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MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL INGENIERÍA EN AGROALIMENTOS UNViME 2016

INDUSTRIAL INGENIERÍA EN AGROALIMENTOS UNViME 2016 Nutrición de los microorganismos. Substratos y medios de

Nutrición de los microorganismos. Substratos y medios de cultivo para la fermentación industrial.

DRA. MARÍA CECILIA VILLA

LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Es el estudio de la microbiología orientada a la producción de elementos de interés industrial mediante procesos en los que interviene, en algún paso, un microorganismo.

Surge con el ánimo de generar compuestos químicos complejos de una forma mas sencilla y barata que mediante síntesis orgánica.

Esto es posible debido a la enorme versatilidad metabólica e los

microorganismos que frecuentemente son capaces de producir los compuestos

deseados o sus precursores.

Las Fermentaciones de Productos Industriales comprenden un buen número de procesos industriales que son utilizados para producir satisfactores para la salud y la alimentación.

Para aprovechar las fermentaciones se deben desarrollar tecnologías que permitan fabricar los productos en cantidades industriales, para satisfacer los

requerimientos.

cantidades industriales, para satisfacer los requerimientos.  Se debe buscar siempre bajo costo, para poder competir

Se debe buscar siempre bajo costo, para poder competir con los productos actuales.

CONCEPTO DE FERMENTACIÓN

Proceso realizado en un fermentador o biorreactor, mediante el cual

determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana en metabolitos y biomasa . La fermentación es un proceso de oxidación incompleto, siendo el producto final un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones .

El microorganismo aumenta su concentración y el medio se va modificando.

Formación de de nuevos productos como consecuencia

del metabolismo.

Resultado

Proceso de fermentación:

MICROORGANISMOS

Bacterias, levaduras , hongos

MEDIO DE CULTIVO

Bacterias, levaduras , hongos MEDIO DE CULTIVO CONDICIONES AMBIENTALES MICROORGANISMO CO2 PRODUCTO Intra o

CONDICIONES AMBIENTALES

MICROORGANISMO

CO2

Bacterias, levaduras , hongos MEDIO DE CULTIVO CONDICIONES AMBIENTALES MICROORGANISMO CO2 PRODUCTO Intra o extra celular

PRODUCTO Intra o extra celular

HISTORIA DE LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Es tan antigua como la manipulación de alimentos fermentados como el

vino y el pan.

DE LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL  Es tan antigua como la manipulación de alimentos fermentados como el
DE LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL  Es tan antigua como la manipulación de alimentos fermentados como el
 Ha sido clave en la producción de penicilinas: -naturales, como la Penicilina G, (esto
 Ha sido clave en la producción de penicilinas: -naturales, como la Penicilina G, (esto

Ha sido clave en la producción de penicilinas:

-naturales, como la Penicilina G, (esto es de forma totalmente microbiológica), -semisintéticas, como la meticilina (que requiere la purificación de un intermediario que luego ha de modificarse química o enzimáticamente)

la meticilina (que requiere la purificación de un intermediario que luego ha de modificarse química o
 Por último, el estudio del ADN recombinante y el enfoque de la Ingeniería Genética,
 Por último, el estudio del ADN recombinante y el enfoque de la Ingeniería Genética,

Por último, el estudio del ADN recombinante y el enfoque de la Ingeniería Genética, han permitido producir proteínas humanas mediante microorganismos transformados on genes humanos. Por ejemplo: la Insulina

recombinante

producir proteínas humanas mediante microorganismos transformados on genes humanos. Por ejemplo: la Insulina recombinante

IMPORTANCIA DE LA FERMENTACIÓN EN LA BIOTECNOLOGÍA

Procesos de fermentación en alimentos:

Naturales o espontáneas (fermentación del cacao,ensilado, pozol).

Inoculadas ( vino, yogurt, tempeh).

Procesos de fermentación en medios de cultivo:

Producción de biomasa (proteína unicelular, levadura de pan, levadura de cerveza).

Obtención de metabolitos primarios ( alcohol, ácidos orgánicos) y secundarios ( enzimas, polisacáridos).

 Obtención de metabolitos primarios ( alcohol, ácidos orgánicos) y secundarios ( enzimas, polisacáridos).

TIPOS DE FERMENTACIÓN DE VARIOS MICROORGANISMOS

Fermentación

Productos

Organismos

Alcohólica

Etanol + CO2

Levadura(Sccharomyces)

Ácido láctico

Ác. láctico

Bacterias del ácido láctico

Ácido mixto

Ác. láctico,acético,etanol, CO2, H2

Bacterias entéricas(Escherichia, salmonella)

butanediol

Butanediol, ác. láctico, acético, etanol, CO2, H2

Bacterias entéricas(Aerobacter, Serratia)

Ácido buritico

Ác. burítico, acético, CO2, H2

Clostridios(Clostridium butyricum)

Acetona- butanol

Acetona, butanol, etanol

Clostridios(Clostridium acetobutylicum)

Ácido propiónico

Ác. propiónico

Levadura(Sccharomyces)

Fermentación etílica:

Se transforman los azúcares de las uva en etanol, debido a la acción de las levaduras.

Fermentación láctica:

Se transforman los azúcares de las uva en etanol, debido a la acción de las levaduras.
Se transforman los azúcares de las uva en etanol, debido a la acción de las levaduras.

EJEMPLOS

DE

PRODUCTOS

OBTENIDOS

POR

FERMENTACIÓN

INDUSTRIAL

Producción de alimentos: Fermentación del vino

Fermentación del pan

Fermentación de la cerveza

Suplementos dietéticos: Cultivo de algas

de la cerveza  Suplementos dietéticos: Cultivo de algas Obtención de vitaminas o aminoácidos  Biopolímeros:

Obtención de vitaminas o aminoácidos

Biopolímeros: Xantano, Alginato, Celulosa, Ácido hialurónico, Polihidroxialcanatos

Biorremediación de entornos contaminados o Tratamientos de desechos

Principios activos medicinales: Insulina, Hormona de crecimiento

Reactivos diagnóstico e investigación: Taq polimerasas empledas en PCR

medicinales: Insulina, Hormona de crecimiento  Reactivos diagnóstico e investigación: Taq polimerasas empledas en PCR

A LA PAR DE LOS AVANCES, EMPEZARON LAS CONSIDERACIONES…

Los medios de producción deben incluir consideraciones económicas además de las microbiológicas.

Se produjeron cambios tecnológicos y DE LAS CUBAS CLÁSICAS DE FERMENTACIÓN construídas de materiales diversos se pasó a BIORREACTORES DE ACERO INOXIDABLE muy instrumentados.

a BIORREACTORES DE ACERO INOXIDABLE muy instrumentados. EN EL DESARROLLO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES… 
a BIORREACTORES DE ACERO INOXIDABLE muy instrumentados. EN EL DESARROLLO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES… 

EN EL DESARROLLO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES…

Conceptos de microbiología, química, bioquímica y tecnología,

constituyen las bases de la microbiología industrial actual.

las bases de la microbiología industrial actual.  En un proceso si el objetivo es un

En un proceso si el objetivo es un producto, este debería ser de alto rendimiento y fácil extracción del medio de cultivo.

SELECCIÓN DE CEPAS PARA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Al seleccionarse un microorganismo, se deben tener en cuenta cierto criterios como son:

La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos. Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de

medios de cultivo de costo reducido.

Debe ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo, sin pérdida de sus características particulares. Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.

Los microorganismos que se utilizan pueden ser obtenidos de aislamientos a partir de su fuente natural o a partir de una colección de cultivos.

EN GENERAL, EN LA INDUSTRIA CADA FIRMA POSEE SU PROPIA COLECCIÓN DE ORGANISMOS, EN MUCHOS CASOS MUCHOS DE LOS CUALES HAN SIDO MEJORADOS A TRAVÉS DE TÉCNICAS CLÁSICAS DE MUTACIÓN E INGENIERÍA GENÉTICA.

CASOS MUCHOS DE LOS CUALES HAN SIDO MEJORADOS A TRAVÉS DE TÉCNICAS CLÁSICAS DE MUTACIÓN E

CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Contener los elementos para la síntesis celular y para la formación de

producto

Medio ambiente favorable para el crecimiento y/o formación del

producto. Económicamente rentable. Máxima producción.

Adaptación constante al proceso de fermentación.

CRITERIOS UTILIZADOS EN LA FORMULACIÓN DEL MEDIO

Recuperación del producto.

Eliminación de la represión catabólica.

Materiales de fácil disposición en cantidad suficiente. Bajos costes de transporte. Impedir que las impurezas dificulten la recuperación de producto.

EL MEDIO INFLUYE EN:

En el crecimiento celular. En el procesado posterior. En la fisiología y morfología de los microorganismos.

En el crecimiento celular.  En el procesado posterior.  En la fisiología y morfología de

INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL CRECIMIENTO

CELULAR.

Los microorganismos necesitan:

Carbono Nitrógeno Minerales Factores de

crecimiento

Agua

Oxígeno(aerobios)

Microorganismos
Microorganismos

Biomasa Biosíntesis y

mantenimiento celular

Condiciones medioambientales:

pH, Temperatura

Microorganismos Biomasa Biosíntesis y mantenimiento celular Condiciones medioambientales: pH, Temperatura

INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL PROCESADO

POSTERIOR:

Subproductos, proceso de recuperación más caro y complejo. (Procesos de purificación de productos y

tratamiento de desechos). Necesidad de adicionar antiespumantes,

problemas en el procesado de productos asociados con

el crecimiento microiano

 Necesidad de adicionar antiespumantes, problemas en el procesado de productos asociados con el crecimiento microiano

INFLUENCIA DEL MEDIO EN LA FISIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS

Las condiciones relacionadas con el medio que han demostrado tener influencia en la morfología

Cationes pH Viscosidad divalentes Agentes Polímeros Morfología quelantes anióticos Presencia de sólidos
Cationes
pH
Viscosidad
divalentes
Agentes
Polímeros
Morfología
quelantes
anióticos
Presencia de
sólidos
Agentes
tensoactivos

Por ej. PH: Las hifas del P. Chrysogenum se

vuelven más cortas y gruesas a medida que el

pH es más alcalino, forman gránulos.

PH : Las hifas del P. Chrysogenum se vuelven más cortas y gruesas a medida que

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS. COMPONENTES DE UN MEDIO DE CULTIVO.

La preparación de los medios de cultivos es fundamental para asegurar la productividad.

La nutrición microbiana consiste en aportar a las células los ingredientes químicos que necesitan para la síntesis de monómeros, que son los componentes de las macromoléculas, que a su vez construyen las estructuras celulares.

de monómeros, que son los componentes de las macromoléculas, que a su vez construyen las estructuras

Monómeros

Macromoléculas

Estructuras

celulares

Monosacáridos

Polisacáridos

Pared celular Glicocàlix

Aminoácidos

Proteínas

Membrana

Ribosomas Flagelo Pelos y fimbrias Enzimas

Ácidos grasos

Lípidos

Membranas

Bases nitrogenadas

Ácidos nucleicos

Cromosoma

Ribosomas

Plásmidos

Plásmidos

DISEÑO

EL DISEÑO DE UN MEDIO DE FERMENTACIÓN TIENE COMO

FINALIDAD SELECCIONAR LOS COMPONENTES DE LOS MEDIOS PARA ASEGURARNOS EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS Y LA FORMACIÓN DE LOS PRODUCTOS CORRESPONDIENTES AL PROCESO A DESARROLLAR

Y LA FORMACIÓN DE LOS PRODUCTOS CORRESPONDIENTES AL PROCESO A DESARROLLAR CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Y LA FORMACIÓN DE LOS PRODUCTOS CORRESPONDIENTES AL PROCESO A DESARROLLAR CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE
El medio de cultivo químicamente definido se prepara añadiendo cantidades precisas de compuestos orgánicos e
El medio de cultivo químicamente definido se prepara añadiendo
cantidades precisas de compuestos orgánicos e inorgánicos puros a un
volumen conocido de agua destilada.
Se conoce su composición exacta.
Medio definido para Escherichia coli
K 2 HPO 4
KH 2 PO 4
(NH4) 2 SO 4
MgSO 4
CaCl 2
Glucosa
Elementos traza
(Fe, Co, Mn, Zn,
Cu, Ni, Mo)
Agua destilada
7 g
2 g
1 g
0,1 g
0,02 g
4-10 g
2-10 g
1000 ml
pH7

Para elaborar el medio complejo se utilizan hidrolizados de proteínas y otras sustancias muy nutritivas pero no definidas químicamente que se pesan y se añaden a un volumen conocido de agua.

No se conoce la composición exacta del medio complejo.

Medio complejo

para Escherichia coli y Leuconostoc mesenteroides

Glucosa

Extracto de levadura 5 g

Peptona

15 g

5 g

KH 2 PO 4

2 g

Agua destilada

1000 ml

pH7

Glucosa Extracto de levadura 5 g Peptona 15 g 5 g KH 2 PO 4 2

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

Estará determinado por el metabolismo celular

Fuente de C:

Autotróficos (algas, algunas bacterias) necesitan CO2 Heterotróficos necesitan compuestos orgánicos

Requerimientos de O2:

Aerobios

Anaerobios

orgánicos  Requerimientos de O2: Aerobios Anaerobios Algunas bacterias en vez de O2 emplean NO3 o

Algunas bacterias en vez de O2 emplean NO3 o SO4 como aceptores finales de electrones.

Fuente de E:

Las bacterias metanogénicas requieren H2, para reducir CO2 a CH4 y obtener

E (auxótrofos anaerobios).

Algunos anaerobios obtienen su E por reacciones de óxido-reducción de compuestos orgánicos. Las fuentes de C, son muchas veces importante fuentes de E.

por reacciones de óxido-reducción de compuestos orgánicos. Las fuentes de C, son muchas veces importante fuentes

Fuentes de nitrógeno:

-Inorgánica u Orgánica

-Se emplea para síntesis de proteínas, ácidos nucleicos, polímeros de la pared

celular

Macronutrientes:

- P y S en forma de PO4 y SO4

-PO4 para formar ADN, ARN y polímeros celulares

-SO4 para sínteis de aminoácidos azufrados, biotina, coenzima A, tiamina

-K y Mg, ligados al RNA. Mayor velocidad de crecimiento, aumento de RNA, mayor requerimiento de K

- K actúa como coenzima y Mg es estabilizador de organelas (ribosomas) y es

cofactor.

Micronutrientes:

- Esenciales: Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn.

- Poco esenciales: Na, Al, Si, Cl, Cr, Ni, Se, Mo

-Difíciles de cuantificar porque generalmente están presentes como impurezas de otros componentes principales.

- Sus requerimientos aumentan cuando el cultivo se somete a “stress”.

impurezas de otros componentes principales. - Sus requerimientos aumentan cuando el cultivo se somete a “stress”.

Factores de crecimiento:

-Aminoácidos, tiamina, riboflavina, niacina; la mayoría son constituyentes de coenzimas.

Requerimientos específicos según el proceso:

-Por ej. Ác. Fenilacético para la Penicilina

-Por ej. Sulfato que favorece la producción de glicerol en la fermentación alcohólica

-Un proceso caracterizado por descenso de pH, obliga a agregar al medio un agente buffer, como mezcla de fosfatos o carbonato de calcio, o mediante el agregado de una solución alcalina.

-En un proceso de producción de ácido cítrico el hierro en exceso influye

negativamente. Por lo cual se diseña un medio con ausencia total de hierro y se va agregando hierro de manera controlada.

negativamente. Por lo cual se diseña un medio con ausencia total de hierro y se va

OTROS CRITERIOS A TENER EN CUENTA EN LA FORMULACIÓN DE

LOS MEDIOS

CATIONES DIVALENTES: inducen el crecimiento en forma de gránulos, sus efectos pueden contrarrestarse con AGENTES QUELANTES.

La presencia de cationes influye en la floculación de las levaduras (importante en su sedimentación y eliminación en la producción de bebidas alcohólicas no destiladas).

El manganeso afecta a la composición celular de la pared celular de A. Niger.

AGENTES TENSOACTIVOS: Algunos aumentan la velocidad de secrección de los enzimas microbianos extracelular.

NITRÓGENO:

niveles bajos inducen la formación de esporas.

AMINOÁCIDOS: niveles elevados inhiben la formación de esporas.

niveles bajos inducen la formación de esporas.  AMINOÁCIDOS: niveles elevados inhiben la formación de esporas.

MACRONUTRIENTES

MACRONUTRIENTES
MICRONUTRIENTES FACTORES DE CRECIMIENTO

MICRONUTRIENTES

MICRONUTRIENTES FACTORES DE CRECIMIENTO

FACTORES DE CRECIMIENTO

MICRONUTRIENTES FACTORES DE CRECIMIENTO

DISPONIBILIDAD DE LOS COMPONENTES

- Componentes susceptibles de ser usados por la célula.

- Concentración de iones metálicos modificada por quelación por componentes del

medio o productos de la fermentación, para controlar la concentración y

precipitación de los iones se emplean agentes quelantes, como el EDTA.

SE DEBE TENER EN CUENTA LA NATURALEZA DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS QUE PUEDEN ACTUAR COMO LIGANDOS Y SOBRE TODO

DEL ION METÁLICO CONSIDERADO, YA QUE ES NECESARIO

CONTROLAR SU CONCENTRACIÓN LIBRE.

Cte de Equilibrio para la formación del complejo ión metálico-ligando
Cte de Equilibrio para la formación del complejo ión metálico-ligando

Cte de Equilibrio para la formación del complejo ión metálico-ligando

ES NECESARIO CONTROLAR SU CONCENTRACIÓN LIBRE. Cte de Equilibrio para la formación del complejo ión metálico-ligando

MATERIAS PRIMAS

Se debe considerar costos, disponibilidad, estabilidad en su composición

química y problemas de impurezas.

Las materias primas fundamentales son las fuentes de C y N.

Los compuestos petroquímicos ( hidrocarburos, alcoholes y

ácidos). Se empleaban cuando el petróleo era barato, no mucha

extensión.

En la actualidad: materias primas renovables que contienen azúcar y almidón y menos grasas y aceites.

Futuro: los productos de la hidrólisis de la lignocelulosa las

materias primas más importantes en los procesos de la

fermentación.( La lignocelulora representa el 50% de la

producción anual mundial de biomasa).

en los procesos de la fermentación.( La lignocelulora representa el 50% de la producción anual mundial

LAS FUENTES DE CARBONO PUEDEN SER:

Hidratos de C como gllucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina.

Alcoholes como el glicerol y manitol

Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros

HIDRATOS DE CARBONO EMPLEADOS COMO FTE DE C EN LOS PROCESOS DE FERMENTACIÓN

ALMIDÓN: es el más importante actualmente .

En forma de granos o raices, enteros o molidos, de plantas como el maíz, arroz, trigo , patatas y mandioca;

como almidón purificado, modificado o como dextrinas

CELULOSA:

Presente en la madera combinado con la hemicelulosa y la lignina en forma de lignocelulosa La lignina hace a la celulosa resistente al ataque microbiano . No son rentables los métodos químicos y enzimáticos que convierten la lignocelulosa en azúcares fermentables. (Para obtener champiñones y

substrato para producir enzimas celulolíticas)

SACAROSA:

En forma cristalina o en forma bruta como zumos o melazas (es el subproducto de la manufactura de azúcares más barato, varía su composición , causando problemas en la reproductibilidad de la fermentación)

LACTOSA:

En el suero de la leche (4% al 5%) Baja concentración, caro su transporte. Solo se utiliza en lugares próximos a la factoría de quesos proveedora.

GLUCOSA:

Se obtiene a partir de la conversión enzimática directa del almidón. Glucosa refinada, en forma de jarabe o cristalina para productos de mayor valor.

forma de jarabe o cristalina para productos de mayor valor. ACEITES VEGETALES ( de soja, palma

ACEITES VEGETALES ( de soja, palma y semillas de algodón como complemento delos carbohidratos), METANOL, ETANOL

FUENTE DE NITRÓGENO

DE NATURALEZA INORGÁNICA:

Amoniaco, nitratos, urea, y el nitrógeno presente en los cereales y raíces y sus subproductos. Aminoácidos purificados, empleados como precursores.

DE NATURALEZA ORGÁNICA:

Hidrolizados de Proteínas (Peptonas): Obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas fuentes proteicas, como carne, pescado, caseína, gelatina, harina de soja, algodón y girasol. Además de su función como fuente nitrogenada, las peptonas aportan vitaminas, sales inorgánicas como fosfatos y micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu.

Extracto de carne: Se obtiene por extracción acuosa y concentración

posterior.

Extracto de Levadura: Se obtiene por autólisis o plasmólisis de levadura, es una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos.

Extracto de malta: Es el extracto soluble en agua de la malta de la cebada

Es el extracto soluble en agua de la malta de la cebada  Cornsteep: Agua de

Cornsteep: Agua de maceración del maíz, es muy importante en la producción de varios antibióticos y enzimas.

SUSTRATOS COMPLEJOS Son una fuente barata de carbono, nitrógeno y otros nutrientes.

Presentes en plantas enteras y subproductos vegetales, animales y

microbianos.

FORMULACIÓN

Se refiere a los aspectos cuantitativos de los medios.

Se debe tener una aproximación a la composición de la biomasa del microorganismo. Una composición elemental en peso seco es:

-Carbono:

-Nitrógeno:

46 48%

7-12

-Fósforo:

1 3

-Azufre:

0.5 1

-Mg:

0.5 1

- Nitrógeno: 46 – 48% 7-12 - Fósforo: 1 – 3 - Azufre: 0.5 – 1

COMPONENTE

ELEMENTO/FUNCION

MASA. gr

Glucosa

C, energía

22.7

NH4Cl

N

4.37

KH2PO4

P + K

1.13

MgSO4.7H2O

S + Mg

0.232

CaCl2.2H2O

Ca

0.011

FeSO4.7H2O

Fe

0.007

MnS.4H2O

Mn

0.002

ZnSO4.7H2O

Zn

0.002

CuSO4.5H2O

Cu

0.0004

CoCl2.6H2O

Co

0.0004

EDTA

Quelante

0.394

Agua destilada

 

1 ml

Agua destilada   1 ml

Composición de medio mínimo para Klebsiella aerogens

SUSTRATOS COMPLEJOS UTILIZADOS EN LOS MEDIOS DE FERMENTACIÓN MICROBIANA.

FUENTE INGREDIENTES PROT. CARBOH. GRASA FIBRA CENIZA
FUENTE
INGREDIENTES
PROT.
CARBOH.
GRASA
FIBRA
CENIZA

Cereales enteros

Cebada

11,5

68,0

1,8

7,0

2,5

Cebada malteada

13,0

70,0

2,0

3,5

2,5

Maiz

9,9

69,2

4,4

2,3

1,3

Avena

12,0

54,0

4,5

12,0

4,0

Arroz

13,0

65,0

2,0

10,0

4,5

Trigo

8,2

69,0

1,9

2,6

1,8

Subp. deriv.animales

Sangre

80,0

2,5

1,0

1,0

3,0

Harina de pescado

72,0

7,5

1,0

Harina de hueso

50,0

0,0

8,0

3,3

31,0
31,0

Subp deriv microorganismos

Hidrolizado de levaduras

52,5

0,0

1,5

10,0

CONTROL DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN: VARIABLES

1.-PH

2.-ESPUMA

3.-OXÍGENO

4.-TEMPERATURA

5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DE PRODUCTO.

1.-PH:

Control necesario para el desarrollo celular y formación de producto.

Control de forma indirecta o de forma directa:

Directamente (Añadiendo agentes tamponantes):

Fosfato inorgánico Ácidos orgánicos Carbonato cálcico

Hidroxisales, amoniaco, ácidos sulfúrico y clorhídrico.

Indirectamente ( mediante un balance equitativo entre las fuentes de carbohidrato y nitrógeno). Los carbohidratos bajan el pH (formación de ácidos orgánicos). La asimilación del nitrato produce alcalinidad. DESVENTAJAS: Efectos represivos sobre la formación del producto.

pH

entre 6.0 y 7.5.

pH bajos. frente a la producción de ácidos.

Efectos represivos sobre la formación del producto. pH entre 6.0 y 7.5. pH bajos. frente a

2.- ESPUMA:

ORIGEN:

Desnaturalización de las proteínas en la interfase gas- líquido.

PROBLEMAS:

Asciende hasta ocupar totalmente la cabeza del fermentador por lo cual hay que evacuar parte del contenido del aparato por

la salida del aire.

SOLUCIÓN:

Antiespumantes ( agentes tensoactivos que reducen la tensión superficial de las espumas hasta dispersarlas ).

Rompedores mecánicos.

de las espumas hasta dispersarlas ). Rompedores mecánicos. ANTIESPUMANTES:  Eficacia (Depende de las condiciones

ANTIESPUMANTES:

Eficacia (Depende de las condiciones de fermentación):

Composición del medio, cepas microbianas, etapa de crecimiento, configuración de las vías de aireación y del fermentador.

Selección y cantidad del

antiespumante:

Procedimientos de ensayo y error.

Uso de soportes(aceites orgánicos y minerales)

Cantidad de antiespumante mínima ( afecta a la velocidad de transferencia de oxígeno hasta u 50%)

No deben ser tóxicos ni peligrosos, esterilizables por el calor y baratos.

3.- OXÍGENO

Requerimientos en procesos aerobios. Influencia sobre los procesos metabólicos. Velocidad de absorción específica de oxígeno oxígeno disuelto Antioxidantes como protección del producto.

disuelto  Antioxidantes como protección del producto. 4.-TEMPERATURA concentración de  Temperatura óptima

4.-TEMPERATURA

concentración de

Temperatura óptima para la producción celular o de metabolitos. Uso de termostatos

concentración de  Temperatura óptima para la producción celular o de metabolitos.  Uso de termostatos

5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL PRODUCTO

PERCUSORES

INDUCTORES

incorporarse al medio el inductor específico

mediante adiciones continuas o discontinuas

INHIBIDORES

minimizar la formación de otros intermedios metabólicos.

Prevenir el metabolismo posterior al producto deseado

Ejemplos:

Fuente de N utilizable rápidamente inhibe la producción de algunos antibióticos.

El ácido fenilacético es el ppal percusor en la producción de

bencilpenicilina por fermentación.

antibióticos.  El ácido fenilacético es el ppal percusor en la producción de bencilpenicilina por fermentación.

MANTENIMIENTO DE LOS MEDIOS

El medio de almacenamiento y subcultivo de cepas industriales clave debe ser diseñado para que las cepas:

Conserven las características necesarias que permitan la capacidad de producción particular. Minimicen la variación genética.

¿ POR QUÉ UTILIZAR MEDIOS DE MANTENIMIENTO?

CEPAS
CEPAS

METABOLITOS

TÓXICOS

genética .  ¿ POR QUÉ UTILIZAR MEDIOS DE MANTENIMIENTO? CEPAS METABOLITOS TÓXICOS EFECTOS DESESTABILIZANTES
EFECTOS DESESTABILIZANTES
EFECTOS
DESESTABILIZANTES

ESTERILIZACIÓN DE CULTIVOS

OBJETIVOS:

Evitar el desarrollo de microorganismos patógenos.

Evitar el desarrollo de microorganismos alterantes.

Incrementar la reproducibilidad del proceso (rendimiento, pureza y tiempo de producción).

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN:

Calor húmedo (autoclave o chorro de vapor).

Calor seco

Radiación ( Rayos X ,UV)

Esterilización química con líquidos o gases.

Filtración (filtros de superficie o de profundidad).

Nuevos métodos ( altas presiones, campos eléctricos)

 Filtración (filtros de superficie o de profundidad).  Nuevos métodos ( altas presiones, campos eléctricos

¿DONDE SE CONTROLA LA ESTERILIDAD?

Mantener la pureza del inóculo.

Esterilizar el medio de cultivo y los aditivos.

Esterilizar el material en contacto con el medio

(recipiente, fermentador, válvulas y conductos)

Esterilizar los gases entrantes y salientes.

Manterner las condiciones asépticas durante la manipulación.

Construcción apropiada del biorreactor para su esterilización y para la prevención durante la fermentación.

 Construcción apropiada del biorreactor para su esterilización y para la prevención durante la fermentación.

Para una buena rentabilidad, en virtualmente todos los

procesos, será necesario que en todas las etapas estén libres de

contaminantes.

También depende, no obstante, del campo en que nos estemos moviendo. En el campo medio ambiental, hablar de esterilización

no tiene mucho sentido, mientras que en el campo alimentario

será esencial. Generalmente, la necesidad de un proceso de esterilidad está en relación con el valor añadido del producto.

La probabilidad de que exista contaminación a lo largo del

proceso depende de las características del mismo. La probabilidad

de que exista contaminación en un cultivo mesófilo es mayor que en un cultivo termófilo. También será más probable que exista contaminación en un medio con pH aproximado a 7, más que a pH

ácido. La probabilidad de que haya contaminación será mayor en

los que consuman mucho oxígeno, que en los que consuman menos. Llegado a este punto hemos de plantear la optimización del

proceso a nivel de producción, sino a nivel de seguridad. Si se

puede ajustar el pH hacia abajo, mejor, que será más seguro.

a nivel de producción, sino a nivel de seguridad. Si se puede ajustar el pH hacia

Durante la fermentación hemos de observar diferentes puntos para

garantizar la esterilidad:

- Esterilidad del medio de cultivo: el medio nutritivo que se prepara

inicialmente contendrá un elevado número de células vegetativas y otras derivadas ingredientes del medio. Todos estos microorganismos han de ser

eliminados por el proceso adecuado antes de la inoculación. Existen

diferentes métodos, pero normalmente se usa el calor, y raramente otros.

- Pureza del inóculo: el inóculo representa entre el 2 y el 5% del volumen total del biorreactor, si el cultivo no es puro habrá contaminaciones.

- Esterilización del aire que fluye: La mayor parte de fermentaciones se

dan en condiciones de agitación vigorosa. El aire que entra ha de ser estéril.

El aire puede contener entre 10-10 5 partículas/m 3 de los cuales entre 5 y 2000 serán microorganismos, principalmente esporas de hongos, bacterias Gram negativas y fagos en suspensión. La esterilización del aire que entra es esencial.

La esterilización del aire que entra es esencial. Construcción apropiada del biorreactor, para que la

Construcción apropiada del biorreactor, para que la esterilización entre

-

fermentación y fermentación pueda servir para prevenir la contaminación.

Cuál será el método usado para la esterilización? Mediante el uso de un agente biocida que inactive los

microorganismos. Los agentes biocidas tienen diferentes dianas.

Los usados en biotecnología se clasifican en:

- Agentes químicos: existe un elevado número de

desinfectantes químicos líquidos y gaseosos. Pueden ser

sustancias oxidantes como O

usan poco, porque son difíciles de eliminar y por lo tanto se corre

el riesgo de inhibir el crecimiento de los microorganismos después, en la fermentación.

- Agentes físicos: son los más habituales.

- Radiaciones ionizantes: Rayos X, UV, o γ. Aunque

ocasionalmente se usan en industria alimentaria, no se usan de manera habitual en fermentaciones industriales por el riesgo que suponen para el manipulador.

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, óxido de etileno,

En la práctica se

-

- Calor: es el método más empleado, sobre todo para el medio

y para las instalaciones. Usualmente se usa vapor de agua para

esterilizar mejor.

- Métodos mecánicos: Filtración, Centrifugación,

La filtración

es la única que se usa en la práctica. Es útil para la esterilización de medios con partes sensibles a calor y para esterilizar el aire.

usa en la práctica. Es útil para la esterilización de medios con partes sensibles a calor

Talycomoyahemos dicho, elcalor es elmétodo más empleado. Los agentes biocidas suelen tener cinéticas de primer orden. Se ha de tener siempre en cuentaelfactor CT, siendo c laconcentración o intensidad del agente biocida y t eltiempo de tratamiento. Es necesariorecordar esto, puesto que se puede

conseguir elmismo efecto esterilizando 2 horas a 90º Co 4 horas a 45º C.

En la microbiología industrial, cuando se habla de esterilización, no se considera la esterilidad absoluta, como en el laboratorio, sino que se trata de esterilidad comercia. En muchos productos podemos encontrar microorganismos, pero dado que no tienen efectosanitario,noresulta rentable eliminarlos. El calor destruye vitaminas ydesnaturaliza proteínas, de aquíla importancia del concepto CT. A partir deeste conceptosurgióla idea de UHT. Se alcanza la misma eficiencia de inactivación de microorganismos, pero elefecto que tiene sobre las proteínas yvitaminas es mucho menor. Autoclave 120º C 10 – 15’ UHT 140º C Segundos Comoya hemos dicho, el propio biorreactor se esteriliza mediante vaporde agua, pero los medios no se pueden esterilizar así,porque elvapor de agua condensaría, de manera que aumentaríaelvolumen. Además, resultaría muycaro calentar talvolumen de agua, y el tiempo aumentaría, porque se tendría que esperar a que se enfriase. Existen diferentes métodos para esterilizar el medio, aparte de la filtración. Uno de ellos es el que se conoce comoesterilización en continuo. Consiste en ir cargando el biorreactor poco a poco con el medio, que se esteriliza por UHT. El medio va pasando porplanchas de acero a 140º C. El tiempo que pase por laplancha será similar alde UHT. Elproblema es que elmedio que salga de aquí estará demasiado caliente, por loque tendré que enfriarlo, yaque loquiero a unos 30º C.La solución es un sistema que hace que pase cerca del medio fresco, aún no esterilizado, de manera que antes de la esterilización a 140º, el medio ya está caliente. Si funciona bien se recupera el 80 90 % de la energía. Otro problema al que nos enfrentamos es el aire, que es necesario esterilizar, que se suele hacer mediante filtración. Podemos distinguir entre los filtros de adsorción, filtros en profundidad. En este caso, todo el volumen del filtro tiene capacidad de filtrado. Está diseñado en forma de ovilloo bobina, de manera que tarde o temprano, cualquier partícula en suspensión choque y quede retenida. Los filtros por retención tienen eltamaño de poro más pequeño, puesto que las partículas quedarán retenidas.

Los filtros por retención tienen eltamaño de poro más pequeño, puesto que las partículas quedarán retenidas.
 

ESTERILIZACIÓN DISCONTINUA

ESTERILIZACIÓN CONTINUA

T

121ºC

20-30 segundos a 90-120 ºC

Tiempos de esterilización mayores(2-3h)

30-120 segundos a 140ºC

20-30 segundos refrigeración

Calentamiento por inyección de vapor

Calentamiento por inyección de vapor

o

intercambiadores de calor

o intercambiadores de calor

Alto consumo de energía.

Formación de sales insolubles

Alteración y destrucción de nutrientes.

Tamaño de la partícula restringida a 1-2 mm

de sales insolubles Alteración y destrucción de nutrientes. Tamaño de la partícula restringida a 1-2 mm