Tema

22.- Fermentaciones industriales: Medios de cultivo (fuentes de C y N). El agua y los

minerales, vitaminas, factores de crecimiento, oxígeno y antiespumantes. Bioreactores: Diseño y
construcción. Control de adición reactivos, y condiciones físicas (agitación, calefactores y
refrigeradores, transferencia de masa, aireación). Seguimiento del sistema (electrodos, sondas,
traductores, espectros de masas y espectrofotómetros). Modos de operación. Esterilización.
Reactores de substrato sólido. (2h)
Objetivos:
o Comprender el valor de costes de los medios para la búsqueda de rendimiento económico.
o Valorizar residuos como fuente de nutrientes para generar productos biotecnológicos.
o Identificar los factores críticos durante el proceso de producción de moléculas de interés.
o Reconocer el papel de la puesta a punto de los procesos de producción.


INTRODUCCIÓN
En el bloque temático anterior hemos estudiado la generación de productos de interés
biotecnológico por parte de microorganismos que incluyen polímeros (principalmente
polisacáridos y poliésteres), metabolitos primarios (centrándonos en la producción de alcoholes,
ácidos orgánicos y aminoácidos), metabolitos secundarios (que hemos dividido en antibióticos y no
antibióticos). En todos estos procesos hemos ido recalcando la importancia de ciertos elementos en
el proceso de producción industrial de los mismos que incluían desde la temperatura, el medio de
cultivo, la oxigenación hasta detalles más particulares como podían ser la ausencia de ciertos iones
(por ejemplo en ión Mn+2 durante el proceso de producción de ácido cítrico) o la presencia de
ciertos compuestos (por ejemplo la biotina, el detergente tween80 o concentraciones subletales de
antibióticos β-lactámicos durante la producción del L-glutamato). A lo largo de este tema 22
estudiaremos los principios generales de los procesos de fermentaciones industriales que afectan
de manera global a todos los procesos de generación de productos biotecnológicos a partir de
microorganismos.

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1.- Objetivos en producción por biorreactores:
El término “Fermentación” ha evolucionado a lo largo del desarrollo de la biotecnología moderna.
Originalmente proviene del latín fervere, que significa hervir, proceso al que se asemejaba la
producción de burbujas de dióxido de carbono generado por Saccharomyces cerevisae durante el
catabolismo anaerobio de los azúcares presentes en frutas y cereales en la producción de bebidas
alcohólicas y que comparte raíz con el término efervescencia. Hoy en día se sigue utilizando para la
descripción de procesos anaerobios similares a los descritos en el campo de la bioquímica
microbiana, pero tiene un significado más amplio en el área de la microbiología industrial en el que
se incluye la generación de productos biotecnológicos también a través de procesos aerobios en los
que se utilizan fermentadores, también conocidos como biorreactores.
Los procesos fermentativos más comunes a día de hoy incluyen cinco grandes grupos:
1.- Producción de células microbianas, también conocida por el término biomasa
como producto.
2.- Procesos en los que se generan enzimas.
3.- Procesos en los que el objeto a producir son metabolitos (primarios,
secundarios o poliméricos).
4.- Los encaminados a la generación de productos recombinantes (como por
ejemplo proteínas).
5.- Los procesos en los que se modifica un compuesto que se añade al biorreactor o
fermentador también conocidos como procesos de transformación.

En cuanto al primer grupo hemos de indicar que existe un interés comercial en la producción de
biomasa de dos grandes grupos de microorganismos. Por una parte está la producción de levaduras
para su uso en la industria panadera y de producción alcohólica y por otra parte está el interés de la
producción de biomasa destinada a su uso como alimentos para consumo humano o animal. Así, las
levaduras de panadero se producen a gran escala desde principios del siglo XX, mientras que la
producción de levaduras para el consumo humano tienen lugar en Alemania desde la primera
Guerra Mundial, aunque no fue hasta los años 60 del siglo pasado cuando un gran número de
empresas comienzan a mostrar interés por la producción de proteína y carbohidratos como fuente
de alimentos a través de la producción de biomasa en lo que se conoce como Proteína derivada de
formas UniCelulares ó SCP (del inglés Single Cell Protein). En este sentido ya hemos comentado en
el tema 17 la producción de micoproteína por parte una cepa del hongo Fusarium venenatum
dentro de la división Ascomycota, en un proyecto llevado a cabo por parte de la empresa Rank
Hovis McDougall, especializada en producción de levaduras, en colaboración con Imperial Chemical
Industries (ICI plc). Además destacamos la producción de microorganismos para la producción de
vacunas derivadas de organismos completos o para sus usos en los campos de la biorremediación o
de la agricultura como bioestimulantes de plantas.
En cuanto a la producción de enzimas, hemos de indicar que si las enzimas a nivel comercial se han
producido a partir tanto de plantas, animales como de microorganismos, en el caso de estos últimos,
se tiene la gran ventaja de poder producirlas en grandes cantidades mediante técnicas de

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fermentación industrial. Estos procesos de producción además son fácilmente mejorables al
contrario de lo que ocurre con los procesos de producción basados en animales o plantas. Además
gracias a la tecnología del ADN recombinante, se pueden producir las enzimas de origen animal o
vegetal en fondos bacterianos, que además son susceptibles de optimización.
La producción de metabolitos se divide en la dedicada a producción de metabolitos primarios y a la
de metabolitos secundarios. En cuanto a los primarios, como ya hemos indicado existe un gran
interés industrial en la producción de ciertos de estos metabolitos cuya producción viene definida
por el aislamiento de microorganismos con capacidad para producir estos metabolitos. Además
también es función del microbiólogo industrial el buscar las condiciones adecuadas para la
optimización de la producción de estos compuestos, los cuales se suelen generar principalmente en
las primeras fases del crecimiento del cultivo (trofofase constituidas por las fases lag y exponencial).
En cuanto a los metabolitos secundarios, es importante resaltar que estos se producen por una
serie limitada de microorganismos, los cuales se suelen producir en las fases más tardías del
crecimiento (idiofase constituida principalmente por la fase estacionaria), por lo que los procesos
de fermentación industrial habrán de tener lugar en cultivos continuos donde los microorganismos
se encuentran en un estado de crecimiento lento o ausencia de crecimiento.
También hemos repasado la generación de productos recombinantes, centrándonos en la
producción de proteínas, de las cuales destacamos que durante el diseño del proceso de producción
se han de incluir pasos para la secreción del producto, para reducir la degradación de la proteína,
para maximizar la producción y para controlar que la producción ocurra en un determinado
momento.
En cuanto a los procesos de transformación, hemos de considerar que las células microbianas se
pueden utilizar para la conversión de un compuesto en otro de estructura química parecida pero
con un mayor valor. Esto se debe a que los microorganismos son capaces de catalizar reacciones
quirales con una especificidad y estereoespecificidad superior a las reacciones químicas, además de
permitir la adición, eliminación y modificación de grupos funcionales en sitios específicos en
moléculas complejas sin necesidad de protecciones químicas. Las reacciones que pueden catalizar
incluyen deshidrogenaciones, oxidaciones, hidroxilaciones, deshidrataciones y condensaciones,
descarboxilaciones, aminaciones, deaminaciones e isomerizaciones. Además las ventajas de las
reacciones catalizadas por microorganismos incluyen el hecho de que funcionan a temperaturas y
presiones relativamente bajas además de evitar el uso de catalizadores contaminantes como
pueden ser los metales pesados. Aunque hoy se considera un proceso bien establecido, durante la
transformación del alcohol en vinagre (etanol en ácido acético) la mayor parte de este proceso
incluye la producción de compuestos de alto valor como son esteroides, antibióticos y
prostaglandinas. Estos procesos requieren de gran cantidad de biomasa dado que se suelen
catalizar en una reacción única, por lo que muchas de estas reacciones se llevan a cabo mediante
inmovilización de la célula o de las enzimas que catalizan dichas reacciones en soportes inertes.

DESTACAMOS:

Procesos más comunes en Biorreactores

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2.- Contexto histórico de las biorreacciones y los biorreactores:
En el campo de la fermentación se han desarrollado distintos métodos de cultivo celular en
respuesta a las demandas de producción de los distintos productos biotecnológicos. De esta forma,
la aparición de los primeros procesos fermentativos estaban asociados a la producción de alcohol.
Como hemos indicado en temas anteriores, la fermentación de frutas y cereales se asume que está
asociada a la aparición de las sociedades agrícolas, aunque todas estas fermentaciones se
realizaban de manera artesanal y a pequeña escala. Sin embargo, la producción industrial de
alcohol a gran escala aparece a principios del siglo XVIII, cuando se introducen las cubas con
capacidad superior a los 150.000 litros. Este proceso se conoce como de Lote o Batch. A mediados
del mismo siglo comienzan a introducirse sistemas de control del proceso de producción como es el
registro de temperatura e incluso en 1801 se intenta introducir un sistema básico de refrigeración.
A mediados del siglo XIX, queda demostrado por Louis Pasteur el papel de las levaduras en el
proceso de fermentación. Pero es a finales de ese siglo cuando se inician los procesos de
aislamiento de levaduras para generar cultivos puros para utilizarlos como preinóculos por Emil
Christian Hansen en los laboratorios de la cervecera Carlsberg, entre los que aisló la cepa
Saccharomyces carlsbergensis que a día de hoy se considera como una de las dos únicas levaduras
utilizadas en la producción de cerveza lager. De esta forma apareció el concepto de cultivo puro
como preinóculo o cultivo iniciador.
El siguiente tipo de producto de interés fue el del vinagre, que para su producción artesanal se
realizaba dejando el vino en contenedores poco profundos o en barricas a medio llenar, dado que el
proceso requería de condiciones aerobias. Para ello se solía utilizar coque, carbón o raspaduras de
madera sobre las que se dejaba caer la cerveza o vino mediante goteo que facilitara este proceso de
oxigenación. A finales del siglo XIX y principios del XX se comenzó a pasteurizar el medio de partida
(vino, cerveza o el producto alcohólico de origen) para controlar las contaminaciones. A partir de
este medio se adicionaba un 10% de vinagre de buena calidad, de forma que se iniciaba el control
del proceso tanto en la industria cervecera como en la del vinagre. De esta manera aparece el
concepto de proceso aerobio, aunque dada la tradición del proceso anaerobio, continúa la
denominación de fermentación.
Entre 1900 y 1940 aparecieron nuevos productos biotecnológicos como fueron el glicerol, el ácido
cítrico, el ácido láctico, la acetona y el butanol, así como la producción de biomasa de levadura para
su uso como preinóculo, de gran importancia para el inicio de estos procesos industriales. En esta
época se observó, que para lograr una gran cantidad de biomasa se requería de la incubación de la
levadura en condiciones aerobias, y que estas condiciones quedaban frecuentemente limitadas por
la presencia de oxígeno en el medio. En caso de faltar oxígeno, la levadura pasaba a modo
fermentativo produciendo alcohol a costa de una reducción en la producción de biomasa. De esta
forma, inicialmente se limitaba la adición de mosto como material de partida, para reducir la
cantidad de carbono disponible de forma que fuese el carbono el factor limitante en lugar del
oxígeno, cuando este comenzaba ser limitante, se añadía algo más de fuente de carbono, en lo que
hoy se conoce como técnica de cultivo en Lote Alimentado o Fed-Batch que hoy en día se utiliza

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ampliamente en la industria. Igualmente se mejoró la aireación de estas levaduras utilizadas en la
fase temprana, mediante el uso de tubos de burbujeo que se podían limpiar con vapor.
Aunque el resto de procesos se podían realizar en ambientes no asépticos utilizando un inóculo de
buena calidad, la producción anaerobia de butanol (como elemento básico en la producción de
polímeros de butadieno como alternativa al caucho) y de acetona (para la producción de explosivos
como la cordita) implicaba mayores complicaciones de contaminaciones en fases tempranas, lo que
dio lugar al uso del primer biorreactor aséptico durante la Primera Guerra Mundial. Para ello se
diseñaron fermentadores cilíndricos de acero que podían someterse a presión para su
esterilización. Esto supuso el primer paso hacia el desarrollo de biorreactores asépticos para
procesos anaerobios.
Más tarde, durante la Segunda Guerra Mundial, surge una gran demanda de penicilina, para lo que
se ha de optimizar el proceso de producción en condiciones de esterilidad dada la facilidad de
contaminación en este proceso. Para esta optimización se contaba con la experiencia de los
sistemas estériles anaerobios, pero dadas las demandas de oxígeno del hongo productor de la
penicilina, se hubieron de desarrollar los primeros biorreactores con sistema de aireación estéril.
Gracias a estos desarrollos se ponen a punto sistemas para la producción de otros antibióticos, de
vitaminas, giberelinas, aminoácidos, enzimas y esteroides.
A partir de los años 60 del siglo pasado se buscan productos microbianos con otras actividades
distintas a los antimicrobianos. Estas búsquedas fuerzan la miniaturización del sistema de
producción, la automatización robótica y el diseño de ensayos adecuados para la búsqueda de estos
otros metabolitos. También a principios de los años 1960s se ponen en marcha proyectos para la
búsqueda de sistemas de producción de proteínas para su uso en alimentación por parte de
distintas multinacionales. Estos sistemas fuerzan la aparición de biorreactores de gran tamaño
llegando a volúmenes de 80.000 a 150.000 Litros. El bajo precio del producto final requería la
puesta a punto de biorreactores de grandes volúmenes para hacer rentable el proceso. También se
consideró el uso de hidrocarburos como fuente de carbono, lo que se traducía en un aumento de la
demanda de oxígeno, y una generación de calor adicional. Estos requisitos llevaron al desarrollo de
los inyectores a presión y a los biorreactores o Fermentadores de Ciclo de Presión, que evitan el
requerimiento de agitadores. Además se requería una reducción en los costes de producción para lo
cual se debería evitar al máximo los procesos de limpieza del biorreactor, de inicio del cultivo y de
esterilización del sistema. Por estas razones se observó que el sistema de Lote o Batch y el sistema
de Lote Alimentado o Fed-Batch, eran insuficientes para cubrir estas demandas por lo que se
requería de un sistema en el que se pudiese añadir medio de cultivo fresco, a la vez que se pudiese
retirar cultivo líquido del biorreactor dieron lugar a la aparición del tercer tipo de cultivo: el
llamado Cultivo Continuo. Este sistema permitió escalar el biorreactor hasta 3.000.000 de litros
gracias al uso de Fermentadores de Ciclo de Presión, para el cultivo de Methylophilus methylophilus
con metanol como fuente de carbono para la producción de biomasa destinada a piensos para
animales. El control de la asepsia del sistema se logró gracias a la gran calidad del sistema de
construcción de los biorreactores, a la esterilización continua de los sistemas de alimentación, a la
introducción de sistemas de control por ordenador para controlar la esterilidad y los ciclos de

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operación de forma que se minimizara el posible error humano. Sin embargo los más de 100
millones de libras invertidas en este proyecto no sirvieron para competir con la producción de
proteínas derivada de soja o de pescado, lo que llevó a la demolición de la planta en 1989.
En cambio, la aparición de productos de alto interés comercial, derivados de la tecnología del ADN
recombinante, permitió el desarrollo de sistemas de producción en bajo volumen. Estos sistemas
permiten la aparición de múltiples empresas pequeñas que se lanzan a la producción de proteínas
recombinantes con interés terapéutico. Gracias también a esta tecnología se expresan receptores
proteicos de mamíferos a partir de los cuales se dio lugar al descubrimiento de nuevos productos
naturales que interaccionaban con ellos y a la modificación de los mismos mediante diseño
inteligente (rational design) para la búsqueda de nuevos fármacos, destacando la producción de
insulina, hormona del crecimiento, eritropoyetina, y otros fármacos de origen proteico. Para el
desarrollo de sistemas de producción de proteínas recombinantes se recurrió a los ya desarrollados
para la producción de vacunas en los que se cultivaban organismos patógenos. Esto ha dado lugar a
que la producción de proteínas recombinantes se consideren al mismo nivel que la producción de
agentes biológicos en lugar de como fármacos. Esta clasificación como agente biológico lleva
asociada una serie de requisitos legales de producción en sistemas específicos y precisos y que se
lleven a cabo en unas instalaciones que ha de estar aprobada, inspeccionada y licenciada por una
autoridad reguladora, lo que no ocurre con la producción de fármacos. Incluso, cualquier
modificación que se quiera incorporar por parte del fabricante, ha de contar previamente con la
aprobación del mismo organismo regulador. Esto hace que la producción de proteínas
recombinantes, y cualquier modificación que se haga en el protocolo ya aprobado sea un proceso
extremadamente costoso.
DESTACAMOS:
Hitos históricos y evolución de los bioprocesos asociados a los mismos
Aparición de los cultivos en lote, lote-alimentado y continuo.

3.- Componentes y diseño del proceso fermentativo

3.a.- Componentes básicos en los procesos de bioproducción.
Independientemente del tipo de fermentación, cualquier tipo de proceso de bioproducción se
puede dividir en seis componentes básicos:
i.- Diseño del medio de cultivo apropiado al microorganismo a cultivar, tanto para el
preinóculo, como para el proceso de producción.
ii.- Esterilización del medio, del biorreactor y de los equipos auxiliares.
iii.- Producción de un cultivo activo y puro en concentración y cantidad suficiente para
inocular la vasija de producción (Preinóculo).
iv.- Cultivo del organismo en el biorreactor de producción en condiciones óptimas para la
generación del producto.
v.- Extracción del producto y su purificación.
vi.- Eliminación de los efluentes generados durante el proceso.

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 3.b.- Biorreactores: diseño y construcción:
El diseño de un biorreactor implica una serie de pasos en los que se han de tener en cuenta
múltiples factores, siempre buscando el objetivo final por el que los microorganismos cumplan con
su función con la máxima eficiencia, con el mínimo costo y en las condiciones óptimas. Sin embargo,
aunque hay que tener en cuenta una serie de conceptos básicos, no basta con aplicarlos de forma
automática para lograr un diseño adecuado, sino que hemos de utilizar nuestro conocimiento sobre
el proceso y sobre la problemática asociada al mismo para lograr evitar los pasos limitantes y crear
un dispositivo controlado que mantenga el cultivo activo y garantice la máxima generación del
producto deseado en el menor tiempo posible, protegiendo al cultivo del ambiente externo y con el
mínimo gasto. Se protege del ambiente externo porque en él no se controla la aparición de otros
microorganismos, ni se controlan las condiciones fisicoquímicas.
Para lograr este objetivo, se habrán de seguir detenidamente y adaptar condiciones como el flujo de
gases (en el que se habrá de considerar la introducción del aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de
carbono, o cualquier gas que intervenga en el proceso de producción), la temperatura, el pH, el
oxígeno disuelto y la velocidad de agitación o circulación. Sin embargo, la mayoría de los procesos
iniciales hacen uso de un mismo tipo de biorreactor a partir del cual se realizarán adaptaciones y
escalado para una optimización del sistema de producción. El biorreactor más comúnmente
utilizado es el Reactor de Tanque Agitado o STR (del inglés Stirred Tank Reactor).

DESTACAMOS:
Componentes básicos para el proceso de bioproducción.
Diseño y construcción de un STR


4.- Reactor de Tanque Agitado (STR):
4.a.- La vasija
Este tipo de reactores consisten básicamente en una vasija con unas dimensiones que suelen estar
entre 2 y 20 Litros, con unas proporciones de 1:1 para cultivos celulares eucariotas y de 2.2:1 a 3:1
para cultivo de microorganismos en lo que alto:diámetro se refiere. Estas proporciones vienen
dadas por los mayores requerimientos de transferencia de oxígeno de los sistemas microbianos.
Además en la zona alta suele encontrarse el sistema de agitación que normalmente se realiza con
un motor instalado en el cabezal, donde la aireación se suele realizar desde la base, y que veremos
un poco más adelante. En el cabezal, o zona superior de la vasija también encontraremos puertos
para la adición de reactivos, de gases, para la retirada de muestras o para la instalación de sondas
de detección de los parámetros fisicoquímicos como termómetros, pH-metros, detectores de O2, etc.
Los materiales que se utilizan para la construcción de los reactores han de cumplir con una serie de
características como que sean químicamente inertes, esto es, no deben de liberar o filtrar
elementos al medio, ni quelar los metales ni ningún otro elemento del medio. Los de tamaño
inferior a 20 L suelen estar hechos de cristal de borosilicato, lo que los hace muy resistentes y les
permite someterse a procesos de esterilización por autoclave. Los de tamaño superior a 20 L se
fabrican a base de acero inoxidable para cumplir con la normativa de seguridad en cuestión de

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presión, dado que son demasiado grandes para caber en un autoclave, y el proceso de esterilización
se realiza mediante el aumento de temperatura y presión en el interior del mismo biorreactor. En
cuanto al diseño se evita la presencia de zonas de difícil acceso para su limpieza, por lo que
normalmente tienen un terminado redondeado, en especial en la base, lo que también ayuda al
sistema de mezcla que está mejor caracterizado en vasijas de fondo semiesférico, que en las planas.

4.b.- Control de Temperatura
En los procesos llevados a cabo en los biorreactores, se requiere inicialmente que el medio de
cultivo alcance una temperatura lo más cercana a la temperatura óptima de crecimiento del
microorganismo, por lo que inicialmente se ha de calentar el medio, además una vez que el cultivo
alcanza una cantidad considerable de células, se genera una gran cantidad de calor como producto
de las reacciones llevadas a cabo. Temperaturas muy por debajo de la óptima, así como por encima
de la máxima tolerada pueden ser catastróficas para el bioproceso.
El control de temperatura condiciona el tipo de refrigeración o calefacción que se aplica y que
puede venir por la presencia o ausencia de una camisa o chaqueta que suele ser menos frecuente
dada la fragilidad de la misma y al encarecimiento de su fabricación. Los biorreactores de
dimensiones más grandes, a los que no se les puede incorporar esa camisa o chaqueta se refrigeran
mediante la incorporación de serpentines internos. Además, como hemos indicado anteriormente
en ocasiones hemos de calentar el medio, por lo que la vasija también se puede calefactar en base al
uso de mantas calefactoras que se sitúan alrededor de la vasija. Estos procesos de enfriamiento y
calefacción han de estar finamente controladas en base al registro de las variaciones de
temperatura que ocurran en el medio de cultivo, y de los requerimientos de producción.
Recordamos que por ejemplo en la producción de xantano, la temperatura óptima de crecimiento
del microorganismo productor Xanthomonas campestris no coincide con la temperatura óptima de
producción, y que cambios en 5oC hacia arriba o hacia abajo producen un aumento en la producción
del biopolímero.

4.c.- Control de Gases:
Los cultivos aerobios requieren de una transferencia de oxígeno al medio de cultivo. El principal
problema está en que el oxígeno es poco soluble en agua y menos aún en los medios de cultivo,
además de tener una baja presencia dentro del aire donde se encuentra aproximadamente en una
quinta parte de este gas. Para lograr la máxima transferencia de oxígeno se recurre por lo tanto a la
agitación del medio con el aire presente en el reactor. Esta agitación además es útil para lograr la
mezcla de los componentes del medio, del resto de los aditivos, así como para lograr una
distribución homogénea de los componentes que integran el proceso de la biorreacción.
4.c.1.- Deflectores
Para lograr esta agitación se recurre a distintas estrategias que incluyen elevar la potencia del
motor para incrementar la velocidad de agitación. En este sentido hemos de tener en cuenta que
por una parte una mayor velocidad de agitación se traduce en un mayor costo de energía y por lo
tanto también un mayor costo económico del proceso de producción, pero además también tiene

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un límite a partir del cual el proceso es perjudicial para los microorganismos a causa del esfuerzo
de corte tan alto que se llega a generar. Por estas razones para garantizar la máxima transferencia
de oxígeno posible, se suele instalar en la vasija deflectores (sistemas utilizados para cambiar la
dirección del fluido presente en la vasija y así se evite que el fluido gire como un sólido rígido) en
forma de remo plano y que normalmente ocupan el 10% del diámetro de la vasija, dado que
deflectores de menor superficie reducen rápidamente su efecto, mientras que deflectores de mayor
tamaño no suelen tener mejor efecto. El uso de los deflectores elimina el flujo laminar, crea
turbulencias (reduce el flujo laminar y promueve el flujo turbulento) y mejora la transferencia de
masas. También hemos de recordar que otros elementos que se introducen en la vasija como son
los sensores de pH y de O2 también actúan en cierta manera como deflectores.

4.c.2.- Difusores de Aire:
Otro de los equipos auxiliares esenciales en los reactores que operan sistemas aeróbicos es la
presencia de un Difusor de Aire o Aireador. La clave de un buen difusor de aire consiste en que
logre una máxima transferencia del aire al medio de cultivo, de forma que se prefiere la formación
de gran cantidad de burbujas pequeñas de aire sobre una menor cantidad de burbujas grandes, de
esta forma se aumenta la superficie de interacción entre burbuja y medio lo que favorece la
transferencia de masas.

Por lo tanto consideramos que un factor clave en el proceso es la Transferencia de Masas la cual
cambia la composición de soluciones y mezclas mediante procesos en los que no se requiere
necesariamente que ocurran reacciones químicas y que se caracterizan por transferir una sustancia
a través de otra u otras a nivel molecular. Al poner en contacto dos fases con distinta composición
química, una sustancia difunde, pasando de una zona donde se encuentra a alta concentración para
migrar a otra donde su concentración es menor.

Para facilitar la transferencia de masas mediante la formación de numerosas burbujas de aire se
puede recurrir al uso de distintos tipos de difusores. El más sencillo consiste en un tubo en forma
de L conocido como Burbujeador en L que toma aire desde el exterior, pasando a través de un
filtro de 0,22 micras para obtener aire estéril y liberarlo justo bajo el sistema de agitación y de los
deflectores, a través de un conjunto de orificios taladrados con precisión en la base del tubo. Este
tipo de burbujeador se utiliza para flujos altos de aire (hasta 2 volumenes de la vasija/minuto, ó
vvm). Como alternativa podemos encontrar los Burbujeadores de microporo diseñados para un
menor flujo de aire (hasta 0,1 volúmenes de vasija de aire por minuto, esto es 0,1 vvm), en los que
el aire estéril pasa a través de una punta sinterizada que contiene poros de aproximadamente 15
µm de diámetro, de forma que el gas entra en la fase líquida en una forma dispersa muy fina
cubriendo un área mucho mayor, lo que aumenta la transferencia de masas, en el que las burbujas
son menos energéticas, y por lo tanto causan también menos daños a las células. También hay
variantes de estos difusores, predominando el de forma de plato o de domo cilíndrico de acero

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inoxidable en el que se introducen orificios lo más pequeño posible para que de esa forma se logre
la formación de burbujas pequeñas. También existen difusores de material cerámico con poros.

En relación a los sistemas auxiliares para la difusión de oxígeno, encontramos los Agitadores o
Rodetes, que se acoplan al eje que sale del motor, además de favorecer la dispersión del gas
(oxígeno) en el líquido (medio de cultivo), también favorece la disolución de sólidos en líquidos
(incluidas las células del cultivo), de líquidos en líquidos (la mezcla de los distintos componentes
del medio y de los aditivos para por ejemplo mantener el pH en un espectro determinado) y la
transferencia de calor. Para que la mezcla de los componentes sea efectiva, el fluido impulsado por
el rodete debe recorrer todo el recipiente en un tiempo razonable. Por otra parte, la velocidad del
medio de cultivo impulsado por el rodete debe ser suficiente para arrastrar al material hacia las
partes más alejadas del tanque y formar turbulencias. Para evitar que haya zonas de la vasija donde
la velocidad del flujo sea demasiado baja, se procura eliminar las esquinas de la misma, por lo que
como hemos citado anteriormente el fondo de la misma es circular o semiesférico, y por lo que la
mayoría de las ocasiones los agitadores suelen ser cilíndricos. Estas corrientes de flujo, generadas
por el agitador, movilizan el líquido en una dirección determinada hasta que son desviadas bien por
el fondo, bien por las paredes de la vasija o bien por la presencia de deflectores u otros elementos
auxiliares con efecto deflector. Los agitadores se clasifican en dos tipos. Por una parte tenemos los
Agitadores de flujo axial, los cuales generan corrientes paralelas al eje del agitador, y por otra
tenemos los Agitadores de flujo radial, que producen corrientes en dirección tangencial o radial. En
función del tipo de problema de agitación que tengamos tendremos que seleccionar un tipo de
agitador u otro. Los tres tipos principales de agitadores utilizados en la industria son los de Hélice,
los de Paletas y los de Turbina, con los cuales se resuelven la mayoría de los problemas de agitación
quedando el resto para el 5% de los casos que no cubren estos agitadores.
En cuanto a los de Agitadores de Hélice, siendo el más común de estos el agitador de hélice marina,
y que poseen elementos impulsores consistentes en hojas cortas en los que cada hoja cubre menos
del 25% del diámetro del tanque. Estos son agitador de flujo axial, capaces de operar a alta
velocidad (500 rpm) y que se emplean para líquidos que son poco viscosos. La velocidad del motor
se ha de ajustar en función del tipo de agitador que se incorpore, de forma que con los agitadores
de hélice más pequeños, se puede utilizar la velocidad máxima del motor. Con este tipo de agitador
de hélice, se generan columnas de remolinos en el medio de cultivo con una elevada turbulencia,
desde el agitador, movilizando cualquier fracción del cultivo que permaneciese estancado. Estas
fuertes corrientes de flujo que generan los agitadores de hélice les permiten una buena eficiencia de
agitación en vasijas de gran tamaño. Sin embargo, si el tanque es de gran altura, una sola hélice
puede ser insuficiente, por lo que se pueden utilizar dos o más hélices situadas en el mismo eje a
distintas alturas.
El segundo tipo de agitadores más usados en la industria es el tipo llamado Agitador de Paletas
que consiste en un agitador de flujo radial, que consta de paletas que giran a velocidades bajas o
moderadas (entre 20 y 150 rpm) en el centro del tanque, y aunque no crean un desplazamiento
vertical del medio, sí que lo desplazan de forma radial y tangencial con respecto al agitador, a

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menos que las paletas estén inclinadas. Existen agitadores de paletas de distinta complejidad en
función del número de paletas que incorporen. El más sencillo constaría de una sola paleta plana
que gira sobre un eje vertical (empleado para problemas sencillos); mientras que para la mayoría
de casos, son corrientes los agitadores formados por dos y 3 paletas. Dado que la corriente desplaza
el líquido hacia la pared de la vasija, una vez alcanzada esta, el flujo ha de subir o bajar. La paleta se
puede modificar de forma y tamaño y crear paletas que se adapten al fondo de forma que dejen
poco espacio entre el fondo y la paleta para de esa forma rascar la superficie del fondo y evitar así la
formación de depósitos. No se consideran como buenos mezcladores. La longitud del rodete se
enmarca entre el 50 y el 80% del diámetro de la vasija y con un ancho de 1/6 a 1/10 la longitud de
la vasija.
Para evitar que el medio gire alrededor de la vasija como un sólido rígido con este sistema de
paletas es conveniente la introducción de deflectores.
El tercer tipo más frecuente de agitador que encontramos es el Agitador de Turbina un agitador
que consta de impulsor con más de cuatro hojas dispuestas sobre una misma base que se ajustan al
eje rotatorio. Este tipo de agitador es útil para los procesos que utilizan un amplio rango de
viscosidades, incluidos los de gran viscosidad, y son de gran utilidad para la mezcla de gases con
líquidos. Pueden constar de paletas rectas o curvas, inclinadas o verticales. Suelen ser útiles para
romper las burbujas grandes en varias de menor tamaño, aumentando de esta forma la
transferencia de masas. De entre estas destaca la turbina Rushton para los cultivos microbiológicos
con alta demanda de oxígeno en las que las palas se disponen verticalmente a lo largo del eje de
agitación creando un flujo radial unidireccional.

4.c.3.- Rotores
A todo esto hay que añadir el Control de Velocidad del Motor los cuales pueden alcanzar
velocidades nominales de rotación de 1.800 rpm o 3.600 rpm. Estas velocidades son demasiado
altas en los sistemas biológicos y ocasionan daños letales para los microorganismos del cultivo. Por
lo tanto, hemos de reducir la velocidad de rotación del motor a un máximo de 600 rpm para que la
velocidad no genere daño a las células del cultivo. Para lograr esta reducción se recurre al uso de
cajas de reducción de 1/3 o 1/6 para reducir la velocidad de rotación a aproximadamente 600 rpm.
Estas cajas de reducción se acoplan a la salida del eje del rotor. La velocidad de rotación está
controlada mediante un sistema de control de velocidad que puede ser analógico o digital acoplado
al motor para un control óptimo de la velocidad del motor.
En este contexto hemos de tener en cuenta que la composición del medio, el crecimiento de los
microorganismos y la obtención de ciertos productos que estos generan van a condicionar las
propiedades fisicoquímicas del medio. Ya hemos hablado del cambio de temperatura generado en
el bioproceso propio de las reacciones que ocurren y que en ocasiones han de corregirse para
garantizar la máxima producción y el máximo crecimiento. Como también estamos exponiendo aquí
la concentración de oxígeno disuelto es clave para poder garantizar este crecimiento y producción.
Concentración de oxígeno que está entre otros factores gobernada por la agitación. Esta agitación y
por consiguiente la concentración de oxígeno disuelto también se alteran como consecuencia del

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crecimiento de ciertos microorganismos y como consecuencia de la generación de ciertos
productos. Este es el caso del cultivo de ciertos microorganismos como Streptomyces kanamyceticus
(bacteria productora del antibiótico kanamicina) que genera micelios y que transforman las
propiedades físico-químicas del medio de un fluido Newtoniano a uno no Newtoniano como puede
ser un fluido plástico tipo Bingham, en el que las características del cultivo aunque similares a las de
un fluido newtoniano, requieren que el esfuerzo inicial de agitación supere un límite para que
aumente la velocidad de cizallamiento. Otro caso de alteración del medio puede venir por el cultivo
de microorganismos productores de biopolímeros como Xanthomonas campestris. La presencia de
polímeros como el xantano, produce una reducción de la viscosidad aparente con el aumento de la
velocidad de cizallamiento, generando un medio pseudoplástico. Esto se explica porque las
moléculas largas como las de estos biopolímeros se organizan alineándose unas con otras con el
aumento de la velocidad de cizallamiento, y por lo tanto se reduce su viscosidad aparente. Otro caso
de alteración de las propiedades de los fluidos viene dada por el efecto opuesto al de los
pseudoplásticos en el que un aumento de la agitación (o del esfuerzo cortante) se traduce en un
aumento de la viscosidad aparente y que denominamos como dilatantes. Esto puede ocurrir en
función de la composición del medio, y su ejemplo más notable es la adición de almidón como
fuente de C al medio de cultivo.

DESTACAMOS:

STR: Definición y características de vasija, cabezal y puerto.
Control de la temperatura.
Control de los gases: Deflectores, difusores de aire , agitadores, rotores


4.c.4.- Toma de muestras y sondas:
Para una bioproducción óptima es necesario un constante seguimiento del proceso, tanto de los
parámetros fisicoquímicos como del estado de las células para de esta forma corregir los factores
necesarios a fin de devolver al cultivo a sus condiciones óptimas de crecimiento y producción. Sin
embargo, una toma frecuente de estos registros conllevaría un alto riesgo de contaminación,
además de un gasto de tiempo importante, por lo que para evitar este riesgo y reducir el tiempo de
dedicación se puede recurrir al uso de dispositivos que tomen constantemente medidas de dichos
parámetros y que denominamos sondas. Independientemente de esta toma de registros regulares,
en ocasiones es conveniente la toma de parte del cultivo que permita valorar parámetros no
registrables a partir de las sondas. Cuando se realiza la toma de muestras, es importante no retirar
más del 10% del volumen del cultivo. En un biorreactor estándar es normal encontrar sondas para
el control de la temperatura, del pH y del oxígeno disuelto.

i.- Registro de la Temperatura
El seguimiento de la temperatura es uno de los factores que se realizó de manera más temprana
en la evolución de los biorreactores. Tal y como hemos indicado anteriormente, ya en 1757 se
iniciaron los primeros registros de temperatura en la industria cervecera y en 1801 aparece el
primer sistema de refrigeración. Hoy en día sigue siendo de gran importancia el seguimiento y

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control de la temperatura en el bioproceso. Para el seguimiento de los cambios en la temperatura se
puede recurrir a distintos elementos aunque en los biorreactores actuales solo se utilizan
normalmente dos tipos: el termómetro de resistencia eléctrica y el termistor. Aunque el
termómetro de mercurio no se utiliza directamente para el registro de temperatura en el
biorreactor, sí que se suele utilizar para calibrar los otros dos.
En cuanto a los termómetros de resistencia eléctrica, se basan en la propiedad de que la resistencia a
la electricidad en los metales cambia con las variaciones en la temperatura, es decir, son capaces de
transformar una variación de temperatura en una variación de resistencia eléctrica. Son
dispositivos que funcionan en un amplio rango de temperaturas (-200°C a +850°C) con una gran
resolución (de ± 0,1°C). Estos dispositivos contienen un bulbo donde está presente el elemento de
resistencia que normalmente es un cable de platino de 100-Ω (ohmios) de resistencia englobado en
mica (si se requiere alta precisión) o en cerámica (si se prefiere la robustez a consta de la precisión),
alrededor del cual se enrolla el elemento de detección. Estos termómetros son rápidos (detectan
cambios entre 1 y 10 segundos). Estos termómetros se sitúan normalmente en vainas de acero
inoxidable.
El termistor basa su funcionamiento en la variación de la resistividad de los semiconductores con
los cambios en la temperatura. El término termistor proviene del término inglés Thermally
Sensitive Resistor. Los termistores se fabrican a partir de óxidos semiconductores, tales como el
óxido férrico, el óxido de níquel, o el óxido de cobalto. Los termistores son relativamente baratos y
muy estables dando lecturas muy reproducibles. Sin embargo, al contrario que los termómetros de
resistencia tienen como desventaja que no tienen una relación lineal entre la temperatura y la curva
de resistencia.

ii.- Control del pH
En cuanto a la sonda de pH, permite registrar el valor de pH en el que se encuentra el cultivo, ya
que a medida que ocurren las reacciones metabólicas propias del crecimiento celular así como de la
generación del producto, se produce una alteración en el pH del cultivo, especialmente en los
cultivos de lote o batch. Aunque los cambios bruscos de pH se pueden evitar mediante el uso de un
medio adecuado en el que se incorporen tampones, o mediante sistemas de lote alimentado o fed-
batch. Si esta variación en el pH persiste, se ha de corregir hacia el pH óptimo mediante la adición
de un ácido (normalmente HCl o sulfúrico) o de una base (normalmente NaOH o amonio).
Normalmente el pH cambia en el mismo sentido. Esta variación en el pH se registra utilizando un
electrodo de vidrio combinado que soporte los procesos de esterilización repetida como son los
121oC y presiones de 1 atmósfera. El electrodo puede ser de plata/cloruro de plata con cloruro de
potasio como electrolito. El electrodo del pH-metro se conecta con cables a una unidad de Control.
Los procesos de autoclavado repetidos pueden alterar progresivamente el funcionamiento del
electrodo. La unidad de control puede consistir en un sistema de encendido/apagado o en un
sistema más complejo. En los sistemas de encendido/apagado, el controlador está preajustado a un
pH determinado, y si el pH-metro registra un valor por encima o por debajo del determinado,
entonces la señal acciona un relé que abre una válvula o acciona una bomba peristáltica que

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permite la adición de ácido o base según se requiera durante un periodo de tiempo establecido
entre 0 y 5 segundos, a partir del cual deja de añadirse el ácido o la base para pasar a un ciclo de
mezcla, en el que nuevamente durante un periodo establecido de entre 0 y 60 segundos se mezcla
la solución añadida, para volver a registrar el pH de nuevo y establecer si se ha de repetir la adición
de solución. La adición de pequeñas cantidades de ácido o base en repetidas ocasiones evita que se
desvíe el pH del determinado previamente. Además en este proceso suele haber un registrador que
nos indicará como ha ido cambiando el pH a lo largo del proceso.

4.c.5.- Analizador de gases:
La medida y control del flujo de gases al biorreactor es importante en el control de los
biorreactores. La falta de oxígeno disuelto en el medio ha de corregirse mediante un aumento del
flujo de aire. Para calcular el flujo de gases al biorreactor, hay que recurrir a analizadores de
oxígeno o de CO2, los cuales se basan en la medida de la diferencia de temperatura en el sistema
efluente del gas tras pasar por un calentador situado en la vía del gas. La tasa de flujo másico del gas,
Q, puede calcularse mediante la ecuación del calor específico:

H = Q·Cp(T2 - T1)
Donde H = calor transferido
Q = Tasa de flujo másico del gas
Cp = Calor específico del gas
T1 = Temperatura del gas antes de la transferencia de calor
T2 = Temperatura del gas después de la transferencia de calor.
Esta ecuación se puede reorganizar despejando Q.

H
Q =
Cp(T2 - T1)

Si se registra que el oxígeno disuelto está por debajo de los límites requeridos se puede recurrir a
un sistema de válvula de aguja que permitirá el aumento en el flujo del aire o del gas requerido.
Además el flujo de gases se suele medir mediante el uso de un rotámetro, que consiste en un
dispositivo a manera de tubo de cristal graduado en el que aumenta el diámetro de la sección, y en
el que se encuentra una bola que puede flotar y cuya altura será mayor cuanto mayor sea el flujo del
gas.

Otro de los parámetros que es importante seguir en los sistemas de biorreactores es la Presión. La
medida de la presión es especialmente importante por razones de seguridad, dado que si sobrepasa
ciertos límites se corre un riesgo de explosión. Por lo tanto es importante que los equipos cuenten
con sistemas de medida, indicadores, registros y control de la presión. En los biorreactores, la
presión afecta a la concentración de los gases disueltos, y contribuye al mantenimiento de la

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esterilidad cuando existe una cierta presión positiva. Uno de los sistemas de medida de presión
estándar son los Manómetros de Bourdon, que consisten en tubos metálicos aplastados, hermético,
cerrado por un extremo y enrollado en espiral. Además los biorreactores suelen estar dotados de
válvulas de seguridad para evitar sobrepresiones, y prevenir posibles explosiones.

i.- Medida del Oxígeno Disuelto
La mayoría de los procesos que se llevan a cabo en biorreactores son de tipo aerobio, por lo que
requieren de la presencia de oxígeno disuelto en el medio. Mediante cálculos estequiométricos se
estima que se requieren de 192 g de oxígeno para la completa oxidación de 180 g de glucosa, y esto
sin tener en cuenta el carbono que pasa a constituir parte de las biomoléculas de la célula donde se
produce un mayor consumo de oxígeno. Sin embargo el oxígeno es 6.000 veces menos soluble en
agua que la glucosa, por lo que se requiere de mecanismos adicionales que garanticen la disolución
de este gas en el medio de cultivo donde están presentes los microorganismos que lo tienen que
utilizar. A estos factores hay que añadir la tasa específica de absorción de oxígeno (QO2)
considerada como los mmoles de oxígeno consumidos por gramo de peso seco de células por hora.
La tasa específica de absorción de oxígeno aumenta con la concentración de oxígeno disuelta hasta
un punto conocido como Ccrítico o nivel crítico, a partir del cual no aumenta esta tasa específica de
absorción de oxígeno. Por lo tanto, la producción máxima de biomasa puede darse manteniendo el
oxígeno disuelto por encima del nivel crítico. Además es importante recordar que en ocasiones el
producto que se pretende obtener desde esa biomasa microbiana puede estar favorecido por
alteraciones en la concentración de oxígeno disuelto. Por lo tanto es de gran importancia conocer
esta concentración de oxígeno disuelto con precisión, además de poder controlarla. Desde los años
setenta del siglo pasado se dispone de electrodos de oxígeno esterilizables por vapor que permiten
el seguimiento de esta concentración. Estos electrodos miden la presión parcial de oxígeno disuelto
en lugar de la concentración de oxígeno disuelto, de forma que cambios en la presión pueden
afectar significativamente a la lectura. De igual forma los cambios de temperatura también pueden
afectar significativamente a la lectura (se estima que en un 2,5% por cada 1oC), por lo que muchos
electrodos de oxígeno cuentan con sensores de temperatura internos que les permite corregir el
dato que presentan. La composición del medio también afecta de manera importante la solubilidad
del oxígeno aunque la presión parcial de oxígeno medida será la misma. Por lo tanto es importante
calibrar el electrodo con el porcentaje de saturación de oxígeno.
El tipo de electrodo que se use dependerá del tipo de biorreactor en el que queremos utilizarlo. Así,
para biorreactores de 1 L, el electrodo de oxígeno más común es el Electrodo Galvánico, que
consta de un ánodo de plomo, un cátodo de plata y como electrolito utilizan KOH, ClH, Bicarbonato
o acetato. Estos electrodos tienen la punta sensora a base de una membrana de teflón, de
polietileno o de poliestireno. Sin embargo, estos electrodos son de respuesta lenta, dado que el
oxígeno migra lentamente a través de estas membranas. Otra desventaja de estos electrodos es que
tienen una vida corta dada su tendencia a corroérseles el ánodo. Otro tipo que podemos encontrar
es el Electrodo Polarográfico, que son más voluminosos que los galvánicos. Este segundo tipo de
electrodo tienen el ánodo de plata, que se polarizan negativamente con respecto a los cátodos de

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referencia hechos de platino o de oro. El electrolito que utilizan consiste en una solución acuosa de
KCl, y dan medidas mucho más rápidas que lo galvánicos. Aunque los polarográficos pueden ser
mucho más caros, requieren menos mantenimiento y solo requieren del cambio de membrana de la
punta cada cierto tiempo. Si se requiere aumentar la concentración de oxígeno disuelto en el medio
habrá que aumentar el flujo de aire, las rpm del agitador o si utilizamos biorreactores pequeños
como los de laboratorio, donde se puede permitir este gasto, mediante un aumento de la
concentración de oxígeno en el gas de entrada.

4.c.6.- Sistemas de medida de espuma y control de espuma
En muchos bioprocesos se pueden generar grandes cantidades de espuma que han de controlarse
para evitar problemas mayores, porque entre otros factores afectan a la cantidad de oxígeno
disuelto en el medio, producido por el cambio en el volumen de la burbuja, reducción en el volumen
de trabajo, menor flujo másico y menor flujo de temperatura, bloqueo de los filtros de salida e
interferencias con los sensores generando un seguimiento y control erróneo del sistema. La espuma
suele estar causada por la presencia de proteínas en el medio, que en la interfase aire-medio forma
una capa difícil de eliminar. La formación de espuma puede provocar la retirada de células del
medio, lo que provocará la autolisis, liberando mayor cantidad de proteínas y retroalimentando el
ciclo de producción de espuma. Uno de los sistemas de control de espuma consiste en la adición de
agentes antiespumantes. Hoy en día existen sensores de espuma que son capaces de activar
bombas que vierten antiespumantes al medio (para la composición de los antiespumantes ver el
apartado dedicado a medios).
DESTACAMOS:
Registro de la temperatura: Termómetros y termistors.
Registro y control del pH.
Analizador de gases: Medida de O2 disuelto.
Medida y control de espuma


4.d.- Toma de muestras
Aunque se pueden introducir sensores para otros parámetros incluidos sensores del potencial
redox, electrodos de CO2, sensores de iones específicos (NH4+, Ca2+, K+, Mg2+, PO3-, SO2-, etc),
espectroscopía cercana al infrarrojos, espectrómetros de masas, etc, hay ciertos parámetros en los
que los sistemas de sondas o sensores no son suficientes para conocer lo que está ocurriendo en el
biorreactor, o en los que económicamente no compensa la introducción de una sonda por el bajo
número de veces que se toma esa medida. En ocasiones se requiere contar las células para conocer
su viabilidad, analizar la concentración del producto, o de la composición del medio por un método
en el que las sondas normalmente no son suficientes. En estos casos se ha de recurrir a la toma de
muestras del interior de la vasija o tanque. Esta toma se ha de limitar al mínimo posible, dado que
supone una posible fuente de contaminación. Por lo tanto hemos de utilizar equipos que nos
permitan la extracción aséptica de parte del volumen del tanque o vasija. Un equipo de toma de
muestra sencillo en una vasija de vidrio consiste en una tubería que iría conectada desde el cabezal

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hasta el interior de la vasija. A esta tubería se le suele conectar una jeringa tras un filtro de 0,22 µm
que se usa para succionar desde la vasija. Mediante un proceso cuidadoso se puede acoplar este
tubo a un bote de colección.

4.e.- Sistema Central de Control
Todos los parámetros que se toman a través de las sondas descritas anteriormente integran sus
datos en un sistema central de control el cual ha de dar la señal a otros elementos para el correcto
funcionamiento del sistema. El sistema de control compara el valor de la medida que toma a través
de cualquiera de sus sensores con un valor predeterminado y genera una señal para corregir esa
diferencia, mediante la apertura de una válvula o mediante la modificación de la velocidad de una
bomba hasta que ese parámetro vuelva a su valor predeterminado. Las características ideales de los
sistemas de control han de garantizar que el sistema que regulan sea estable, que el sistema de
regulación sea lo suficientemente rápido, y que esté adecuadamente amortiguado. Además el
sistema ha de tener una precisión determinada en régimen estacionario, y ha de atenuar los efectos
de ruidos, perturbaciones y cambios de carga. Los sistemas de control pueden ser manuales o
automáticos. Normalmente se utilizan sistemas automáticos para reducir al máximo el error
humano, y los costes de personal. Los sistemas automáticos suelen ser de cuatro tipos:
1.- Sistemas de Control de dos posiciones (ON/OFF)
2.- Sistemas de Control Proporcionales
3.- Controladores Integrativos
4.- Controladores Derivativos.
Los controladores de dos posiciones (ON/OFF) son los más sencillos y se basan en el uso de
válvulas que están abiertas o cerradas completamente. Con este sistema de funcionamiento se
genera un sistema oscilante que varía entre los valores prefijados como máximos y mínimos, los
cuales se habrán de establecer para garantizar el funcionamiento del sistema reduciendo al máximo
las aperturas o cierres de la válvula. Un ejemplo sería la adición de ácido para corregir el pH del
medio hasta un valor preestablecido. Estos sistemas de dos posiciones se utilizan en sistemas
donde no se requiere una elevada precisión, y no son adecuados para el control de procesos en los
que es probable el cambio brusco de parámetros desde su equilibrio. En estos casos se requieren de
los otros sistemas automáticos.
Los controladores proporcionales generan respuestas con un grado que depende de la
desviación del nivel de la señal recogida con respecto al valor preestablecido (a esta diferencia se le
denomina como error).
Matemáticamente se pueden expresar mediante la fórmula:
M = Mo + KcΣ
Donde M es la señal recogida por el sensor, Mo es la señal registrada cuando no hay error, Kc es la
sensibilidad del controlador o ganancia proporcional y Σ es el error de la señal. De manera que a
mayor cambio en las condiciones (mayor error), mayor será la acción correctiva que se aplicará.
Los controladores integrativos generan una respuesta que es función de la integral del error, de
forma que se definen por la fórmula:

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 M = Mo + 1/T1 ( ∫ Σ · dt)
donde T1 es el tiempo integrado.
De esta forma la respuesta del controladores integrativos son lentas al principio, tienen una mayor
desviación con respecto a los controladores proporcionales, y la respuesta tarda mucho más en
restablecer el parámetro preestablecido. La ventaja con otros sistemas es que no presentan desfase.

Los controladores derivativos registran el grado de error y generan una respuesta que es
proporcional a la derivada del error. La fórmula por la que se rigen por lo tanto es:
M = Mo + Td (dΣ / dt)
donde es una tasa constante del tiempo.
En estos sistemas si el error es constante, el controlador no puede corregirlo.
Además existen controladores basados en combinaciones de los anteriores denominados
controladores combinados.

El sistema de control está integrado bajo el control de programas informáticos que permiten
controlar el sistema a múltiples niveles en numerosas variables.


5.- Otros Biorreactores alternativos al STR:

Esta es la descripción para el biorreactor de uso más común que hemos dado en llamar como
Reactor de tanque agitado o STR. Sin embargo existen otros tipos de biorreactores cuyo
funcionamiento es más adecuado para otros tipos de procesos. En función de la distribución del gas,
podemos clasificar a los biorreactores como i.- Biorreactores de distribución de gas por agitación,
que acabamos de explicar; ii.- Biorreactores que utilizan bombas de distribución del gas; iii.-
Distribución del gas mediante aire a presión; iv.- Biorreactores con fase continua de gas; v.-
Fermentadores de tipo Waldhof; vi.- Acetators y Cavitadores; vii.- Biorreactores de Torre; viii.-
Vasijas cilindrocónicas; ix.- Fermentadores de ascensor de aire; x.- Fermentadores de chorro
profundo; xi.- Columna de ciclón; xii.- Torre empaquetada; xiii.- Disco rotante, etc.


6.- Modos de Operación en los STR:
Existen otros tipos de clasificaciones de biorreactores en función de otros tipos de variables. Una de
estas clasificaciones es de gran importancia en los bioprocesos y viene dada en función del tipo de
alimentación que reciben las células.
Este tipo de clasificación organiza los biorreactores en tres tipos considerados como los de mayor
uso para la generación de productos biotecnológicos y que son el cultivo por Lote o Batch, el cultivo
por Lote Alimentado o Fed-Batch y el Cultivo Continuo o Quimiostato.

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i.- En un cultivo Batch o Lote, no hay flujos de líquidos ni a la entrada (no entran nutrientes) ni a la
salida (no sale cultivo). Todos los componentes del sistema se añaden al cultivo al principio del
proceso y una vez que el sistema se inicia, se deja funcionando sin interferencia hasta que alguno de
los sustratos se vuelve limitante o se generan productos inhibitorios como puede ser el acetato.
Este tipo de biorreactor es el propio del inicio de los procesos industriales equivalente a las
barricas iniciales de cultivo. Hoy en día utilizaría sistemas más complejos para cumplir con los
criterios del diseño óptimo de un biorreactor (ver más abajo). En un cultivo en batch se observan
las fases típicas descritas para el crecimiento bacteriano, empezando con una fase lag de
crecimiento lento donde las bacterias se adaptan al nuevo ambiente. A continuación viene una fase
logarítmica de crecimiento rápido o exponencial en el que las células se duplican cada cierto
intervalo de tiempo. Cuando se empiezan a agotar los nutrientes y comienzan a aparecer productos
tóxicos del metabolismo, el cultivo entra en fase estacionaria donde las células dejan de
multiplicarse. A continuación se inicia la última fase que se corresponde con la fase de muerte
exponencial en el que las células mueren progresivamente.

ii.- En un cultivo Fed-Batch o de Lote Alimentado se produce un flujo de entrada de nutrientes,
pero no ocurre flujo de salida alguno. Por esta razón el volumen del cultivo va aumentando con el
tiempo. Este es el tipo de biorreactor que como hemos indicado anteriormente surge como
necesidad para la generación de alta concentración de biomasa de levadura y que se logra mediante
la limitación de la fuente de carbono, fue de gran utilidad para evitar la entrada en un proceso
fermentativo de las levaduras cuando se buscaba obtener biomasa de ellas. En caso de entrar en
proceso fermentativo, el crecimiento celular se ve inhibido por el desplazamiento de su
metabolismo a procesos fermentativos de producción de etanol. Por lo tanto un cultivo de Lote
Alimentado se caracteriza por controlar la adición de un nutriente al medio que genera las
variaciones temporales en el suministro de nutrientes que permiten un control más fino de
procesos celulares como el crecimiento celular, la toma de nutrientes, y la producción de ciertos
metabolitos. Es por lo tanto un sistema útil para la producción de metabolitos primarios. Cuando se
utilizan procesos basados en lote-alimentado, el proceso termina cuando se alcanza el máximo
volumen posible de la vasija del biorreactor. Este tipo de cultivo está normalmente precedido de un
paso previo de cultivo en Lote o tipo Batch, e igualmente puede terminar con el mantenimiento en
sistema Batch una vez alcanzado el máximo volumen de la vasija.

iii.- En un Cultivo Continuo se produce tanto un flujo de entrada como un flujo de salida. En este
tipo de cultivo, se procura que ambos flujos sean iguales, de manera que el volumen se mantiene
constante. Por otra parte, en este tipo de cultivo se opera en fase estacionaria, de forma que no hay
acumulación de producto, ni de biomasa, ni de sustrato. Este tipo de cultivo está normalmente
precedido de un cultivo en Lote o en Lote alimentado.

En el proceso de diseño de un biorreactor hay que tener en cuenta que existen factores que afectan
a la cinética de crecimiento del microorganismo que dependen de la naturaleza propia de este

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microorganismo, así como del producto que se pretenda obtener. Ya hemos visto que a lo largo de
la historia de los procesos biotecnológicos a nivel industrial se ha ido adaptando el sistema de
producción a los requerimientos particulares del proceso. Por estas razones, lo primero que se ha
de establecer para un correcto diseño de un biorreactor es el fin último al que va destinado y para
el que se va a utilizar, el modo de operar y/o el proceso de cultivo.

Para lograr un diseño óptimo del biorreactor se ha de lograr los siguientes objetivos:
1.- Que el sistema mantenga las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de
cultivo.
2.- Que la temperatura y el pH del cultivo se mantenga constante y homogéneo dentro de unos
parámetros establecidos.
3.- Se ha de conseguir que no existan grandes gradientes de concentración nutrientes, de forma
que se mantenga su concentración de manera estable a lo largo del proceso.
4.- Se ha de evitar los procesos de sedimentación y de floculación.
5.- Los gases que sirven de nutrientes en el cultivo han de difundir a una velocidad adecuada
por el cultivo.
6.- Se ha de lograr que el cultivo se mantenga puro durante largos periodos de tiempo, a ser
posible durante todo el proceso de producción.
7.- El ambiente del cultivo ha de ser aséptico, incluso durante el proceso de extracción o toma
de muestras.
8.- Se ha de lograr que tanto el rendimiento como la producción sean máximos.
9.- Tanto los gastos como los costos de producción han de reducirse al mínimo.
10.- El tiempo requerido para el proceso de producción ha de ser el mínimo posible.

DESTACAMOS:
Modelos de operación STR: Lote; Lote-Alimentado y Cultivo Continuo
Diseño óptimo de un biorreactor


7.- Medios de Cultivo
Una vez seleccionado el biorreactor y el modo de operación, hemos de definir el medio que se
utilizará para el cultivo del microorganismo y la producción del bioproducto de interés. Tal y como
hemos visto en el tema 18, dedicado a metabolitos primarios como el ácido cítrico, la composición y
características del mismo es esencial en la obtención del producto en condiciones óptimas. Por lo
tanto el medio se habrá de adaptar en concreto a cada bioproceso. En general todos los medios
tienen en común ciertas características en función de los requisitos celulares de los
microorganismos a cultivar que suelen incluir agua, fuentes de carbono (en cultivos no
fotosintéticos), nitrógeno (en cultivos no fijadores de nitrógeno), energía (para los no autótrofos),
minerales, y vitaminas, así como de oxígeno (en función de si realiza metabolismo aerobio) o
dióxido de carbono (si son fotótrofos). De estos medios se espera que cumpla con una serie de
criterios como son que:

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 i.- Sea lo más económico posible.
ii.- Genere la máxima producción celular de biomasa por gramo de substrato utilizado.
iii.- Genere la máxima concentración de producto (o biomasa si el objetivo final es
producción de ésta) a la máxima tasa de formación de ese producto.
iv.- Se genere la mínima tasa de formación de subproductos indeseados.
v.- Se adapte al proceso de producción y de esterilización, así como a los elementos de
aireación, agitación, extracción, purificación y tratamiento de residuos.
Algunos de los substratos que cumplen con estos criterios y que se utilizan como fuentes de
carbono en medios de cultivo incluyen molasas de caña, de remolacha, cereales, almidón, glucosa,
sacarosa, y lactosa. Como fuente de nitrógeno se utilizan sales de amonio, urea, nitratos, licor de
maceración de maíz, harina de soja, residuos de mataderos y residuos de procesos de fermentación.
Los tipos de medio de cultivo se pueden clasificar en sólidos, semi-sólidos o líquidos, siendo los
líquidos los más usados y en los que nos centraremos en principio.
Los medios también se pueden clasificar en cuanto a su composición en sintéticos o definidos, semi-
sintéticos y complejos.
Los medios sintéticos están perfectamente definidos desde el punto de vista químico, por lo que
reciben este otro nombre. En ellos se conoce cada uno de sus componentes químicos así como su
concentración. Su composición se suele basar en una fuente de carbono, otra de nitrógeno, y un
conjunto de sales (generalmente inorgánicas). Aunque estos medios son de gran utilidad en el
laboratorio, su gran costo impide que tengan uso a nivel industrial. Sin embargo, tal y como se ha
comentado son una necesidad en la producción de ciertos aminoácidos cuya producción hace uso
de mutantes auxótrofos. La ventaja del uso de estos compuestos reside en que dado lo definido del
medio, los procesos que los utilizan son mucho más reproducibles que los basados en medios
complejos. Además estos medios permiten que tras el bioproceso sea mucho más fácil la
purificación del producto final.

7.a.- Agua
El agua es el componente más abundante en los bioprocesos, donde se utiliza como parte esencial
del medio, pero además tiene gran uso también como parte de los elementos auxiliares tales como
sistema de refrigeración, calefactores, así como para la limpieza y enjuague del biorreactor. Es por
lo tanto importante disponer de suministro de agua de calidad en las proximidades del biorreactor.
Este agua ha de contar con un nivel de reproducibilidad, esto es, que se mantengan sus
características fisicoquímicas como su pH, tipos y concentración de sales, etc. Si estas no son las
óptimas se habrá de recurrir al uso de desionizadores o a la adición de aquellas sales que sean
necesarias.
En muchas ocasiones es esencial contar con un sistema de reciclado del agua del proceso de forma
que se abaraten los costes de producción y los del tratamiento de residuos. Este fue el caso cuando
ICI plc se lanzó a la producción de micoproteína, con los biorreactores más grandes utilizados hasta
ahora, donde se reciclaba el 86% del agua utilizada.

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 7.b.- Fuente de Carbono
La fuente de Carbono a utilizar en un proceso es determinante en muchos casos de la viabilidad del
producto que se quiere generar. Para la generación de productos de bajo precio como micoproteína,
etanol, aminoácidos, ácidos orgánicos o polímeros puede suponer más de la mitad del precio final
del producto.
Las empresas que generan productos de base biotecnológica a través de biorreactores han de
buscar fuentes de carbono alternativas para sus bioprocesos de forma que se puedan adaptar a los
cambios del precio en el mercado de las distintas fuentes de carbono, así como a la oferta geográfica
de cada sitio de producción. Así, Pfizer Ltd. ha llegado a utilizar hasta diez fuentes de carbono
distintas para la producción de uno de sus antibióticos en función de la localización geográfica de la
fábrica y del coste económico de esa fuente de carbono.
Otros factores son la pureza de esta fuente de carbono de manera que la presencia de metales
pesados o elementos radioactivos en ciertos productos, los inutiliza para su uso. La presencia de
otros elementos químicos como por ejemplo puede ser la presencia de iones manganeso que los
hace incompatibles con el proceso de producción de ácido cítrico, tal y como hemos visto en el tema
dedicado a metabolitos primarios.
La susceptibilidad para los procesos de esterilización también marca la capacidad de su uso, ya que
existen carbohidratos que forma reacciones de Maillard en presencia de ciertos compuestos
nitrogenados y que pueden conllevar la inhibición del crecimiento del microorganismo.
Las fuentes de Carbono normalmente utilizadas en los medios para biorreactores suelen ser
carbohidratos entre los que destacan como hemos indicado anteriormente las molasas de caña o de
remolacha (subproductos del proceso de cristalización de azúcares extraídos de esos dos cultivos,
que en ocasiones contienen impurezas que han de ser eliminadas antes de su uso), los cereales
(normalmente en forma molida), almidón (parcialmente hidrolizado por ácidos o enzimas para
evitar que en el medio genere fluidos dilatantes que afectaría fuertemente al sistema de agitación),
glucosa, sacarosa (estos tres últimos compuestos suelen ser de baja pureza para evitar un alto
coste) y lactosa (que normalmente se usa como parte del suero de la leche como subproducto de la
industria láctea).
Además de los carbohidratos también se ha propuesto el uso de aceites y grasas como fuentes de
carbono, los cuales contienen más del doble del valor energético que presentan los carbohidratos, y
que por otra parte suponen una reducción en el volumen que se requiere para su uso, por lo que
son más adecuados para los procesos tipo Fed-Batch o de lote alimentado, donde el proceso ha de
detenerse al alcanzarse el volumen final de la vasija o tanque. Además los aceites tienen un efecto
antiespumante, por lo que su uso supone una ventaja adicional al no requerir un procesado
posterior. Pfizer utiliza una amplia gama de aceites y grasas en su proceso de producción de
antibióticos. También se han utilizado aceite de soja o de colza en determinados bioprocesos y en
otras ocasiones en que la pureza del sustrato era de gran importancia también se ha utilizado
glicerol trioleato. El metil-oleato se ha utilizado en la producción de cefalosporinas.
Otras fuentes de carbono propuestas son los hidrocarburos y sus derivados. En concreto se ha
utilizado n-alcanos para la producción de aminoácidos, vitaminas, nucleótidos, ácidos orgánicos,

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antibióticos, enzimas y otras proteínas, mientras que para la producción de biomasa también se ha
utilizado metano, metanol y n-alcanos.

7.c.- Fuente de Nitrógeno
La mayor parte de los microorganismos pueden utilizar tanto nitrógeno orgánico como inorgánico.
En cuanto al inorgánico encontramos amoniaco, sales de amonio o nitratos. Con respecto al
amoniaco, también hay que tener en cuenta que este se utiliza para equilibrar el pH y que es la
principal fuente de nitrógeno en los medios definidos para la producción comercial de sero-
albúmina humana a partir de Saccharomyces cerivisae. En cuanto a las sales de amonio, tales como
el Sulfato de Amonio, hay que tener en cuenta que estas producen normalmente acidificación del
medio. Por otra parte, los nitratos pueden generar un aumento del pH, basificando el medio. Así
cuando se utiliza nitrato de amonio, primero se utiliza el amonio lo que supone una bajada del pH, y
una vez agotado se utiliza el nitrato que aumenta el pH del medio. El uso de nitrógeno inorgánico
puede estar determinado por las necesidades del proceso como es el caso de la producción de ácido
cítrico descrita en el tema dedicado a metabolitos primarios.
En el caso del nitrógeno orgánico, éste puede venir en forma de aminoácidos, proteína o urea, lo
que en general supone un crecimiento más rápido del cultivo. Es más algunos microorganismos
requieren de la presencia de determinados aminoácidos esenciales para su crecimiento o en
procesos de producción, si lo que estamos utilizando son mutantes auxótrofos en alguno de estos
aminoácidos. Estos aminoácidos se suelen añadir al medio como fuentes de nitrógeno en formas
más complejas tales como hidrolizados de soja, dado que el uso de aminoácidos puros impide la
viabilidad comercial del producto por su alto precio.

7.d.- Minerales y Quelantes
Algunos minerales son esenciales para el crecimiento de casi todos los microorganismos. Estos
minerales pueden ser esenciales como es el caso del magnesio, fósforo, potasio, azufre, calcio y
cloro, mientras que hay otros que aunque sean esenciales se encuentran normalmente como
impurezas de otros componentes del medio y que incluyen el cobalto, cobre, hierro, manganeso,
molibdeno, y zinc.
Los fosfatos se suelen utilizar en cultivos en laboratorio para el equilibrio del pH al ser la base del
tampón fosfato. Sin embargo su uso a nivel industrial es mucho más reducido y ha de restringirse
en determinados procesos para la obtención de ciertos metabolitos secundarios de forma que hay
que calcular la concentración añadida al medio de forma que se agote antes de que el cultivo entre
en idiofase.
Muchos metales tienden a precipitar al autoclavarse, formando un precipitado blanquecino que
reduce la biodisponibilidad de estos elementos y que se puede solucionar mediante la adición de
agentes quelantes como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico, polifosfatos, etc.
Estos agentes quelantes evitan la precipitación de las sales y mantienen a estos minerales en forma
biodisponibles para los microorganismos los utilicen paulatinamente según sus requerimientos. Es

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importante controlar la concentración de estos agentes quelantes, ya que pueden inhibir el
crecimiento del microorganismo.

7.e.- Factores de crecimiento
Durante el crecimiento de diversos microorganismos puede requerirse de la adición de ciertos
compuestos esenciales tales como vitaminas que denominamos como factores del crecimiento.
Además de las vitaminas, en ocasiones se requiere de otros compuestos como pueden ser
determinados aminoácidos (ya indicado cuando hemos tratado la producción de aminoácidos por
parte de mutantes auxótrofos en el tema dedicado a metabolitos primarios), ácidos grasos o
esteroles. Dado que muchas de las fuentes de C y N utilizadas en los medios de cultivo ya incluyen
algunos de estos factores de crecimiento, la falta de algunos de estos factores de crecimiento puede
corregirse mediante la combinación adecuada de fuente de C y N. También hemos estudiado como
en el proceso de producción de ácido glutámico es esencial la eliminación de la biotina para la
obtención de concentraciones adecuadas de este metabolito primario mediante la inducción de la
proteína de membrana encargada de la exportación de este aminoácido.




7.f.- Reciclado del Medio de Cultivo:
Una alternativa para reducir los costos de producción en ciertos procesos consiste en el análisis de
los componentes del medio una vez completado el proceso y en el suplemento del medio utilizado
con los recursos agotados. De esta forma se puede reciclar el medio reduciendo los costes de
producción y los del tratamiento de residuos. En el caso de la producción de micoproteína, dado el
gran volumen del reactor y del medio empleado se adaptó el proceso de producción para lograr no
solo el reciclado del agua que se empleaba si no también del medio empleándose el 86% del
sobrenadante una vez extraídas las células.

7.g.- Precursores y reguladores del metabolismo
En ocasiones lo que interesa añadir al medio de cultivo no son componentes que favorezcan el
crecimiento celular, si no moléculas que promuevan la producción del compuesto de interés al ser
requerido durante el proceso de biosíntesis del mismo (precursores), o moléculas que inhiban el
catabolismo del compuesto en cuestión, y de esta forma se evite una reducción en su concentración
(inhibidores) o moléculas que actúan aumentando la actividad de ciertas enzimas y que además son
capaces de intervenir en metabolismo celular aumentando la producción de estas mismas enzimas
(inductores).
En cuanto a los precursores tenemos múltiples ejemplos como es la adición de treonina en
el proceso de biosíntesis de isoleucina por parte de Serratia marcescens tal y como hemos estudiado
en el tema 19. Otros ejemplos pueden incluir la adición de compuestos utilizados para la su

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inclusión en la cadena lateral de la penicilina y que dan lugar a las distintas variedades de penicilina
durante el proceso fermentativo de Penicillium chrysogenum. De esta forma si se añade al medio
compuestos relacionados con el ácido fenilacético se obtiene Penicilina G, pero si lo que añadimos
es ácido fenoxiacético entonces se obtiene Penicilina V. Esta observación tuvo lugar mediante el
proceso de cultivo de Penicillium chrysogenum, cuando se le añadió macerado de maíz como fuente
de C, observándose un aumento de la concentración de penicilina producida gracias a la presencia
de feniletilamina obteniéndose además penicilina G, y además permitiendo distinguir que la cadena
lateral incorporada en la molécula de penicilina era la que permitía una actividad diferencial entre
los distintos tipos de penicilinas.
En el caso de los Inhibidores, se recurre a moléculas que impide la acción de enzimas que
en caso de estar funcionales reducirían la concentración del producto de interés al utilizarlo en el
metabolismo de otras sustancias. Este es el caso de la adición de alta concentración de azúcares al
medio que se traduce en una alta concentración intracelular de glicerol que a su vez reprime la
actividad de la enzima isocitrato deshidrogenasa, facilitando la acumulación de isocitrato que en
último término conduce al aumento en la producción de ácido cítrico. Otros casos de inhibidores
pueden ser la adición de bromuro en la producción de tetraciclina por parte de Streptomyces
aureofaciens o el caso del barbiturato dietílico (primer barbirtúrico utilizado como sedativo y
sonnífero) que se emplea en la producción del antibiótico rifampicina durante el cultivo de
Nocardia mediterranei.
Por último, en el caso de los Inductores, como hemos indicado se trata de compuestos son
catalizados por las enzimas (substratos de estas enzimas) que queremos purificar que se ha
observado que promueven la producción por parte del microorganismo de esa misma enzima. Este
es el caso del almidón o de la maltosa, substratos de la α-amilasa enzima que también hemos
indicado en el tema de metabolitos primarios que se utiliza para la extracción de azúcares
fermentables de los cultivos del almidón para la producción de etanol y que se obtiene a partir de
determinadas especies del género Aspergillus o de Bacillus subtilis. Igualmente se propone el uso de
la celulasa obtenida a partir de Tricoderma viride, microorganismo que aumenta la producción de
celulasa en presencia de celulosa, y por lo tanto podríamos considerar en este contexto a la celulosa
como inductor.

7.h.- Antiespumantes
Otro de los aditivos que se añaden a los medios de cultivo son los antiespumantes, ya citados
anteriormente, y que pueden incluir aceites (también mencionados en la sección dedicada a fuentes
de carbono). Los antiespumantes han de cumplir con ciertos requisitos como el ser agentes
tensioactivos que reduzcan la tensión superficial de la espuma y que desestabilicen las películas
formadas por las proteínas mediante formación de puentes hidrófobos entre dos superficies,
desplazando las proteínas absorbidas y generando una dispersión rápida en la superficie de la
película de espuma formada. Los compuestos utilizados como antiespumantes incluyen alcoholes,
ésteres, ácidos grasos y derivados (los aceites ya mencionados), siliconas, sulfonatos y otro
conjunto de compuestos.

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8.- Optimización del medio
A lo largo de esta sección dedicada a los medios de cultivo hemos dejado claro la influencia de los
múltiples componentes del medio y como no solo su presencia o ausencia, si no también su
concentración en el medio afecta de manera muy importante el proceso de producción. Más
concretamente hemos podido apreciar en los procesos de producción de compuestos de origen
biotecnológico como por ejemplo en la producción del ácido cítrico la presencia de determinadas
moléculas, de las concentraciones de distintos componentes, y del ajuste de parámetros o variables
como el pH determinan que un medio se considere como óptimo o no. Por lo tanto es parte esencial
de un proceso de bioproducción la optimización del medio. Para ello se recurren a estrategias que
permitan el ahorro del tiempo y de los ensayos que han de buscarse para dicha optimización. Si el
número de variables que integran un medio es bajo, podemos fijar todas estas variables (nutrientes,
pH, temperatura, antiespumantes, etc) e ir cambiándolas una a una hasta encontrar las condiciones
bajo las cuales no solo se optimiza el crecimiento del cultivo, si no además se logra una máxima
producción del compuesto de interés. Este protocolo de actuación es demasiado caro y se suele
recurrir a otras estrategias en las que se cambian los distintas variables de forma simultánea. De
forma que si queremos ensayar el efecto de 3 componentes a 2 concentraciones tendríamos que
establecer ocho ensayos (23 = 8). Sin embargo, el sistema deja de ser válido cuando lo que
queremos ensayar son 7 componentes a 2 concentraciones. En este caso el número de ensayos sería
de 128 ensayos (27 = 128). Y la dificultad aumenta si en lugar de intentar integrar 2
concentraciones lo que intentamos integrar son tres concentraciones para esos 7 componentes que
pasarían a ser 2.187 ensayos (37 = 2.187). En casos en los que se trabaja con 5 o más variables se
recurre al diseño de Plackett-Burman para la optimización del medio. Con este diseño factorial se
reduce el número de ensayos a realizar. Con esta técnica se permite evaluar X-1 variables mediante
X experimentos, donde X ha de ser múltiplo de 4 (por ejemplo 8, 12, 16, 20, 24, hasta un máximo de
100). Normalmente se establece por adelantado el número de variables experimentales que se
desean determinar y se ajustan hacia arriba hasta el múltiplo de 4 más cercano. El exceso de
ensayos se utiliza como controles negativos para determinar el error del ensayo, por lo que se
recomienda un mínimo de tres controles internos.

DESTACAMOS:
Medio de Cultivo: Agua, fuente de carbono, nitrógeno, minerales,
quelantes y factores de crecimiento.
Reciclado del medio
Precursores y reguladores. Antiespumantes.
Optimización del medio

9.- Esterilización
La presencia de otros microoganismos en el biorreactor pueden causar problemas como los de
alterar la composición del medio incluso mediante la generación de metabolitos no deseados, la

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degradación del producto final, de los inhibidores, inductores o precursores, o también se puede
traducir en una competencia por los recursos (nutrientes, O2, elementos traza, etc). Por lo tanto, es
importante garantizar un grado de asepsia en el medio, para lo que se esteriliza tanto el medio a
utilizar, la vasija, los materiales que se han de añadir a lo largo del bioproceso (antiespumantes,
ácidos o bases para corregir pH, inhibidores, inductores, precursores, etc.), los equipos auxiliares
que entran en el interior de la vasija y los que se utilizan para mantener estas condiciones asépticas
durante todo el bioproceso (como los filtros, recipientes para recoger muestras, etc).
En cuanto a la esterilización del medio, se puede recurrir a métodos como son los de filtración,
radiación, ultrasonidos, tratamiento químico o tratamiento por calor. Sin embargo, el método más
comúnmente utilizado es el de autoclavado, conjuntamente con el de filtrado para aquellos
componentes que son sensibles al calor.
Los procesos de esterilización pueden dividirse en dos grandes grupos. Por una parte tenemos los
procesos de Esterilización en Lote (donde el proceso de esterilización se realiza dentro de la misma
vasija del biorreactor (in situ) o introduciendo el biorreactor en una olla a presión (ex situ), y por
otra tenemos los procesos de Esterilización Continua (en la que el medio se esteriliza a medida que
se va a ir utilizando en el biorreactor) y que se conoce como Intercambiador de Calor en Espiral

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BIBLIOGRAFIA:
P.F. Stanbury, A. Whitaker y S.J. Hall (2003) Principles of Fermentation Technology. Second Edition.
Butterworth Heinemann. Elsevier Science. Oxford. Reino Unido.

M.J. Waites, N.L. Morgan, J.S. Rockey, and G. Higton (2009). Industrial Microbiology. An introduction.
Blackwell Science. Oxford. Reino Unido.

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