MARCO TEORICO:

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de

cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un
medio se denomina cultivo. Cuando ste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina
cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo
mixto.

Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio

para realizar diversos ensayos y estudios.

Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los
cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo,
agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes
especies de forma conjunta.

Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico

se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la
naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos
microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste
pueda ser axnico. El segundo paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola
clula de un microorganismo en un medio slido o lquido, esterilizado previamente. De esta manera,
aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon
est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia
es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido.
(KONEMAN, 2006)

Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe
ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden
continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos bsicos referentes a: no introducir
microorganismos indeseables (contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la muestra
(inculo) a sembrar.

Para impedir la contaminacin de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de
los microorganismos, lo que determina que el are y todas las superficies estn densamente pobladas
por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiolgica a otro
recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminacin. Estos
incluyen el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos los utensilios y medios
de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estril, la que se
obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. (HERNANDEZ, 2003)
Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama tcnica
asptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:

La contaminacin y prdida del cultivo en estudio.

La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin de

utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es particularmente importante cuando se
trabaja con cultivos de microorganismos patgenos.

Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar
muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamao de la cabeza de un alfiler
contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequesima (casi
invisible) que se adhiera al asa, ser ms que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso

microbiolgico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de
algodn), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de:
aguja, asa, esptula y/o gancho.

Los medios semislidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta
pasteur; en este ltimo caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado lquido
y a una temperatura de aproximadamente 42C se agrega el inculo, se homogeniza y se deja
solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para
favorecer la separacin de microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno.

En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aun cuando la mayora
de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o cido, por lo
que al proporcionar un pH adecuado se favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y la
obtencin del cultivo. Con este mismo propsito durante la incubacin se deben proporcionar las
condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento ptimo de los
microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora de las veces estn relacionadas con la de
su hbitat natural.

Algunos microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas ms elevadas (30
a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una
incubadora microbiolgica o un bao de agua a temperatura constante, en tanto que para lo
microorganismos que presentan su crecimiento ptimo a temperaturas entre 20 y 25C se pueden
incubar en la gaveta o cajn del laboratorio, a temperatura ambiente. (Brock, 1998)

Tcnicas de siembra:

Tcnica de siembra en medios contenidos en tubos

Se tiene siembra en medios de cultivo contenido en tubos, ya sea caldo, caldo nutritivo, agar
inclinado, otros. As se observar en las colonias su intensidad de enturbiamiento, aparicin de
pelcula o sedimento en el tubo, tambin poder determinar un crecimiento mvil o no.
En esta siembra se debe tener mayor cuidado, puesto que un contaminante del aire puede superar
en crecimiento al microorganismo de estudio, por lo tanto, se deber tomar las siguientes
precauciones:

Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los
microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la bica de este.

Los tapones se deben mantener en la mano contraria a aquella que contiene el tubo,
sostenindolos entre el dedo menique, el anular y el dedo del corazn. Nunca deben
colocarse sobre la mesa de trabajo o algn otro lugar.

Flamear la boca de tubo antes de cerrarlo despus de la siembra o inoculacin.

Esterilizar el asa adecuadamente (toda porcin que entra en contacto con el medio de
cultivo)

Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.

Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.

Despus de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo.

Al sembrar trabajar en cmara de flujo laminar o en su defecto con mechero Bunsen.

En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, as como, utilice
asas totalmente rectas.

(HERNANDEZ, 2003)
Siembra en tubos por estras simples

Se realiza en un tubo con medio solido inclinado (en bisel o pico

de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie expuesta del
agar de manera que se marque con movimiento en zigzag o
surcos en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va
avanzando hacia arriba por el rea inclinada. Luego incubar en
estufa durante 28-48 horas a temperatura ms adecuada a
37C. (SWANSON M. J. Katherine, 2001)

Siembra en tubos por picadura

Se realiza con asa recta en punta en tubos de medios slidos y

semislidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo
el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el
centro de superficie, llegando con el extremo del asa al fondo del
tubo y retirndolo posteriormente por la misma trayectoria
utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa (de argolla)
o con cierto movimiento de vaivn podra originar un patrn de
crecimiento que se interpretara errneamente como movilidad
bacteriana. Por ltimo, incubar durante 24-48 horas a
temperatura optima de crecimiento. (ROJAS, 2011)
Siembra en tubo en medio lquido (caldo lquido)

Transferir aspticamente con el asa bacteriolgica (de

argolla), o en algunos casos, pipetas estriles o
hisopos. Si se usa asas bacteriolgicas, de una
pequea muestra de microorganismos, se transfiere
desde el tubo que contiene el material problema al tubo
con medio de cultivo estril, se inocula el
microorganismo en el medio lquido, sumergiendo el
asa en el lquido y rotar el mango para desprender la
muestra. (MADIGAN, 2009)

Tcnicas de aislamiento

Un modo de estudiar un ecosistema microbiano consiste en aislar de l los microorganismos y

estudiar sus propiedades en cultivos de laboratorio. El aislamiento es importante porque se obtienen
cultivos para estudios experimentales en el laboratorio y para las aplicaciones en los campos de la
biotecnologa y la microbiologa industrial y ambiental
A continuacin, se mencionan tres de ellas:

Siembra en placas de Petri por rayado

Siembra en placa vertida

Diluciones en serie

La siembra en placas de Petri por rayado

Esta tcnica se basa en la separacin de los microorganismos al dispersar-por rayado sobre agar-
una muestra que los contiene. Para llevar a cabo la disgregacin, se recoge una porcin de la
muestra con un asa bacteriolgica y se raya sobre una seccin de una placa Petri; luego, se repite
el rayado en tres secciones ms de la placa. En cada rayado, se toma la muestra de la seccin
anterior por lo que se logra una disminucin gradual en la cantidad de microorganismos.
Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y el tiempo recomendados;
al crecer, formarn colonias separadas unas de otras en alguna de las secciones del rayado.

Posteriormente, se toma una muestra de una de las colonias separadas y se repite el procedimiento,
con la finalidad de confirmar la presencia de un solo tipo de microorganismos. (HERNANDEZ, 2003)
 Tcnicas de estriado:

a) estriado simple: estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y

toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado.
Cercas del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa.
Regresa la caja a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estril (donde se
vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un
extremo de la placa y con el asa en posicin ligeramente horizontal realiza las
estras (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una
porcin pequea del agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca.
b) estriado en cuadrantes: la mayor parte del inculo e descarga en los cuadrantes
1y 2, lo que permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra,
previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y
se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con medio, en
forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el medio. Se
flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se
extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso
se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las
sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura
adecuada, siempre en posicin invertida. Mediante esta tcnica se obtienen
colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de
bacterias. (Brock, 1998)

La siembra en placa vertida

En esta tcnica se hacen crecer los microorganismos en tubos, cada uno con una concentracin
diferente, y se evala el tubo en el que las colonias crecieron en forma separada.

Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas diluciones y se coloca

cada una en un tubo con agar fundido, como se muestra en la figura 6, a. Luego, se mezcla
homogneamente el contenido (el agar y el inculo) de cada tubo y se vierte (no se siembra por
rayado) en una placa de Petri, segn se muestra en la figura 6, b.

Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se selecciona la dilucin en la

que se haya obtenido mayor separacin de las colonias.
Por ltimo, de esta dilucin, se toma una muestra de las colonias y se siembra en una placa de
Petri, por rayado, para confirmar si el cultivo est puro. La conformacin de pureza se puede realizar
por observacin a simple vista (colonias de igual morfologa), por observacin microscpica o
mediante pruebas bioqumicas.

Diluciones en serie
Esta tcnica se aplica cuando se conoce de antemano que el microorganismo de inters se
encuentra en mayor cantidad que los dems. Para llevarla a cabo, se preparan varias diluciones de
la muestra y se incuban en el medio de cultivo adecuado para que crezca este microorganismo; as,
se logra que en alguna de las diluciones solo l aparezca. Es necesario reconfirmar su presencia,
utilizando el mtodo de siembra en placa de Petri por rayado. (Brock, 1998)

Morfologa de la colonia de bacterias

Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivos exhiben diferentes tipos, formas
macroscpicas en su crecimiento, estas diferencias llamadas caractersticas culturales, son la
base para la separacin de ellas en grupos taxonmicos. Estas son determinadas por el cultivo de
microorganismos en agar Nutritivo inclinado, en placas de Petri, en caldo nutritivo y otros.

La morfologa colonial, es una caracterstica indispensable a tener en cuenta en el aislamiento

primario de una bacteria y, en la cual se debe considerar el borde y la elevacin de la misma.
Adicionalmente, es importante apreciar la consistencia y textura de la masa celular, pues tambin
son caractersticas distintivas. La consistencia va desde viscosas que se pegan en el asa y se
separan de la colonia formando un hilo. As como tambin la pigmentacin de la colonia, las
pelculas continas de crecimiento (bacterias mviles), colonias lisas (generalmente virulentas) o
colonias rugosas (generalmente avirulentas). (KONEMAN, 2006)
Condiciones ambientales idneas para el cultivo en el laboratorio

Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo

necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, tambin es preciso
aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben
estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxgeno, segn el caso, ser
aportado o eliminado.

Temperatura
Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual
presenta su crecimiento ptimo. Pero, en general, los microorganismos crecen ms
rpidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se
daan las protenas. As pues, para favorecer un crecimiento rpido, las bacterias se
suelen cultivar a la temperatura ms alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su
medio natural. Escherichia coli sp la bacteria que ms frecuentemente se utiliza en
investigacin, se encuentra en el intestino humano y de otros mamferos. Este
microorganismo crece ptimamente a 37C, la temperatura del cuerpo humano.

Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadores o en baos de agua,

ambos controlados termostticamente. Los incubadores, o estufas, son cmaras con
aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos slidos como lquidos, preparados
en cualquier recipiente, incluyendo placas Petri, tubos de ensayo, o matraces.

pH

El pH ptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un

intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores
de pH prximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a 7,5. Sin embargo, los hongos
crecen mejor entre 4,5 y 6,0.

Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el

crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan
selectivamente algn componente cido o bsico del medio; o bien, porque algn
producto de su metabolismo es un cido o una base. Para disminuir los cambios de pH
en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En los medios complejos no suele
ser esencial, porque sus materiales naturales actan como tampones dbiles. Los
tampones ms eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato
clcico. Ambos se aaden normalmente como nutrientes (fuente de fsforo y calcio);
pero si se desea que acten como tampones se precisarn cantidades mayores.

Oxgeno

La concentracin de oxgeno del medio es un determinante crtico para el crecimiento

bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no
pueden vivir sin oxgeno porque lo necesitan para obtener energa. Otros
microorganismos, llamados anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de
oxgeno, para ellos es un agente txico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios
facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de
oxgeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxgeno si disponen
de l, pero tambin pueden crecer sin l. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el
oxgeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerfilos
requieren ambientes con bajas tensiones de oxgeno; las altas tensiones, como las que
existen en el are son txicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que
se vaya a cultivar, se tendr que suministrar, restringir o eliminar el oxgeno. (Prescott,
1999)

Conservacin de los cultivos axnicos

Una vez que se obtiene un cultivo axnico, hay que mantenerlo en el laboratorio para
poder trabajar con l o intercambiarlo con otros cientficos. Esto se puede llevar a cabo
haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero
un cultivo puro tambin puede mantenerse viable durante aos sin hacerlo crecer
peridicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y
como referencia se les denomina cultivos de coleccin. Muchos laboratorios poseen una
coleccin de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las
denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un
nmero enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbilogos. Existen
muchas tcnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en
una desecacin (eliminacin del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura.

Los cultivos generalmente se desecan por liofilizacin (congelacin y desecacin). El

mtodo consiste en lo siguiente: el cultivo lquido se vierte en un pequeo vial o ampolla
de vidrio y se aade leche descremada para proteger las clulas durante el proceso. La
mezcla se congela en hielo seco y se expone al vaci para su sublimacin (eliminacin
del agua congelada). Durante el proceso de sublimacin las clulas permanecen
congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras an se
mantiene el vaco. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente.

Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias

protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfxido (DMSO). Los
tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrgeno lquido
o en un ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas. (Ingraham, 1998)
CUESTIONARIO

4. En qu consiste la tcnica del nmero ms probable y qu usos tiene?

La estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP) es muy adecuado para
determinar bacterias anaerobias, porque permite mantener un ambiente anaerobio
dentro de los tubos, sin necesitar de sistemas anaerobios ms complejos como cmaras
o jarras anaerobias.

En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos

en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede
ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos,
sedimentos marinos y suelos contaminados.

El mtodo consiste en la estimacin del nmero de microorganismos viables a partir de

diluciones sucesivas (1/10) partiendo de 1 g de suelo o sedimento en base hmeda o 1
ml de agua; posteriormente, de tres o ms de las diluciones se inoculan tubos con medio
de cultivo con sustratos y aceptores de electrones especficos. En este mtodo se asume
que en las series de diluciones los microorganismos se encuentran distribuidos al azar y
que al menos un microorganismo generar crecimiento, produciendo una respuesta
positiva (turbidez, cambio de color, produccin de algn metabolito especfico). Esta
tcnica se basa en la estimacin de la densidad bacteriana por el mtodo estadstico de
mxima probabilidad, utilizando la teora de diluciones.

Para realizar la estimacin microbiana se utiliza un mnimo de tres diluciones y un

intervalo de 3 a 10 rplicas (n tubos de medio para crecimiento) por dilucin; el
nmero de diluciones y rplicas utilizadas estar en funcin de la precisin requerida.

5. De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos perodos?

Existen varios mtodos para la conservacin de los microorganismos-, todos buscan que
las clulas sufran el dao mnimo y se preserven por el mximo periodo posible. Los
cuatro procedimientos generales son:

La siembra o el subcultivo: Este mtodo consiste en sembrar el microorganismo en

determinado medio de cultivo y, luego, conservarlo en refrigeracin. El procedimiento
se debe repetir cada cierto tiempo. Se lleva a cabo en tubos de ensayo con agar
inclinado, o en botellas especiales que contienen un medio de cultivo slido y estril.
Una de las desventajas del mtodo es que los tubos guardados en refrigeracin se
deshidratan y, entonces el microorganismo muere, por esta razn, es necesario repetir
el procedimiento peridicamente.
La desecacin: El mtodo consiste en remover el agua celular e impedir la rehidratacin
de las clulas de los microorganismos. Para llevarlo a cabo se inocula una muestra de
cultivo en tierra hmeda estril (material de soporte), se separa hasta que haya
crecimiento (vatios das) y, luego se seca con aire a vaco. Despus, el cultivo se guarda
en una atmsfera seca o en refrigeracin. Otros materiales de soporte pueden ser slica
gel, discos de gelatina y tiras de papel.
La congelacin: La congelacin es, al igual que la liofilizacin, uno de los mtodos de
mantenimiento ms utilizados, porque se logran los periodos de conservacin ms
largos (superiores a veinte aos, cuando se utiliza nitrgeno lquido).
En el proceso de congelacin lo ms importante es controlar la velocidad de disminucin
de la temperatura, porque, si es muy lenta, los cristales que se forman a partir del lquido
contenido en las clulas sern muy grandes y pueden romper la membrana celular.
El proceso de congelacin se puede clasificar, con base en la temperatura en la que se
lleva a cabo, en:
Congelacin ordinaria: Se mantienen temperaturas de -5 a -20C.

Congelacin ultra fra: Se efecta en congeladores mecnicos entre -50 y -80C.

Congelacin con nitrgeno lquido: Se logran temperaturas de -150 a -196C.

La liofilizacin: Es la remocin de agua de las clulas congeladas (slidas) a presin

reducida (sublimacin). Para llevar a cabo este procedimiento, se toma una muestra de
cultivo por conservar y se suspende en algn medio con crioprotectores, como leche,
suero o glutamato de sodio. Se transfieren unas gotas de la muestra a una ampolla, se
congela y se somete a alto vaco hasta que el agua celular se sublima (pasa de estado
slido al gaseoso). Una vez liofilizada la cepa, la ampolla que la contiene se sella para
impedir que el microorganismo se altere por el contacto con el medio ambiente.
Bibliografa
Brock, T. D. (1998). Biologa de los microorganismos, 8va Edicin. Barcelona: Omega.
HERNANDEZ, A. (2003). Microbiologa industrial. Primera edicin. San Jos, Costa Rica: EUNED.
Ingraham. (1998). Introduccin a la microbiologa. Barcelona: Revert.
KONEMAN, E. A. (2006). Diagnostico Microbiolgico. Sexta edicin. Argentina: Mdica Panamericana.
MADIGAN. (2009). Biologa de los microorganismos. Madrid: Pearson-Prentice Hall.
Prescott, H. K. (1999). Microbiologa. Madrid: Mc Graw Hill Interamericana.
ROJAS, A. (2011). En Conceptos y prctica de microbiologa general. Palmira: Universidad Nacional de
Colombia.
SWANSON M. J. Katherine, R. L. (2001). Microbiologia general. American Public Health Association.