Puesta al día en D. Prenatal.

Aplicación Clínica de nuevas

técnicas diagnosticas en Genética

Dr. José A. Sainz

U.M.Fetal. H.U.Valme
U.M.Fetal. Diagnóstico Prenatal y Ginecología. H. Viamed
 OBJETIVOS

Donde estamos en Diagnóstico Prenatal ?

A que nos ayudan las nuevas técnicas de Genética ?

 DEFECTO CONGENITO (OMS)
“Toda anomalía del desarrollo morfológico, estructural, funcional o
molecular, presente al nacer (aunque pueda manifestarse más
tarde), externa o interna, familiar o esporádica, hereditaria o no,
única o múltiple”

2-4% 7%
Primera causa de mortalidad-morbilidad infantil: 20% en 1º año
 DIAGNÓSTICO PRENATAL
Cualquier actuación encaminada a la identificación
de los DC se denomina Diagnóstico Prenatal

ICBDSR EUROCAT ECEMC

EUROCAT
Creado 1.979
1,7 mill. nacimientos anuales
43 miembros (23 países)
358.396 casos de anomalías congénitas desde 1.980 a 2.010
95 defectos ---- +/- cromosomopatía
 cardíacas 71,33/10.000 gest.
 cromosomopatías 31,96/10.000 gest. (18,77/10.000 SD)
Tipo de D C Incidencia por Incidencia por D C %
nacimiento en %
Anomalías Cromosómicas 0.6 12
Enfermedades hereditarias 1.4 28
monogénicas
Malformaciones 3 60
Total 5 100
 DIAGNÓSTICO PRENATAL
80-85 (datos base) 86-2001 2002

2,22% 1,55% 1,1%

ECEMC 2004

Cribado de Malformaciones Eco morfológica

Cribado de Cromosomopatías

MALFORMACIÓN
MAYOR
 D. PRENATAL DE MALFORMACIONES ESTRUCTURALES
nº Tasa de Diagn antes
Diagnóstico de las 24 s

Radius (1987-91) 15151 11-35% 17%

Eurofetus (1990-93) 170800 56.2% 55%

Eurofetus 98

Malf. SNC 88.5%

Sist. Génito-urinario 88.1%
Sist. Respiratorio 66.7%
Sist. Digestivo 55.5%
Sist. Esquelético 38.1%
Mayores es del 66% Sist. Cardiovascular 28.9%
Menores es del 40.7% Alts. Faciales 18.7%
• Cribado Universal y de Garantía

• Adecuado ecográfo, tiempo y FORMACIÓN

 D. PRENATAL DE MALFORMACIONES ESTRUCTURALES

Autores Periodo n Edad Prevalencia Sensibilidad

gestacional (%) (%)
(sem.)

Chitty et al., 1991 1988-89 8745 18-20 1.5 71.5

Levi et al., 1991 1984-89 15654 16-20 2.3 21
Shirley et al., 1992 1989-90 6512 19 1.4 57.3
Luck, 1992 1988-91 8844 19 1.9 85.3
Crane et al., 1994 1987-91 7575 15-22 2.30 16.6
Carrera et al., 1995 1970-91 33192 18-22 3.03 78.33
Levi et al., 1995 1990-92 9601 16-20 2.45 25.6
Skupski et al., 1996 1990-94 860 18-20 1.16 15.0
Magriples et al., 1998 1997-98 911 16-20 3.07 71.4
Lee et al., 1998 1990-94 3004 18-20 0.76 13.5
Van Dorsten et al., 1998 1993-96 1611 15-22 1.30 47.6
Boyd et al., 1998 1991-96 33376 18-22 2.17 41.1
Instituto Dexeus, 2002 1970-02 62592 18-22 2.9 87.2
 H.U. EUROFE Chitty Salvador
RADIUS Levi et al.
VALME TUS et al. et al.
Nº fetos 12746 7685 200000 16353 8432 99753
Tasa de
diagnóstico 80,75% 35% 61,4% 40% 71% 56%
prenatal
Tasa de
diagnóstico
77,12% 17% 44% 21% 71% 36%
antes de la
semana 24

Diagnóstico ecográfico de 95% de Malf Mayores

Diagnóstico ecográfico de 68,15% de Malf Menores
Prevalencia
- Aportación al ecográficos
de los marcadores nacimiento de nivel
de segundo Malf Mayores
al Cribado : 0,34%
Combinado de Primer Trimestre-
 SINDROME DE DOWN (10.000 nacimiento)

1980-1985 1986-2004 2002 2005

Andalucía 15,37 13,61 15,25 5,30

Media Nacional 14,78 10,95 8,20 7,40

?
Modelos de Cribado ?
• Cribado por Edad (37 años)
• Cribado Bioquímico del 2 T
• Cribado con TN
• Cribado con Test Combinado

Control del Cribado ?

 SENSIBILIDAD
METODOLOGÍA CRIBADO
(TFP 5%)
CRIBADO POR EDAD
Amniocentesis >35 a 30%
(70’S)
CRIBADO BIOQUÍMICO 2ºT Marcadores bioquímicos en suero
(DATN) materno
DOBLE TEST AFP+hCG 55-60%
TRIPLE TEST AFP+hCG+uE3 60-65%

CUADRUPLE TEST AFP+hCG+uE3+inhA 70-75%

SONOGRAMA GENÉTICO
AE+MB 65-75%*
(90’S)
CRIBADO BIOQUÍMICO 1erT βhCG+PAPP-A 65%
TRASLUCENCIA NUCAL (TN) Medición TN 75%
TEST COMBINADO βhCG+PAPP-A +TN 80%

Gold Estándar: Precoz, Sensible (SURUSS, FASTER)

 SINDROME DE DOWN (10.000 nacimiento)

1980-1985 1986-2004 2002 2005

Andalucía 15,37 13,61 15,25 5,30

Media Nacional 14,78 10,95 8,20 7,40

Cobertura del 95.4% de la población
Sen 81.3% F+ 4.4%

Universal
Análisis Cromosómico: “Gold Standard” en prenatal

Cariotipo Bandas-G

Tamaño 5MB
Error del 0.01-0.02%
 Avances en Genética

1970
Técnica de Banda
1986
FISH

2002 2011/12
Arrays cfDNA
Incorporación de genética molecular : Detección Rápida
FISH

Sonda gen Sonda Sonda Pintado

específica centromérica teloméricacromosómico

Di George
Incorporación de genética molecular : Detección Rápida

QF-PCR
Fácil, Rápido pero Caro equipos y Personal Entrenado
Incorporación de genética molecular : Detección Rápida

MLPA (Múltiple Ligadura-Dependiente de la sonda de Ampliación)

Unión de Sonda a gen y ampliación por PCR
Trastorno cromosómico, Delecciones, Duplicaciones,
Amplificaciones, Reordenamiento
Arrays
Arrays: Técnica molecular que permite diagnosticar cambios
en la cantidad de ADN
de expresión, de metilación, de dosis (a-CGH)

Prenatal: Array-CGH “Hibridación genómica comparativa”

Array-CGH Oligonucleótidos // BAC

SNP-array “Polimorfismos de nucleótido único”
Combinación
Oligonucleotidos
BACs-on-Beads Principales aneuploidias

• Medio líquido Chr 21 (5 sondas)

• ADN procedente de bacterias Chr 13 (5 sondas)
Chr 18 (5 sondas)
o BAC fijado en microesferas
Chr X (5 sondas)
• En < 24 horas Chr Y (5 sondas)

• Precio más bajo que arrays

Síndromes de microdeleción

DiGeorge 1 (4 sondas)
DiGeorge 2 (4 sondas)
Williams-Beuren (5 sondas)
Prader-Willi /Angelman (7 sondas)
Smith-Magenis (4 sondas)
Wolf-Hirschhorn (5 sondas)
Cri du Chat (8 sondas)
Langer-Giedion (7 sondas)
Miller-Dieker (6 sondas)
SNP-Array “Polimorfismos de nucleótido único”
90% de variaciones del genoma
1 cada 1.300 Pb

Variante de A-oligonucleótidos donde se incluyen SNP

Identifica deleciones-duplicaciones y además disomías
uniparenterales y perdida de heterocigosidad
Arrays según tamaño de la sonda:

Dirigidos o “Targeted”
De Genoma Completo “Whole genome array”
Array ¿ Que detecta?
Todas las anomalías cromosómicas diagnosticadas por
cariotipo convencional donde sobran o faltan cromosomas
o segmentos de este
En teoría una resolución x 100 al caritipo

Pero esas deleciones o duplicaciones (CNV “variación en

el número de copias”) aparecen el 12% del ADN de un
individuo sano
 Arrays. Recomendaciones de Sociedades Científicas

Post natal A C Medical Genetics 2010:

Discapacidad intelectual inexplicable
Autismo
AC múltiples no explicable
Array ¿ Porqué?
En teoría una resolución x 100 al caritipo
De 3-10 millones PB a 50.000 PB

Cualquier muestra de DP y tejido de feto + aunque superior

la cantidad de ADN y calidad

Resultado en 48-72 h y se automatiza

Array Limitaciones
No detecta reordenamientos estructurales equilibrados
(aunque los reordenamientos de novo es de 0.05%)

Poca capacidad para diagnosticar Poliploidias

(SNP-arrays si). Se detectan por ecografía.
Array Limitaciones

Mosaicismo solo diagnostica >20-30% (SNP-arrays <10%)

Caros

CNV de significado incierto en el 1-3%

 Tipos de Array

Array-CGH más sensible (0.1-10MB)

Array-SNP 1.5KB pero menos CNV,
Ploidias
Disomías parenterales
Mosaicismos (?)
 Arrays versus cariotipo convencional en prenatal

Alt Totales 7.5-9% Δ 2.5-3.5%

Δ 5.2-12% ME
CNV 1-3%
Emanuel 2007, Ahn 2010 , Wapner 2012
Arrays versus cariotipo convencional Muerte Perinatal

arrays Bandas-G
Total 8.3% 5.8% Δ 42%
Anteparto 8.8% 6.5% Δ 35%
Con ME 30% 19% Δ 54%

Éxito de Resultados 87% versus 70%

Reddy 2012
Arrays con alteración ecográfica y cariotipo normal
Shaffer 2012 (945 casos)
Arrays con alteración ecográfica y cariotipo normal
Shaffer 2012 (2858 casos)

1 ME 5.6%
2o+ 9.5%
CIR aislado 2.6%

Holoprosencefalia 10.6%
Fosa Posterior 14.6%
A Esquelética 10.7%
CIV 10.6%
Hvi 16.2%

Llep/PH 10.3%
 Arrays. Recomendaciones de Sociedades Científicas

Post natal ACMedicalGenetics 2010:

Discapacidad intelectual inexplicable
Autismo
AC múltiples no explicable

Prenatal ACOG 2009 indica Bandas-G primera línea

pero abre la posibilidad en:
ME y cariotipo normal
Muerte fetal con AC e incapacidad Banda-G
TN aumentada Cardiopatia SNC MEsq
CIR Marcadores Ecograficas

Unidad de Medicina Fetal

 Diagnóstico ecográfico de 95% de Malf Mayores
Diagnóstico ecográfico de 68,15% de Malf Menores

Ya no nos vale
Tipo de D C Incidencia por Incidencia por D C %
nacimiento en %
Anomalías Cromosómicas 0.6 12
Enfermedades hereditarias monogénicas 1.4 28
Malformaciones 3 60
Total 5 100
- Aportación de los marcadores ecográficos de segundo nivel al Cribado Combinado de Primer Trimestre-
Evaluación de la Ecografía Morfológica Precoz
 Eco de 20s centralizada

Es la ecografía la que criba

 Avances en Genética

1970
Técnica de Banda
1986
FISH

2002 2011/12
Arrays cfDNA
 DNA fetal en sangre materna

Método de Cribado
No método de diagnóstico prenatal no invasivo
ADN materno de apoptosis de eritrocitos
ADN fetal de apoptosis Trofoblasto

Supone 10-20% del ADN en sangre materna

Representado todo el genoma
150PB
Dura poco tiempo (min)
Desaparece rápido tras nacimiento
ADN materno versus fetal: Como se distingue ?

• Tamaño
• Inmunoprecipitado con Hipo-Hipermetilación
• Enlace del nucleosoma
• Muestreo por formaldehido

No utilizado

Es la secuenciación masiva
Secuenciación masiva en paralelo
• Diferencia de ADN es del 10%
• Resultado en z-score
• C 21 es el 1.5%, secuenciar
millones de fragmentos
Secuenciación masiva dirigida en paralelo
Solo amplifica las secuencias
seleccionadas
Menor secuenciación y costo
Resultado en LR con edad…
Análisis dirigido de SNPs
• Solo amplia las regiones de los cromosomas que interesan
• 19488 SNPs de 21,18,13,X,Y
• Menos secuenciación y costo
• Resultado en LR con edad…
Otros:
• Selección de ADN fetal por la hipermetilación
• PCR digital
• Basados ARN (que solo lo expresa el trofoblasto)
Test Prenatal no invasivo o evaluación cfDNA
No método de diagnóstico prenatal no invasivo
Benn 2013
Resultados en Alto y Bajo Riesgo

S F+
Down S 99% 0.1%
Edwards S 97% 0.1%
Patau S 78% 0.4%
SNP studies

242 gestaciones con 32 cromosomopatías

Resultados en el 95%
S 100% E 100% T 21, 13, 18, X, Y
Secuenciación masiva. Sin resultados

Fallo de resultado del 6.1% (0.8-9.9%)

Escaso cfDNA fetal 2% (nueva muestra 32%)

Tiempo 10-14 dias y re-respuesta 10-15 dias

Gestación Múltiple ?
En teoria SNPs mejores resultado
Secuenciación en G Múltiples con S 99%
(Canick 2012, Lau 2013)

Evanescente (?)
 Futuro de cfDNA
• Anomalias de cromosomas sexuales (80%)
(mosaicos, Y poca cantidad, X se pierde con la edad)
• Mosaicismo (50%, confinado a la placenta?)
• Translocaciones (Tecnologia SNP)
• Triploidias (Basada en z-score no, SNP)

• Genotipo completo
(Fan, Kitzman 2013)
Ya que es un método de cribado debemos valorar:
Costos

Tiene que ir a metodología Contingente

Pero si vamos a metodología Contingente
Si añades PIF y AFP
S 98% F+ 0.4%
 S F+
TC 80% 4.2%
Secuencial 93.3% 4.8%
 S F+
TC 80.3% 3.8% 970,000 E
Contingente 81.5% 1.1% 941,000 E
Conclusiones cfDNA
Estamos preparados para la metodología
contingente

Tiene sentido aquí cfDNA

Todo coordinado desde UMFetal

El primer paso es el Test Combinado

S > 95% F+ < 0.5%

Conclusiones Arrays

En caso de ME y cariotipo normal Δ 5.2-12%

En caso de Muerte fetal Δ 8.5%

CNV 1-3%

Debemos incorporarlo en las UMFetal

Gracias