2 para un segundo lavado.
Si el espécimen parece bien aislado y sigue viable en su gota de lavado tomarlo
por última vez con un microcapilar y expulsarlo dentro de un tubo de ensayo o
placa de plástico policubetas.

Realizar distintas técnicas de aislamiento con el material de muestras de agua dulce y

algas del cepario .

https://www.youtube.com/watch?v=-ttC_QU2KLc