FACULTAD DE BIOLOGÍA, CIENCIAS

AMBIENTALES Y QUÍMICA

FACULTAD DE BIOLOGÍA, CIENCIAS AMBIENTALES Y QUÍMICA

GRADO EN QUÍMICA

TRABAJO DE FIN DE GRADO

Adaptación de test de toxicidad con Pseudomonas putida
para su miniaturización

Autor: Pablo Abejer García

Tutora: Dra. Ana Karina Boltes Espínola

2017
 FACULTAD DE BIOLOGÍA, CIENCIAS
AMBIENTALES Y QUÍMICA

FACULTAD DE BIOLOGÍA, CIENCIAS AMBIENTALES Y QUÍMICA

-
GRADO EN QUÍMICA
TRABAJO DE FIN DE GRADO

Adaptación de test de toxicidad con Pseudomonas putida

para su miniaturización

Tribunal de calificación:

(Firma)
Presidente: ___________________________________

(Firma)
Vocal 1º: _____________________________________

(Firma)
Vocal 2º: _____________________________________

Calificación: ___________________________________

Fecha: _______________________________________
2017
 FACULTAD DE BIOLOGÍA, CIENCIAS
AMBIENTALES Y QUÍMICA

INFORME PARA LA DEFENSA PÚBLICA DEL TRABAJO DE FIN DE GRADO

D/Dª Ana Karina Boltes Espínola, profesor del Departamento de Química Analítica,
Química Física e Ingeniería Química de la UAH, como tutor del Trabajo de Fin de Grado
en Química de D. Pablo Abejer García titulado “Adaptación de test de toxicidad con
Pseudomonas putida para su miniaturización”

INFORMA: FAVORABLEMENTE

Alcalá de Henares 6 de julio de 2017

Firma del tutor Firma del cotutor (si lo hubiere)

Fdo.: Ana Karina Boltes Espínola Fdo.:_________________________

Resumen

En el presente estudio, se realizan modificaciones del test de actividad

microbiana reflejado en la norma UNE-EN ISO 10712 con el objetivo de
incorporar en su procedimiento un marcador de viabilidad celular (resazurina) y
ajustarlo a la escala micro-litro. El objetivo del trabajo es adaptar en el
planteamiento de la norma el empleo de un método de marcaje y la microplaca
de 96 pocillos con la pretensión de avalar su procedimiento experimental sin
grandes modificaciones.
En primer lugar, se realizó un estudio de crecimiento del microorganismo
(Pseudomonas putida) en microplaca de 96 pocillos con los medios y
procedimiento especificados en la norma a diferentes UFC (unidades
formadoras de colonias), cotejando resultados obtenidos modificando por
separado variables como el medio de cultivo empleado, volumen del caldo en
pocillo o temperatura. Los resultados reflejan que el crecimiento está limitado
por el medio de cultivo indicado en la norma, además de por inconvenientes
inherentes a las dimensiones del pocillo.
En segundo lugar, se realizó la optimización particular del empleo de
resazurina con Pseudomonas putida, así como de la supervisión de las
interacciones con el resto de componentes de los diferentes medios
preparados, a fin de evitar sobreestimaciones y perturbaciones de la señal que
afecten a la exactitud de los resultados. Se analizaron los efectos derivados de
modificar algunas condiciones de ensayo: tiempo y concentración de
exposición a resazurina, interacción de esta con microorganismo en diferentes
fases de crecimiento y temperatura.
Se escogió el toxico 3,5-diclorofenol (DCP) como control positivo de la
inhibición bacteriana, el cual, se aplica en diferentes dosis para ver su
correlación con la señal fluorescente aportada por el marcador. Mediante la
elaboración de un ensayo con DCP se obtuvo el porcentaje de inhibición en
cada concentración y las concentraciones efectivas EC20 y EC50.

Palabras clave: Resazurina, Pseudomonas putida, 3,5-diclorofenol,

toxicidad, crecimiento bacteriano, UNE-EN ISO 10712.
Abstract

In the present study, the norm UNE-EN ISO 10712 was changed its
method throught several modifications with the aim of incorporating a cellular
viability marker (resazurin) into the procedure and adjusting it to the micro-liter
scale. The objective of the work is to adapt the use of a labeling method and the
96 - well microplate with the intention of endorsing its experimental procedure
without a lot modifications.

In the first part, a study of growth of the cellular line Pseudomonas putida in a
96-well microplate was carried out using the means and procedure specified in
the cited norm to different CFUs (Colony forming unit), comparing results
obtained by separately modifying variables such as the culture medium used,
volume in well or temperature. The results reflect that growth is limited by the
culture medium indicated in the norm, in addition to inherent drawbacks cause
of the size of the well.

Secondly, the particular optimization of the use of resazurin with Pseudomonas

putida was carried out, as well as the monitoring of interactions with the rest of
components of the different prepared media, in order to avoid overestimation
and signal disturbance affecting the Accuracy of results. The effects of
modifying some test conditions were analyzed: time and concentration of
exposure to resazurin, interaction of this in different growth phases.

The toxic, 3,5-dichlorophenol (DCP) was chosen as a positive control of

bacterial inhibition, which is applied at different doses to see its different effects
with the fluorescent signal provided by resazurin. Through the development of a
DCP assay, the percent inhibition at each concentration and the EC20 and
EC50 values were obtained.

Keywords: Resazurin, Pseudomonas putida, 3,5-dichlorophenol, toxicity,

bacterial growth, UNE-EN ISO 10712.
ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 5
2. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................ 5
2.1. Preparación de soluciones nutrientes del medio de cultivo ........................... 5
2.1.1. Procedimiento ............................................................................................ 5
2.2. Preparación del cultivo madre ....................................................................... 6
2.2.1. Características de la bacteria empleada: Pseudomonas putida ................. 6
2.2.2. Procedimiento ............................................................................................ 6
2.3. Crecimiento de la bacteria en microplaca de 96 pocillos ............................... 7
2.3.1. Metodología experimental .......................................................................... 7
2.3.2. Procedimiento ............................................................................................ 7
2.4. Optimización del marcador de viabilidad celular: Resazurina ....................... 9
2.4.1. Preparación del marcador de viabilidad celular: Resazurina ...................... 11
2.4.2. Ensayos de absorbancia ............................................................................ 11
2.4.3. Ensayos de fluorescencia........................................................................... 12
2.4.4. Ensayos de estabilidad con controles negativos ........................................ 13
2.5. Ensayos con tóxico: 3,5-diclorofenol (3,5-DCP) ............................................ 13
2.5.1. Metodología experimental .......................................................................... 13
2.5.2. Procedimiento reflejado en UNE-EN ISO 10712 ........................................ 14
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 15
3.1. Optimización de las incorporaciones al procedimiento de la norma .............. 15
3.1.1. Crecimiento de P. putida en microplaca de 96 pocillos .............................. 15
3.1.2. Optimización del marcador de viabilidad celular: Resazurina .................... 17
3.1.3. Consideraciones en la optimización del método ........................................ 21
3.2. Resultado de la optimización: ensayo con modificaciones incorporadas ...... 23
3.2.1. Cálculo de la toxicidad: 3,5-DCP sobre Pseudomonas putida ................... 23
4. CONCLUSIONES ............................................................................................ 25
5. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 26
 Índice de Figuras

Figura 1: Modificación del volumen del caldo de cultivo ....................................... 15

Figura 2: Variación de la temperatura .................................................................. 16
Figura 3: Crecimiento aplicando diferente medio de cultivo ................................. 17
Figura 4: Variación del periodo de conservación del cultivo madre...................... 17
Figura 5: Medición de resazurina mediante absorbancia ..................................... 18
Figura 6: Reducción de resazurina con componentes del medio a ensayar ........ 19
Figura 7: Señales de fluorescencia de diversas absorbancias de P. putida
con una incubación previa de 5 horas ................................................... 19
Figura 8: Señales de fluorescencia de diversas absorbancias de P. putida
con una incubación previa de 12 horas ................................................. 19
Figura 9: Señales de fluorescencia de diversas absorbancias de P. putida
con una incubación previa de 24 horas ................................................. 20
Figura10: Aumento de la temperatura a 35ºC en el periodo de medición ............ 21
Figura 11: Evidencia de ascenso de señal de fluorescencia
con aumento de resazurina ................................................................... 21
Figura 12: Resultados obtenidos aplicando las modificaciones propuestas ......... 23

Índice de Tablas

Tabla 1: Soluciones precursoras ............................................................................. 5

Tabla 2: Soluciones nutrientes ................................................................................ 5
Tabla 3: Ensayos de crecimiento en microplaca ..................................................... 8
Tabla 4: Ensayos de absorbancia para optimización con resazurina ..................... 12
Tabla 5: Ensayos de fluorescencia para optimización con resazurina ................... 13
Tabla 6: Ensayos toxicológicos con 3,5-diclorofenol ............................................... 14
Tabla 7: Valores de toxicidad obtenidos en diferentes tiempos de medición .......... 24

Índice de Esquemas

Esquema 1: Mecanismo de reducción de resazurina ........................................... 9

Esquema 2: Mecanismo de regulación ................................................................ 9
 1.Introducción

Actualmente, existe una importante preocupación por el aumento de

contaminantes xenobióticos en el medio ambiente, lo cual, constituye un riesgo
para la sostenibilidad de los ecosistemas y para la seguridad de las personas.
Las fuentes causantes de este aumento de sustancias contaminantes son muy
variadas: vertidos industriales, alcantarillado y aguas residuales, actividades
mineras, quema de combustibles fósiles, abonos y pesticidas químicos…
Además, estos contaminantes pueden afectar a la calidad del agua,
acumulándose en ella y generando un riesgo para todos los seres vivos. Es por
ello que se debe aplicar un control continuo a los recursos hídricos y, de esta
manera, detectar cualquier posible anomalía.
La calidad del agua depende del uso final al que se destine, puesto que no son
los mismos parámetros los exigidos al agua de consumo humano o al agua
para riego de parques. En cualquier caso, para establecer la calidad del agua
se establecen varios tipos de ensayos, tanto por medio del análisis químico
como mediante los test de toxicidad. En estos últimos se expone a organismos
vivos (bacterias, algas, invertebrados, plantas, peces...) a los contaminantes en
un medio definido para medir alguna respuesta biológica y obtener así, una
señal toxicológica. Es decir, los microorganismos son utilizados como sensores
biológicos de la contaminación ambiental.
Para valorar la magnitud de la toxicidad en un determinado medio acuático se
deben incorporar resultados obtenidos en varios test toxicológicos de diversa
metodología para, finalmente, dictaminar una valoración final fundada en un
amplio espectro de toxicidad.
Existen diferentes mecanismos de medición para cada respuesta biológica, los
cuales, pertenecen a un test de toxicidad determinado: metabolismos de
carbono, azufre o nitrógeno, actividad enzimática, tasa de crecimiento,
producción de calor metabólico, tasa de respiración y producción de
bioluminiscencia.
En este caso, se realiza una adaptación de la norma UNE-EN ISO 10712, que
consiste en un ensayo de la calidad del agua mediante la medida del efecto
inhibidor del agua superficial, subterránea o residual sobre el crecimiento de

1
una población de Pseudomonas putida. Se procede añadiendo la misma
cantidad de microorganismo a diluciones crecientes de la muestra de agua en
cuestión, realizando una medición de su densidad óptica después del periodo
de incubación indicado y, finalmente, expresando los resultados en forma de
porcentajes de inhibición.
Esta norma basa su análisis en la determinación de la turbidez, por lo que no
es adecuado para el ensayo de muestras coloreadas, que presenten
sustancias no disueltas o que produzcan cambios como precipitaciones a lo
largo del ensayo. Además, si se lleva a cabo el ensayo de la manera que se
indica en la norma, emplearíamos gran cantidad de material de vidrio lo que
supondría una mayor complicación, ensayos más engorrosos y un aumento de
la posibilidad de contaminación.
Es por ello, que vamos a adaptar el uso de microplacas y un marcador de
viabilidad celular a la norma antes mencionada, para dotarla de mayor
sensibilidad y reproducibilidad. Se trata de resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-
3-ona 10-óxido), azul no fluorescente, que se reduce de manera irreversible a
resorufina en presencia de viabilidad celular (rosado, muy fluorescente).
Este no se acumula, sino que, a su vez, se puede reducir metabolizado por las
células (consistiendo esta vez en un proceso reversible por el oxígeno
atmosférico) a dihidroresorufina (Rolón, et al., 2006) (incolora) siendo este
fenómeno de reducción secundaria dependiente del tipo de célula y favorecida
por el consumo total de resazurina (O'Brien, et al., 2000; Guerin, et al., 2001).
Algunos autores asocian estos procesos a las mitocondrias de células viables
(Rasmussen, et al., 1999; Zhang, et al., 2004) aunque otros proponen que la
resazurina entra en el citoplasma celular, se reduce mediante cualquier enzima
deshidrogenasa (McNicholl, et al., 2007) y luego se excreta al medio en forma
de resorufina (O'Brien, et al., 2000).
Esta difusión de resorufina al medio permite el continuo monitoreo del
crecimiento o decaimiento celular si se trata con xenobióticos. (Escobar, et al.,
2010).
Se ha demostrado que, para periodos de incubación con resazurina muy largos
(>12horas), la relación señal-fondo presenta mayor sensibilidad con
concentraciones de microorganismo (o tamaño del inóculo) bajas, perdiéndose
levemente la relación lineal con concentraciones altas en el mismo escenario.

2
El problema es que se ha descrito que la resazurina puede llegar a provocar un
efecto citotóxico para las células debido a la alta transformación a
dihidroresorufina durante una exposición superior a 12 horas (Rolón, et al.,
2006; O’Brien, et al., 2000). Se ha documentado la toxicidad de la resazurina
hacia microorganismos Gram-positivos (el género Pseudomonas es Gram-
negativos) aunque solo a concentraciones de colorante mayores de 1g/L (Fung
y Miller, 1973). Por el contrario, cuando se empleó como un reactivo de ensayo
de proliferación de células eucariotas, no se observaron efectos tóxicos, incluso
después de un período de incubación prolongado (O'Brien, et al., 2000).
Por otro lado, se comprobó (McNicholl, et al., 2007) que, con el aumento de la
concentración inicial de resazurina, aumentaba la reducción de esta hasta
concentraciones de 40 mg/L. La inhibición de su reducción no se vio hasta
concentraciones de colorante de 100 mg/L
Se ha manifestado que la resazurina se reduce como consecuencia de la
reducción química del medio en el que se produce el crecimiento celular
(Fields, et al., 1993). Sin embargo, (O'Brien, et al., 2000) encontraron que la
resazurina se reduce a resorufina en un medio con actividad celular, pero en un
medio altamente reductor, sin células viables, no está favorecida la reacción.
Un gran atributo de este marcador celular es que las células muertas, sin
actividad metabólica, no reducen al colorante (Acevedo, et al., 2013).
Algunas de las aplicaciones de la resazurina como trazador biorreactivo han
incluido la detección de toxicidad química (Liu, et al.,1986), actividad de lodos
en el tratamiento de aguas residuales (McNicholl, et al., 2007), la viabilidad
celular en mamíferos (O'Brien, et al., 2000), la abundancia de microorganismos
degradantes de contaminantes (Guerin, et al., 2001), la diferenciación de
bacterias aeróbicas y anaeróbicas (Karakashev, et al. 2003), la detección de la
actividad de los desinfectantes contra los biofilms (Mariscal, et al., 2009), los
ensayos de viabilidad de las semillas (Min, et al., 2011) además del recuento
de células en los experimentos de tratamiento del cáncer de mama (Ziegler, et
al., 2011).
Tras ver las peculiaridades del marcador celular empleado, vamos a mencionar
diferentes opciones de medida que nos ofrece, así como su necesaria
optimización:
Se pueden emplear dos métodos de medida (Espejo, et al., 1977):
Medir tras un determinado tiempo de incubación.
3
 Medir el tiempo invertido en alcanzar un determinado valor de
fluorescencia o esperar a la reducción total (Borrell, 1949).
Además, es posible obtener tanto medidas de fluorescencia en URF como
medidas de absorbancia (Anoopkumar-Dukie, et al., 2005), después de un
periodo de incubación adecuado, aunque la sensibilidad es menor y el
tratamiento de datos posterior mayor.
Según (Nakayama, et al., 1997) la reducción con resazurina es un método
variable dependiente de la línea celular evaluada. Debido a que cada tipo de
célula presenta unas propiedades metabólicas únicas es necesario valorarlas
individualmente y así adecuar las condiciones de ensayo a cada una de ellas.
Algunas características del ensayo a optimizar son: tiempo de incubación,
intervalo de concentración celular a ensayar, cantidad de marcador a utilizar y
temperatura. Todo ello para que los resultados obtenidos sean representativos
de la concentración de células vivas.
La finalidad de este trabajo es demostrar la validez de la adaptación realizada
en nuestro caso de la norma UNE-EN ISO 10712 la incorporación del marcador
celular resazurina.
Para ello se establecen los siguientes objetivos:
1.1. Modificar los volúmenes de trabajo de escala de mL a µL, para
introducir el uso de microplacas.
1.2. Adaptar el uso de un marcador de viabilidad celular, resazurina, que
dotará al test de mayor sensibilidad en la detección de la respuesta
biológica.
1.3. Demostrar la validez de las modificaciones realizadas empleando un
control positivo de la toxicidad: el tóxico 3,5-diclorofenol (DCP).

4
2. Materiales y métodos.

2.1. Preparación de soluciones nutrientes del medio de cultivo.

Reactivos químicos y equipamiento.
NaNO3 99% MgSO4∙7 H2O 99-
PANREAC 105% PANREAC
K2HPO4 98-100,5% Citrato de hierro (III)
PANREAC Fe(C6H5O7) ≥99.0%
SIGMA ALDRICH
KH2PO4 98-100,5%
PANREAC Agar industrial CONDA
Extracto de levadura Extracto de carne
CONDA CONDA
Glucosa Peptona CONDA
monohidratada ≥99.0%
NaCl 99,5%
SIGMA ALDRICH
PANREAC
Autoclave J.P. SELECTA PRESOCLAVE II
Cabina de flujo laminar con lámpara de rayos UV TELSTAR AV-30/70
PH-metro CRIPSON PH 25
Balanza analítica METTLER TOLEDO AB104

2.1.1. Procedimiento.
Inicialmente, se realizaron todas las soluciones necesarias que se
reflejan en la norma, además de una solución denominada “Nutrition Broth”
(NB), la cual posee mayor cantidad de nutrientes para provocar un crecimiento
bacteriano más vigoroso si fuera necesario. Soluciones elaboradas:

Reactivos Solución I Solución Solución Solución

químicos II III IV
Agua destilada 500 mL 500 mL 500 mL 1000 mL
NaNO3 10 g 10 g
K2HPO4 2,40 g 2,4 g
KH2PO4 1,20 g 1,20 g
Extracto de levadura 1g
D(+)glucosa monohidratada 40 g
MgSO4 · 7H2O 4g
Citrato de hierro (III) 0,01 g
Tabla 1: Soluciones precursoras.

Preinóculo Nutrition Broth (NB) Solución II, III, IV Agar

400 mL agua destilada 1L agua destilada 5 mL solución II 250 mL agua
25 mL soluciones I y III 1 g extracto de carne 5 mL solución III destilada
50 mL solución IV 2 g extracto de levadura 10 mL solución IV 50 mL solución I
Ajuste pH=7,2±0,2 5 g peptona 125 mL solución III
5 g NaCl 100 mL solución IV
4,5 g agar industrial
Tabla 2: Soluciones nutrientes.

Se esterilizan todas ellas en la autoclave antes de su uso, así como agua

destilada, puntas de micropipetas de diferente volumen y varios tubos falcon. Al
5
finalizar el proceso, se trasvasa una parte de cada disolución a dichos tubos
falcon estériles, en campana previamente esterilizada mediante radiación UV,
para transportar únicamente los tubos falcon y, de esta manera, no poner en
riesgo de contaminación el contenido total de las disoluciones. Toda solución
empleada en la experimentación se conserva a 4ºC.

2.2. Preparación del cultivo madre.

Equipamiento.
Cabina de flujo laminar con lámpara de rayos UV TELSTAR AV-30/70
Transporta eppendorf con sistema isotérmico EPPENDORF
Estufa NAHITA 631 PLUS
Placas Petri THERMO SCIENTIFIC
2.2.1. Características de la bacteria empleada: Pseudomonas putida.
El género Pseudomonas se refiere a una amplia gama de bacterias, las
cuales se caracterizan por ser bacilos Gram-Negativos rectos y moderadamente
curvados, móviles con flagelación polar, que se pueden encontrar en ambientes
muy diversos como puede ser el suelo, agua, animales o plantas. Su
variabilidad metabólica unida a su maleabilidad genética, la hacen capaz de
colonizar ambientes muy diversos y difícilmente aceptables para otros seres
vivos, como ambientes con condiciones fisicoquímicas cambiantes o
contaminados. Su mecanismo de acción se basa en captar señales ambientales
y algunos compuestos de su alrededor, información que utiliza para adecuarse
genéticamente y regular sus rutas metabólicas para incorporar algún compuesto
como sustrato alimenticio y aprovecharlo como fuente de carbono y/o nitrógeno.
Entre estos compuestos aparecen disolventes orgánicos (Jiménez, et al., 2002),
por lo que se emplean en biodegradación y en procesos industriales variados,
además de su papel fundamental en el mantenimiento de un ecosistema y del
medio ambiente en general.

2.2.2. Procedimiento.
Si se parte con la disolución de agar en estado sólido, basta con
calentarlo en placa a 100⁰C el tiempo necesario hasta observar la totalidad de
la disolución en estado líquido. En cabina de flujo laminar, previamente
preparada activando los UV aproximadamente 15 minutos, se agrega la
disolución de agar en placas Petri, de tal forma que el fondo de estas quede
completamente cubierto, y se dejan enfriar a temperatura ambiente activando la
lámpara UV durante el proceso de solidificación. Una vez alcanzado el estado
sólido del agar en las placas, se procede a realizar el cultivo madre. Este
consiste en una toma de muestra de la cepa empleada en este trabajo,
Pseudomonas putida CECT4584, adquirida de la Colección Española de
Cultivos Tipo y conservada a -20⁰C.
A fin de sembrar las placas necesarias con P. putida, se recorre el siguiente
procedimiento: empleando un asa de metal, previamente esterilizada en llama
de mechero mediante etanol, se toma una fracción de la cepa bacteriológica y,
depositando suavemente la muestra, se distribuye uniformemente por todo el
6
agar sólido. Posteriormente, se cierran las placas sembradas y se colocan boca
abajo incubándose en la estufa un periodo de 24 horas a 25⁰C±4. Superado el
periodo de incubación, se observan las colonias formadas y, si no hay signos de
contaminación, se pone parafilm a las placas de tal forma que queden
completamente selladas y se conservan a 4⁰C, al igual que las placas no
sembradas.
Debido a las bajas temperaturas a las que se conservan las cepas bacterianas,
se debe emplear en todo el flujo de trabajo un sistema isotérmico, el cual, es
capaz de mantener la muestra bacteriológica refrigerada a -20⁰C varias horas.
2.3. Crecimiento de la bacteria en microplaca de 96 pocillos.
Equipamiento.
Thermostatic Cabinet AQUA LYTIC
Microplacas de polipropileno transparentes de 96 pocillos NUNC
Agitador vortex manual FISHER SCIENTIFIC Top Mix FB15024
Cabina de flujo laminar con lámpara de rayos UV TELSTAR AV-30/70
Espectrofotómetro (Shimadzu UV-1800)
Fotómetro Microplate Reader RT-2100C RAYTO
2.3.1 Metodología experimental.
Debido a que el criterio de validación de la norma UNE-EN ISO 10712
requiere un crecimiento de factor 60 durante el periodo de incubación (16 horas)
en el control (sin tóxico), se precisa averiguar si podemos alcanzarlo empleando
microplacas de polipropileno de 98 pocillos en lugar de matraces para el cultivo
de 250 mL mencionados en la norma. Para ello, se adapta la tabla 3 presentada
en la norma, que refleja el contenido de las series de ensayo, con la finalidad de
ajustarlo al uso de microplacas, adecuando los volúmenes y manteniendo la
proporción de las soluciones constituyentes (ver Tabla 3 de esta publicación).
Además, el crecimiento bacteriano está muy relacionado con el oxígeno disuelto
en el medio de cultivo (P. putida posee metabolismo totalmente aeróbico) y
este, a su vez, con la difusión alcanzada en la interfase aire-liquido
proporcionada. Como es evidente, el uso de microplacas es perjudicial ya que,
incluso la agitación, es menos efectiva en este contexto. Para evaluar la
trascendencia de esta y otras limitaciones inherentes a la utilización de
microplacas, se realiza un ensayo para examinar el crecimiento libre de la
bacteria en preinóculo, el medio de cultivo producido con las soluciones
nutrientes anteriores, procediendo como se indica a continuación.
2.3.2. Procedimiento.
Preparación del inóculo.
En cabina de flujo laminar, mediante un asa de plástico estéril, se rasca
una fracción de placa Petri tomando una muestra del cultivo madre. Se recoge
en un tubo Eppendorf con preinóculo en su interior y mediante un agitador es
7
homogeneizado su contenido. Posteriormente, la mezcla resultante es
depositada en un matraz Erlenmeyer con aproximadamente 10 mL de
preinóculo, para incubarlo en agitación y oscuridad a 24⁰C durante 5 horas en
cabina termostática, propiciando que la suspensión bacteriana entre en fase
exponencial de crecimiento en este periodo.
Disposición del ensayo.
Pasado el periodo de incubación, se mide la señal de absorbancia del
inóculo formado en el espectrofotómetro (Shimadzu UV-1800) a una λ de
610nm. Se toma como referencia el valor de turbidez 50 FNU, reflejado en la
norma, que corresponde a 0,1 de absorbancia a 610nm. En cabina de flujo
laminar, se realizan las disoluciones de inóculo correspondientes a valores de
absorbancia por encima del referenciado (0,1 - 0,2 - 0,3 - 0,4 y 0,5) llevadas a
cabo en base al valor de turbidez obtenido del inóculo formado.

Preinóculo Solución Absorbancias Inóculo Volumen

II, III, IV 0,1 - 0,2 - 0,3 - 0,4 - 0,5 final

Control - 200 µL 20 µL 0 µL 220 µL

Bioensayo 180 µL 20 µL 20 µL 220 µL

Tabla 3: Ensayos de crecimiento en microplaca.

Se disponen en una microplaca transparente de 96 pocillos con volumen total

de 200 µL (20 µL solución I, II, III + 180 µL de dilución de absorbancias
anteriores), empleando el control - como señal de fondo. Cada ensayo se
realiza por sextuplicado y se incuba de nuevo en las mismas condiciones
anteriores, pero esta vez, 16 horas. Después, se recogen las medidas de
absorbancia a 600nm (no se puede a 610nm debido a que el instrumento no
posee los filtros adecuados) en el lector de microplacas RT-2100C RAYTO. De
esta manera, se podrán cotejar los factores de crecimiento bacteriano que se
pueden llegar a alcanzar con diferentes tamaños de inóculo iniciales y dilucidar
cuál de estas se adapta más al crecimiento de factor 60 demandado.
Posteriormente, se realizan una serie de ensayos adicionales independientes,
siguiendo el mismo procedimiento, pero modificando alguna condición del
método con la finalidad de estimular el crecimiento y observar la relación de
este con cada variable alterada. Se llevan a cabo las siguientes modificaciones:
1.Tª de incubación: 24⁰C y 28⁰C
2.Medio de cultivo: Preinóculo y NB
3.Volumen del pocillo: 150uL y 200uL
4.Preparación del inóculo: a partir de placa Petri conservada una semana en
la nevera o recién incubadas el día anterior.
Tratamiento de datos.
Después de realizar el ensayo se elaboran las gráficas
correspondientes, reflejando la absorbancia corregida (restando el valor inicial
de absorbancia que se añade antes de la incubación) en función de la

8
absorbancia inicial de microorganismo, de tal manera, que se representa una
gráfica única por cada modo de ensayo que se experimenta, el cual, se
adquiere variando las condiciones anteriores.
2.4. Optimización del marcador de viabilidad celular: Resazurina.
Como se ha
comentado anteriormente, la
resazurina en presencia de
ciertas enzimas reductoras
cambia a resorufina. El
mecanismo que ilustra esta
conversión aparece en la
Esquema 1. El término
diaforasa se refiere a una
clase de enzimas
monoméricas ligadas a
flavina que muestran preferencia Esquema 1: Mecanismo de reducción de resazurina. Tomado de
An enzymatic fluorimetric assay for glucose-6-phosphate:
por NADPH como sustrato application in an in vitro Warburg-loke effect.
[Yeom, et al., 2009] por lo que se [Zhu, et al., 2009].
describen como fuente de NADPH oxidado y catalizan la reducción de varios
marcadores celulares que actúan como H+ aceptores de NADPH (Worthington
Bioquemical Corporation). NADPH es un coenzima que participa en la
transformación del marcador en su forma fluorescente. A nivel celular, en P.
putida NADPH se obtiene mayoritariamente mediante dos vías: a través de
enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y enzimas ferredoxin-NADP
(+) reductasa (FPR). La primera posee una preferencia especialmente alta por
NADP+, siendo el principal punto de conversión a NADPH, (hasta 90% bajo
condiciones de saturación in vitro) (Nikel, et al., 2015) situándose en la ruta
metabólica pentosas fosfato (PP). La segunda cataliza la oxidación o reducción
de los sustratos ferredoxina (Fd) y flavodoxina (Fld) conforme a la siguiente
reacción:

2 Ferredoxina(o Fld)reducida + NADP+ + H+  2 Fd(o Fld) oxidada + NADPH

Representa procesos de transferencia

de electrones (mediante la formación
de un complejo binario FPR/Fd o
FPR/Fld) que controlan la relación
proporcional NADPH/NADP+ en
proteobacterias como P. putida. Esquema 2: Mecanismo de regulación de NADPH. Tomado
de Glucose-6-phosphate dehydrogenase and ferredoxin-
NADPH es producido en grandes NADP(H) reductase contribute to damage repair during the
cantidades debido a su vital soxRS response of E. coli. [Giró et al., 2006].
importancia en funciones anabólicas para creación de biomasa y, también,
aumenta su presencia rápidamente en diferentes tipos de estrés ambiental.
En varias publicaciones (Batchelor, et al., 2004; Zhu, et al., 2009) se han
realizado ensayos in vitro que respaldan el mecanismo presentado en el
esquema 1. En ellos, se mide la fluorescencia, otorgada mediante resazurina,
avalando la presencia necesaria de cada miembro constituyente del mecanismo
propuesto para alcanzar una señal fluorescente representativa. También se
deja entrever la estrecha relación entre glucosa-6-fosfato (G6P), sustrato de
G6PD, y la fluorescencia alcanzada.

9
Otra de las características de ambas enzimas (G6PD y FPR) es su intervención
en el proceso de resistencia celular contra el daño oxidativo provocado por las
sustancias reactivas de oxígeno (ROS) ya sean endógenas o exógenas (Giró,
et al., 2006).
Según (Chavarría, et al., 2013), en un medio de glucosa, P. putida emplea
mayoritariamente la ruta Entner-Doudoroff (ED) para procesarla en vez de la vía
PP. Sin embargo, en la ruta ED no se encuentra la enzima G6PD, principal
origen de NADPH, si no que pertenece a PP, ruta que aporta en términos
relativos mayor cantidad de NADPH, no obstante, minoritaria respecto a ED en
el global metabólico.
Durante el crecimiento exponencial de P. putida, la actividad de la enzima FPR
es mucho más alta que en la fase estacionaria lo que estimula a la enzima 6-
fosfogluconato deshidrogenasa (6PGD) presente en la ruta PP. Así, 6PGD
origina grandes cantidades de NADPH, ya que su preferencia por NADP+ es
muy alta, similar a G6PD (Nikel, et al., 2015).
Las mencionadas diaforasas son enzimas deshidrogenasas responsables de la
transferencia electrónica desde el coenzima NADPH hacia la resazurina y, por
tanto, de la aparición de la fluorescencia debido a la reducción. De hecho, se ha
comprobado in vitro (Catomeris, et al., 1988) que la acción de la diaforasa
aumenta al añadir mayor cantidad de resazurina al medio, así mismo, la
actividad de la diaforasa representa una reacción enzimática de primer orden a
bajas concentraciones de resazurina (<10 ppm). Por ello, la constante cinética
de diaforasa respecto a NADPH varía en función de la resazurina usada.

Respecto a la resazurina, es de valor destacar algunas complicaciones

inherentes a su utilización. Es posible encontrarse con subestimaciones de
fluorescencia debidas a diversas causas. La principal es la reducción de
resorufina (fluorescente) a dihidroresorufina (no fluorescente) que se hará más
evidente en medios con muy poca cantidad de resazurina (O’Brien, et al., 2000).
Para evitar este impacto en la señal, se debe fomentar el oxígeno disuelto en el
medio hasta donde sea posible lo que contribuirá a revertir esta conversión. Se
advierte de otra fuente de subestimación basada en el “quenching” o
“enfriamiento” de la señal (Catomeris, et al., 1988). Debido a que la resazurina
presenta su absorción máxima a 600nm, cerca de la emisión de fluorescencia
de la resorufina (585nm), amortigua parcialmente esta radiación, produciéndose
una disminución relativa de la señal recogida a medida que se acondiciona el
medio con mayor cantidad de resazurina. Este efecto es manifiestamente visible
en cada ensayo replicado a diferentes concentraciones de marcador celular.
También pueden aparecer sobreestimaciones de la señal, las cuales se basan
en reducciones del marcador que se producen por causas ajenas al
metabolismo celular. Es necesario realizar una prueba con los constituyentes
del medio a ensayar (excepto el microorganismo) para comprobar su capacidad
de reducción y la posible variación de esta en el tiempo de ensayo. Añadir la
resazurina después del periodo de incubación con el tóxico además de
desarrollar estudios cinéticos con la línea celular en particular (sin tóxico) para
optimizar el empleo del marcador es aconsejable, a fin de eludir
sobreestimaciones de supervivencia celular (O'Brien, et al., 2000). Esta
optimización requiere realizar una serie de ensayos con nuestra cepa
bacteriana, que nos revelen que temperatura, tiempo de incubación, cantidad
de marcador y tiempo de espera son los apropiados para obtener señales de
fluorescencia que nos permitan discernir entre concentraciones ubicadas en el
rango de interés y la señal del blanco (fondo).

10
Por otro lado, se puede emplear la resazurina tanto para ensayos de medición
de punto final, como para ensayos cinéticos que muestran su fluorescencia a lo
largo del tiempo (O'Brien, et al., 2000). También es apta para la medida de su
absorbancia, además de su fluorescencia, aunque la mayor sensibilidad se
alcanza aprovechando su propiedad fluorimétrica (O'Brien, et al., 2000).
En el presente trabajo, se realizan ensayos con ambos métodos de medida. Se
emplea el método cinético en la optimización y el ensayo de punto final en los
ensayos con tóxico. También se desarrollan diferentes ensayos de absorbancia
y fluorescencia para cotejar cuál de las dos magnitudes aporta datos con
mejores propiedades analíticas.

2.4.1. Preparación del marcador de viabilidad celular: Resazurina.

Reactivos.
Resazurina 171591 PANREAC
Agua Milli-Q esterilizada
Procedimiento.
En cabina de flujo laminar, previamente esterilizada con radiación UV,
se realiza la disolución madre de 6000 ppm. Se miden 30,12 g de resazurina
que se añaden en 5mL de agua Milli-Q esterilizada y se lleva a cabo la dilución
necesaria para obtener 10mL de 300 ppm de marcador. Por último, se reparten
las disoluciones de resazurina resultantes adicionando 1 mL en tubos eppendorf
que se envuelven en papel albal y se conservan a -20⁰C. Al ser un reactivo
fotosensible, se debe evitar, en la medida de lo posible, la incidencia de luz a lo
largo de todo el flujo de trabajo en el laboratorio. A partir de la disolución madre
se elaboran varias diluciones, según necesidad, ya que el intervalo de
concentraciones que se quiere examinar y poner en contacto con el
microorganismo es muy amplio [5 – 500 ppm].
2.4.2. Ensayos de absorbancia.
En este tipo de ensayo, el analito que se evaluó es la resazurina, al
contrario que en las medidas de fluorescencia que es la resorufina, producto de
reducción debido al metabolismo celular. Esto es consecuencia de no contar en
el fotómetro con el filtro adecuado para seleccionar 570nm (λabsorción de
resorufina), por lo que finalmente se mide a 600nm cerca de la λabsorción máxima
(605nm) de la resazurina.
Equipamiento.
Cabina de flujo laminar con lámpara de rayos ultravioleta
TELSTAR AV-30/70
Fotómetro Microplate Reader RT-2100C RAYTO
Microplacas de polipropileno transparentes de 96 pocillos NUNC
Procedimiento.
Se prepara un inóculo en cabina de flujo laminar, dispuesta
previamente, en aproximadamente 10 mL de preinóculo y se deja incubando 5h
11
a 24⁰C en oscuridad y agitación. Se realiza un ensayo con determinadas
absorbancias, obtenidas mediante diluciones del inóculo formado y
correspondientes al intervalo de crecimiento hábil observado en el apartado 2.3.
[0 – 0,2 abs], estando cada una de ellas marcada con dos concentraciones de
resazurina: 5uL y 10 µl de 6000ppm. Se dispuso la microplaca de tal manera
que cada bioensayo individual se hizo por quintuplicado, incubándose después
a 24⁰C, en oscuridad y agitación, durante 30 minutos. Pasado ese tiempo, se
llevan a cabo mediciones a 600nm empleando el fotómetro RAYTO RT-2100C.
Preinóculo Solución Inóculo: [0 – 0,2u.a.] Resazurina
II, III, IV

Control - 180 µL 20 µL 0 µL 300 y 150 ppm

Bioensayo 0 µL 20 µL 180 µL 300 y 150 ppm

Tabla 4: Ensayos de absorbancia para optimización con resazurina.

Tratamiento de datos.
Con el fin de observar la linealidad necesaria para servirnos de este
método, se elaboran las gráficas representando la absorbancia en función de la
concentración de microorganismo inicial en unidades de absorbancia.
2.4.3. Ensayos de fluorescencia.
Equipamiento.
Cabina de flujo laminar con lámpara de rayos ultravioleta
TELSTAR AV-30/70
Fluoroskan Ascent FL microplate luminometer THERMO
SCIENTIFIC
Microplacas de polipropileno negras de 96 pocillos NUNC
Procedimiento.
En cada ensayo se prepara el inóculo en campana de flujo laminar,
para evitar contaminación, y se deja incubando a 24⁰C, en oscuridad y
agitación, diferentes tiempos en cada prueba (5h-12h-24h) a fin de valorar su
trascendencia en la aplicación de resazurina. Se realizan una serie de ensayos
independientes aplicando concentraciones de marcador en el rango [5 – 500
ppm] a varias absorbancias de microorganismo, previamente preparadas a
partir del inóculo incubado y pertenecientes al intervalo de crecimiento percibido
en el apartado 2.3. [0 – 0,2u.a.]. Inmediatamente después de añadir la
resazurina, comienza su reducción a resorufina, lo que conlleva la aparición del
atributo de medida: la fluorescencia. Mediante el Acent Software conectado al
Fluoroskan Ascent FL microplate luminometer THERMO SCIENTIFIC, se fija el
protocolo de medida marcando los pocillos de la microplaca deseados para su
lectura y estableciendo los siguientes parámetros:
o Método de medida: fluorimetría cinética
o Número de medidas: 19

12
 o Intervalo de medida: 5 min
o λexcitación= 542nm, λemisión= 592nm
o Tª en el periodo de medición: 30⁰C
El grupo de variables que se van a tratar incluye: concentración microorganismo
en pocillo, tiempo de incubación, concentración resazurina, tiempo de
exposición al marcador y temperatura.
Preinóculo Solución II, Inóculo: [0 - 0,2u.a.] Resazurina
III, IV

Control - 180 µL 20 µL 0 µL 5 – 500 ppm

Bioensayo 0 µL 20 µL 180 µL 5 – 500 ppm

Tabla 5: Ensayos de fluorescencia para optimización con resazurina.

Tratamiento de datos.
Se obtienen las medidas de fluorescencia (URF) que corresponden al
periodo de medición, las cuales se disponen gráficamente en función del tiempo
para contemplar si las curvas cumplen con su carácter ascendente y son
coherentes sus posiciones relativas unas respecto de otras en relación a la
concentración que representan, además de dilucidar en que tiempo poseen
valores convenientemente discernibles. Asimismo, se elaboran diferentes
gráficas que representan series de valores de fluorescencia de los diferentes
tamaños de inóculo a un determinado tiempo del periodo de medición. Un
método de actuación consiste en disponer 4 series de datos pertenecientes a
los tiempos: 30, 50, 70, 90 minutos, presentando concentración de
microorganismo frente a URF. El examen de la correlación lineal de estas dos
variables, permite cotejar las series entre sí y dilucidar a que tiempo de
medición se obtiene la mejor relación analítica.
2.4.4. Ensayos de estabilidad con controles negativos.
La consistencia fluorimétrica del marcador es fundamental, por lo que
es necesario comprobar si existen interferencias de las distintas sustancias
implicadas [O'Brien et al. 2000] en el posterior ensayo toxicológico.
Se realiza la prueba adicionando en microplaca 180 µL de agua, preinóculo,
N.B. y 3,5-DCP (40 ppm). En cada uno de ellos se otorgan tres concentraciones
de resazurina en el pocillo: 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm para, inmediatamente,
introducirlo el fluorímetro a 30ºC. Cada ensayo se hace por triplicado.

2.5. Ensayos con toxico: 3,5-diclorofenol (3,5-DCP).

Reactivos.
3,5-Diclorofenol, 97% ALDRICH
Agua Milli-Q esterilizada en autoclave
2.5.1 Metodología experimental.
Como recoge el método 209 OCDE, el producto químico 3,5-
Diclorofenol (3,5-DCP) se cataloga como sustancia química de referencia en la
13
realización de numerosos ensayos toxicológicos basados en la inhibición de la
respiración.
A modo de comprobación del funcionamiento del procedimiento reflejado en la
norma UNE-EN ISO 10712, se empleará el efecto inhibidor de la respiración
que provoca el tóxico DCP, mencionado en el criterio de validación de la norma,
el cual requiere obtener una EC50 de DCP entre 10 mg/L y 30 mg/L para
considerar la prueba válida.
Con el fin de elaborar las diluciones de toxico necesarias en los ensayos
posteriores, se parte de una disolución madre de 1000 ppm en 100 mL
realizada con agua Milli-Q previamente autoclavada. Se realizan las diluciones
correspondientes en preinóculo para obtener las concentraciones: 1,25 ppm,
2,5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm. El intervalo de concentraciones de
3,5-DCP es semejante al aconsejado en la norma, sin embargo, cambiando el
valor de las concentraciones de tal manera que va aumentando de una a otra a
razón de factor 2. Todo el proceso, incluidas las diluciones posteriores, se
realiza en cabina de flujo laminar preparada previamente activando los UV
excluyendo de esta manera el riesgo que supondría esterilizarlo en la autoclave,
ya que el toxico podría degradarse debido a las altas temperaturas aplicadas.
Se pretende elaborar una serie de ensayos en los que se empleen dos grupos
control: un control positivo, que no se le administra toxico, y un control negativo,
que no se inocula, además de obtener las señales correspondientes a la
exposición del microorganismo a diferentes dosis de tóxico a fin de apreciar una
correlación entre estas y la señal de fluorescencia.

Equipamiento.
Cabina de flujo laminar con lámpara de rayos ultravioleta TELSTAR AV-
30/70
Fluoroskan Ascent FL microplate luminometer THERMO SCIENTIFIC
Microplacas de polipropileno negras de 96 pocillos NUNC
2.5.2. Procedimiento reflejado en UNE-EN ISO 10712.
En cabina de flujo laminar, se prepara el inóculo y se deja incubando en
agitación y oscuridad a 24⁰C durante 5 horas. El inóculo formado se diluye con
preinóculo hasta obtener 0,1 de absorbancia.
Se dispone el ensayo en una microplaca negra de 96 pocillos de la siguiente
manera:

DCP Preinóculo Solución Inóculo

(1,25 - 2,5 - 5 - 10 - 20 - 40 ppm) II, III, IV 0,1 abs

Control - 160 µL 20 µL 20 µL 0 µL

Control + 0 µL 160 µL 20 µL 20 µL

Bioensayos 160 µL 0 µL 20 µL 20 µL

Tabla 6: Ensayos toxicológicos con 3,5-diclorofenol.

Se expone el microorganismo a 3,5-DCP durante 16 horas, incubando en

oscuridad y agitación. Pasado ese tiempo, se añade el marcador celular en los
términos determinados en su optimización y se mantiene en oscuridad y
agitación el tiempo fijado, en el cual, la resazurina se reduce, pasando a su
14
estado fluorescente, en función del microorganismo vivo persistente en el
medio. Después de este periodo, se mide su señal de fluorescencia en el
Fluoroskan Ascent FL microplate luminometer con las características del
software citadas.
Las modificaciones propuestas del método normalizado anterior se detallan en
el apartado “resultados y discusión”, a fin de justificar cada cambio sugerido con
su fundamento particular.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

3.1. Optimización de las incorporaciones al procedimiento de la norma.

3.1.1. Crecimiento de la bacteria en microplaca de 96 pocillos.

Como se ha comentado en materiales y métodos, se somete a cambios

de ambiente al microorganismo con el fin de incitar su crecimiento hasta
aumentar su concentración 60 órdenes en un periodo de 16 horas. En dicho
periodo, existen evidencias reflejadas en la literatura científica que abogan por
considerar que se alcanza el estado estacionario del cultivo y, con ello, la
saturación de biomasa en el pocillo (Díaz, et al., 2011, Fernández, et al., 2012,
La Rosa, et al., 2016).
Destacar que los resultados expuestos en cada prueba comparativa
subsiguiente fueron cosechados el mismo día, mediante el mismo inóculo y bajo
el mismo procedimiento y condiciones.

Volumen del caldo de cultivo.

En esta parte, se analiza la influencia del volumen del que dispone el
microorganismo para su desarrollo.
Abs 24ºC 200µL Abs 24ºC 150µL
0,300 0,300
0,250 0,250
0,200 0,200
0,150 0,150
0,100 0,100
0,050 0,050
0,000 0,000
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
Abs inicial Abs inicial
Figura 1: Modificación del volumen del caldo de cultivo.

Como se puede apreciar, una disminución del caldo perjudica el crecimiento. El

hecho de que el espacio y la cantidad total de nutrientes en el pocillo sean
menores hace que se interrumpa el crecimiento prematuramente, llegando a
absorbancias más bajas.

Además, si cotejamos las diferentes Abs iniciales de microorganismo se

advierte una tendencia clara: al aumentar la Abs inicial, disminuye el tamaño del
inóculo recogido después de las 16 horas. Esto se explica porque mayor
número de individuos de partida acaban prematuramente con los nutrientes,
15
además de contaminar rápidamente el medio con las sustancias de desecho
(ROS) procedentes de su propio metabolismo, por lo que la biomasa máxima a
la que llegan es menor.
También podemos apreciar como el descenso, respecto a las Abs iniciales, es
más acusado en el caso de 150 µL.
Estas apreciaciones sugieren mantener 200µL como volumen del caldo y la
mínima absorbancia de microorganismo ensayada: Abs=0,01.

Temperatura.
Este apartado se refiere a la temperatura a la que dejaremos el
microorganismo incubando las 16 horas después de su adición en la
microplaca.
Abs 24ºC 200µL Abs 28ºC 200µL
0,300 0,300
0,250 0,250
0,200 0,200
0,150 0,150
0,100 0,100
0,050 0,050
0,000 0,000
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
Abs inicial Abs inicial
Figura 2: Variación de la temperatura.

Al aumentar la temperatura, se aprecia un mayor crecimiento en cada Abs

inicial, sin embargo, los valores alcanzados no permiten concebir que se vaya a
lograr el objetivo de crecimiento por esta vía.
Asimismo, es conveniente considerar la dificultad del oxígeno en permanecer a
un nivel óptimo en el medio debido a la reducida interfase con el ambiente que
aporta la superficie del pocillo, lo que se agrava con el aumento de la
temperatura. Por ello, se prosigue con la temperatura reflejada en la norma de
24ºC
Medio de cultivo.
En este punto, se contrasta el crecimiento producido con los medios de
cultivo mencionados en materiales y métodos: preinóculo y N.B.
Abs 24ºC 200µL Preinóculo Abs 24ºC 200µL N.B.
0,300 0,300
0,250 0,250
0,200 0,200
0,150 0,150
0,100 0,100
0,050 0,050
0,000 0,000
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
Abs inicial Abs inicial
Figura 3: Crecimiento aplicando diferente medio de cultivo.

16
Al añadir N.B., aumentan ligeramente las absorbancias pertenecientes a las
Abs iniciales más bajas, manifestando un comportamiento opuesto las Abs
iniciales más altas. Como se observa en la Figura 3, no se obtiene un
crecimiento mayor, por lo que se mantiene como medio de cultivo preinóculo.
Periodo de conservación del cultivo madre.
En esta parte se pretende confrontar los datos obtenidos a partir del
microorganismo de un cultivo madre sembrado el día anterior y de otro cultivo
conservado en la nevera durante una semana, ambos elaborados bajo el mismo
procedimiento y condiciones.
Abs 24ºC 200µL - 24 horas Abs 24ºC 200µL - 7 días
0,3 0,3
0,25 0,25
0,2 0,2
0,15 0,15
0,1 0,1
0,05 0,05
0 0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
Abs inicial Abs inicial
Figura 4: Variación del periodo de conservación del cultivo madre.

Respecto a nuestro propósito de crecimiento, los valores no muestran un

aumento sustancial de un periodo a otro. De esta manera, se permite organizar
ensayos posteriores ya sea con placas Petri obtenidas del día anterior como
conservadas en la nevera de hasta un periodo de una semana.
Por todo lo aclarado en este apartado, se desiste en el intento de alcanzar el
factor 60 indicado en la norma, ya que, en el mejor de los casos, únicamente se
alcanza un aumento cercano a 30 veces la Abs inicial. Para futuros ensayos se
considerarán las siguientes condiciones:

o Volumen del caldo de cultivo: 200µL.

o Abs inicial a ensayar del microorganismo: 0,01.
o Temperatura de incubación: 24ºC.
o Medio de cultivo: Preinóculo.
o Periodo óptimo de conservación del cultivo madre: Hasta una semana.

3.1.2. Optimización del marcador de viabilidad celular: Resazurina.

En este punto, se consideran las conclusiones alcanzadas a través de
diversos ensayos realizados modificando alguna de sus condiciones. Como se
ha mencionado anteriormente, el marcador permite realizar tanto medidas de
absorbancia como fluorimétricas.
Ensayo de absorbancia.
Para comprobar qué medida es más útil, se programa un ensayo de
absorbancia según las indicaciones plasmadas en materiales y métodos.

17
La Figura 5 evidencia una Abs 150 ppm 300 ppm
disminución de resazurina a medida 1,2
que avanzamos en el aumento de 1,15
Abs inicial. Esto corresponde a lo 1,1
esperado, ya que, un mayor tamaño 1,05
de inóculo provoca mayor reducción 1
de resazurina a resorufina. En cuanto 0,95
0,9
a las dos concentraciones de
0,85
marcador, indican que al aumentar la 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
cantidad de resazurina, la pendiente Abs inicial
resultante es menor. Figura 5: Medición de resazurina mediante
absorbancia.
Ensayos de fluorescencia.

Debido al inconveniente de no poseer el filtro adecuado para medir en

el fotómetro el producto resorufina, unido a que varias publicaciones científicas
[O'Brien, et al., 2000] y fichas técnicas de productos con resazurina reconocen a
la fluorescencia como propiedad preferible (mayor sensibilidad), el resto del
presente documento se centra en vislumbrar sus características fluorimétricas
interpretando los resultados cosechados en múltiples ensayos estructurados
según el modo de actuación mencionado en materiales y métodos.

Estabilidad de controles negativos.

Consiste en realizar una prueba sin microorganismo a fin de averiguar

el grado de fluorescencia que provoca cada componente por separado y la
estabilidad de la señal recogida a lo largo del tiempo. Con ello, se pretende
evitar sobreestimaciones de URF o falsos positivos debido a posibles
injerencias del medio en el proceso de reducción del marcador.
Se entregan tres ensayos realizados a diferentes concentraciones de
resazurina: 10, 20 y 50 ppm (Consultar ANEXO 1).

URF AGUA PREINÓCULO N.B. 3,5-DCP 10 ppm

120

100

80

60 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 (min)
Figura 6: Reducción de resazurina con componentes del medio a ensayar.

Se observa la tendencia de N.B. de aumentar la señal de fluorescencia (mayor

cantidad de marcador reducido en el periodo de tiempo ensayado), sobre todo a
bajas concentraciones de marcador, lo que provoca sobreestimaciones de señal
y un blanco de fondo con pendiente positiva poco recomendable. En estos
ejemplos y en los posteriores ensayos se hace evidente el efecto “quenching” o
enfriamiento, aclarado en materiales y métodos, que explica la menor magnitud
alcanzada de la fluorescencia al aumentar la concentración de marcador. Por
18
otro lado, existe la percepción de que mayor cantidad de resazurina atenúa la
pendiente de la señal del blanco favoreciendo su estabilidad a lo largo del
periodo de medición.
Influencia del tiempo de incubación.

Debido a que el microorganismo pasa por diferentes fases en su

crecimiento, es necesario esclarecer el momento idóneo de interacción con el
marcador para que la señal obtenida sea representativa de su presencia. Para
ello, se disponen una serie de ensayos replicados en varias concentraciones de
resazurina a diferentes tiempos de incubación según la práctica del apartado
2.4.3.

5 horas de incubación.

URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 40 ppm

230
210
190
170
150
130
110
90
70
50 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
Figura 7: Señales de fluorescencia de diversas absorbancias de P. putida
con una incubación previa de 5 horas.

Se observa que todas las líneas poseen una trayectoria ascendente con
una pendiente constante, además, sus posiciones relativas unas respecto de
otras son correctas. A las 5 horas de incubación, el microorganismo está en
plena fase exponencial, con el metabolismo muy activo y una gran actividad
FPR (formación de NADPH), lo que favorece una relación fluorescencia-
viabilidad celular más sensible y robusta. Dirigirse al ANEXO 2 para ver el resto
de concentraciones de resazurina ensayadas.

12 horas de incubación.

URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 40 ppm

230
210
190
170
150
130
110
90
70
50 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
Figura 8: Señales de fluorescencia de diversas absorbancias de P. putida
con una incubación previa de 12 horas.

19
 Al observar las dos señales teóricamente más bajas (blanco y 0,01 Abs)
vemos que están invertidas sus posiciones en las diferentes concentraciones de
marcador. Esto nos induce a pensar que, en estos tiempos de incubación,
donde el microorganismo se encuentra en plena fase estacionaria, es difícil
discernir entre absorbancias bajas ya que, en este contexto (menos actividad
deshidrogenasa), el proceso de reducción se hace más desfavorable y, por ello,
menos representativo de la cantidad celular presente en el medio.
En la gráfica de 500 ppm (consultar ANEXO 3), el blanco avanza superando a
tres de las cinco absorbancias de P. putida existentes, reflejando que
concentraciones altas no son recomendables.

24 horas de incubación.

URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 40 ppm

85
80
75
70
65
60
55
50
45
40 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
Figura 9: Señales de fluorescencia de diversas absorbancias de P. putida
con una incubación previa de 24 horas.

Como se puede apreciar, algunas señales presentan trayectorias

ascendentes irregulares, con vago carácter lineal a diferencia de las anteriores.
Además, su orden relativo está completamente desvirtuado, sobre todo a 40 y
20 ppm de marcador. En este caso, P .putida está en fase de muerte celular,
consecutiva a la fase estacionaria, resultando en un enorme declive de su
metabolismo. De una manera clara, se manifiesta que el aumento de resazurina
favorece que las señales tiendan a colocarse correctamente unas respecto de
otras, quedando incorrectamente el blanco como la señal de mayor magnitud a
40 y 20 ppm mientras que es superado satisfactoriamente por el resto de
señales a 150 ppm de marcador. Esto puede deberse a que mayor cantidad de
resazurina aumenta la actividad de la diaforasa, como se ha demostrado in vitro
[Catomeris, et al., 1988], acelerando ciertos mecanismos metabólicos que
incidan en la reducción de marcador y permitan reforzar el valor relativo que
debe ocupar en función del tamaño del inóculo.
Contribución de la temperatura.

Debido a la discordancia de las señales obtenidas en el ensayo de 24

horas de incubación, se repite el procedimiento en las mismas condiciones
salvo que, esta vez, a 35ºC en lugar de los 30ºC habituales.

20
 URF Blanco 0,01 0,1 0,15 0,2 40 ppm
230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
Figura10: Aumento de la temperatura a 35ºC en el periodo de medición.

Las señales presentan un orden relativo que continúa siendo erróneo por la
deficiente actividad metabólica que posee el microorganismo en fase de muerte
celular. Esta vez, sin embargo, superan el blanco notoriamente debido al
aumento de su pendiente, lo que puede explicarse por el incremento de la
temperatura. La actividad de la diaforasa es de primer orden respecto a la
resazurina a concentraciones bajas de esta (Catomeris, et al., 1988), por lo
tanto, incrementar la temperatura debe acarrear un aumento de la velocidad de
reacción y la obtención de señales que presenten un desarrollo más rápido en
el aumento de su fluorescencia. (Ver ANEXO 5).
3.1.3 Consideraciones en la optimización del método.
A la vista de los resultados obtenidos, se discute la concentración de
resazurina más adecuada para emplear en este tipo de ensayos.
Por un lado, cuando el metabolismo del microorganismo está en fase
estacionaria y los resultados tienden al desorden lógico, parece que una mayor
concentración provoca una mejora en la trayectoria y su colocación relativa.
Por otro lado, concentraciones altas producen perturbaciones iniciales en las
trayectorias de forma que la señal va avanzando con un carácter menos lineal.
Además, el efecto “quenching” se manifiesta con mayor intensidad en
adicciones mayores lo que produce subestimaciones y una distancia menor
entre la señal más baja y más alta. Aproximadamente, en el intervalo 150-
50ppm el impacto es menor y permite obtener gráficas de concentraciones de
resazurina diferentes más afines. Sin embargo, a concentraciones bajas (20-
5ppm) el efecto parece invertirse: aumenta la señal con el aumento de
resazurina en el medio. Se aportan dos ensayos, efectuados según el
procedimiento del apartado 2.4.3. y tras 24 horas de incubación, que son
ejemplo de ello.

URF Blanco 0,01 0,1 0,15 0,2 5 ppm

130
120
110
100
90
80
70
60 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)

21
 URF Blanco 0,01 0,1 0,15 0,2 10 ppm
130
120
110
100
90
80
70
60 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
URF Blanco 0,01 0,1 0,15 0,2 20 ppm
130
120
110
100
90
80
70
60 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
Figura 11: Evidencia de ascenso de señal de fluorescencia
con aumento de resazurina.

En esta primera prueba la temperatura en el periodo de medición fue 30ºC. La

apariencia inverosímil que presentan los resultados del ensayo es debido a que
el microorganismo fue incubado 24 horas en preinóculo y su metabolismo está
muy mermado.
Se ofrecen los resultados de un ensayo de condiciones idénticas salvo la
temperatura aplicada: 35ºC (ANEXO 6). Como se puede observar en ambos,
las señales alcanzan valores superiores de fluorescencia a mayor cantidad de
marcador en el intervalo 20-5 ppm: su comportamiento es antagónico en un
entorno lo suficientemente diluido.

Tras revelar las particularidades del sistema que se pretende optimizar, se

indican las modificaciones realizadas del procedimiento reflejado en la norma:
o Concentración resazurina:
Se advierte que por debajo de 20 ppm se suprime el efecto de
enfriamiento y los valores de fluorescencia son más altos. Se ensaya 20
y 10 ppm adicionando el marcador al finalizar la exposición al tóxico e
inmediatamente antes del periodo de medición del fluorímetro.

o Incubación:
Se necesita una gran inercia metabólica para reducir la resazurina de
manera reproducible y cuantitativa por lo que se incuba el
microorganismo en unos 5 mL a 24ºC de N.B. durante 3 horas para
tenerlo en plena fase exponencial.

o Absorbancia de microorganismo:
Se ensayan valores de 0,05 abs/pocillo, en lugar de 0,01 abs/pocillo,
para promover un metabolismo global más robusto que provoque una
reducción de marcador mayor, enfatizando así las desigualdades entre
señales de una manera más eficiente.

22
 o Método de adición del toxico en microplaca:
A partir de una disolución de 80 ppm de 3,5-diclorofenol se procede a
realizar su dilución en cadena mediante preinóculo de una fila a otra de
la microplaca conforme a la práctica manifestada en “procedimientos en
microbiología clínica” (Sociedad Española de Enfermedades
Infecciosas). De esta manera se pretende manejar menores cantidades
de disoluciones, facilitando el proceso y disminuyendo posibles
contaminaciones derivadas del manejo de abundante material.

o Periodo de medición en el fluorímetro:

El proceso de medición se extiende como mínimo a 2,5 horas debido a la
cinética lenta de la reducción de resazurina.

o Exposición al tóxico:
La exposición al tóxico del microorganismo se reduce a 1 hora, en lugar
de las 16 horas de la norma, más el tiempo de medición en el fluorímetro
que hace un total de 3,5 horas debido al rápido deterioro que
experimenta su metabolismo con el tiempo en presencia de 3,5-DCP.

3.2. Resultado de la optimización: Ensayo con modificaciones

incorporadas.

URF 10 ppm
220
200
180
160
140
120
100
80
60 TIEMPO
0 20 40 60 80 100 120 140 (min)
URF Control-Sinbicho 40ppm 20ppm 10ppm 20 ppm
5ppm 2,5ppm 1,25ppm Control+sintoxico
220
200
180
160
140
120
100
80
60 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 (min)
Figura 12: Resultados obtenidos aplicando las modificaciones propuestas.

23
 Se alarga la medición del ensayo hasta 2 horas y media ya que, si bien
se consiguen señales con un gran crecimiento exponencial, este no empieza a
aparecer notoriamente hasta los 100 minutos de lectura. Las diferentes señales
están colocadas correctamente unas respecto de otras, incluido el blanco que
presenta un comportamiento paradigmático.

3.2.1. Cálculo de la toxicidad: 3,5-DCP sobre Pseudomonas putida.

El tratamiento de datos expuesto en el punto 2.4.3. refleja la

elaboración de un modelo de gráfica en el que, seleccionando unos tiempos
concretos del periodo de medición, se obtendrá una serie de datos de
fluorescencia asociada a cada uno de ellos. La correlación entre los valores
propios de cada tiempo de medición revelará qué momento del periodo de
medición es el más adecuado para tomar los valores fluorimétricos.
En este caso, seleccionamos los tiempos de medición 100, 105, 110, 115 y 120
minutos. Previamente, en cada serie de datos, se resta su propio control - (sin
inocular) a cada valor, obteniéndose la medida neta del efecto de reducción de
la resazurina producido por P. putida. Los valores obtenidos son tomados para
realizar los cálculos posteriores.
Para hallar el porcentaje de inhibición (%INH) respecto al control+ (sin tóxico)
se aplica la fórmula: %INH= 100 x (V0 – Vtox)/V0
Donde V0 es el valor perteneciente al control+, es decir, la medida máxima de
fluorescencia que se alcanza. Vtox representa cada valor correspondiente a una
determinada concentración de 3,5-DCP.
Mediante los %INH para cada concentración de tóxico de cada tiempo de
medición, se procede al cálculo de EC50 y EC20 que representan las
concentraciones de tóxico necesarias para causar el 50% y el 20% de inhibición
de la actividad enzimática propia del microorganismo. Para ello, empleamos el
programa CompuSyn que hace el ajuste de los datos a la ecuación del efecto
medio (Chou 1976) manejada en bioquímica para describir procesos como la
cinética Michaelis-menten.
Los resultados de EC50 y EC20 obtenidos se muestran en las siguientes tablas:
10 ppm resazurina 20 ppm resazurina
Tiempo EC50 EC20 Tiempo EC50 EC20
m r m r
(min) (ppm) (ppm) (min) (ppm) (ppm)
100’ 29,54 1,18 0,97 9,10 100’ 27,31 1,78 0,98 12,53
105’ 28,18 1,20 0,98 9,00 105’ 27,63 1,34 0,99 9,86
110’ 27,78 0,93 0,97 6,29 110’ 24,49 1,20 0,99 7,73
115’ 23,44 0,91 0,98 5,13 115’ 21,42 1,21 0,99 6,83
120’ 20,03 0,96 0,99 4,75 120’ 19,86 1,16 0,99 5,99
Tabla 7: Valores de toxicidad obtenidos en diferentes tiempos de medición.

Se observa una disminución de EC50 y EC20 significativa a mayor tiempo de

medida debido al aumento del efecto toxicológico con el tiempo de exposición.
Es necesario destacar que los valores obtenidos en los diferentes tiempos
pueden considerarse igualmente válidos ya que dependerán significativamente
del tiempo que escojamos. En este caso, a la vista de los resultados obtenidos,
se pueden considerar apropiados los valores a partir de 100 minutos de
medición.
En el ANEXO 7 se facilitan las gráficas dosis-efecto que representan el efecto
inhibitorio en el ‘eje Y’ y la dosis en el ‘eje X’.
24
4. CONCLUSIONES.

Las modificaciones de varios parámetros influyentes en el crecimiento

de Pseudomonas putida nos indican lo siguiente:

 La disminución de volumen del caldo en el pocillo ocasiona un menor

rendimiento en la producción total de biomasa.

 El aumento de la temperatura de incubación al valor ensayado de 28ºC

favorece el crecimiento, sin embargo, no aumenta significativamente.

 El medio de cultivo reflejado en la norma UNE-EN ISO 10712 limita el

crecimiento de P. putida. Reemplazarlo por un caldo con mayores
cualidades nutritivas no permite alcanzar mayores cotas de crecimiento.

 Se comprobó que la edad del inóculo en placa Petri de hasta una semana
no afecta a sus propiedades.

Finalmente, no se alcanzó el requerimiento de incrementar 60 veces la

concentración de P. putida en el periodo de ensayo.
El estudio de la propiedad fluorimétrica de la resazurina, revela lo siguiente:

 A temperaturas mayores de 30ºC las señales manifiestan una escalada

significativamente mayor a tiempos menores de medición.

 Se alcanzan valores de fluorescencia menores al aplicar concentraciones

de marcador altas (>40 ppm), cualidad que se invierte a concentraciones
bajas (<20 ppm).

Consideraciones generales en la optimización del método:

 El método de medición deberá ser continuo, monitorizando el proceso a lo

largo del intervalo de tiempo estipulado, a fin de poder evaluar la
trayectoria de las señales recogidas.

 Se debe asegurar que el cultivo bacteriano empleado se encuentre en

plena fase exponencial de crecimiento, aportando un ambiente óptimo
durante la incubación para incrementar su actividad deshidrogenasa.

 El tamaño del inóculo de Pseudomonas pútrida a ensayar deberá ser

mayor a la indicada en la norma. El intervalo en términos de biomasa
entre pocillos con diferente cantidad de tóxico debe ser lo
suficientemente amplio como para poder ver diferencias entre señales de
fluorescencia originadas en el proceso de reducción del marcador.

 Debido al débil crecimiento que puede experimentar P. putida en el pocillo

se debe reducir su incubación con el tóxico drásticamente respecto a la
sugerida en la norma. La exposición prolongada al tóxico afectará a su
capacidad de reducción de resazurina y no se lograrán señales
representativas.

25
5. BIBLIOGRAFÍA.
Acevedo, J.J., Angeles, J.S. (2013). ‘Modelos in vitro para la evaluación y
caracterización de péptidos bioactivos’. Bioactividad de péptidos derivados de
proteínas alimentarias, Barcelona: OmniaScience, Capítulo 2, 29- 82.

Anoopkumar-Dukie, S., Carey, J.B. (2005) ‘Resazurin assay of radiation

response in cultured cells’. Brit. J. Radiol. 78, 945-947.

Batchelor, R.H., Zhou, M. (2004) ‘Use of cellular glucose-6-phosphate

dehydrogenase for cell quantitation: applications in cytotoxicity and apoptosis
assays’. Analytical biochemistry 329(1), 35-42.

Brower, H. (1991) ‘Testing for Chemical Toxicity Using Bacteria’. Journal of

Chemical Education Volume 68, Núm. 8.

Cantón, R., García, J.E. (2000) ‘Métodos básicos para el estudio de la

sensibilidad a los antimicrobianos’. Recomendaciones de la Sociedad Epañola
de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Ed. by Picazo, J.J. [online]
disponible en http://www.seimc.org

Catomeris, P., Thibert, R. J. (1988) ‘Study and Optimization of the

Resazurin/Diaphorase System’. Microchemical Journal Volume 38, Issue 3,
Pages 390-398.

Chavarría, M., Nikel, P.I. (2013) ‘The Entner–Doudoroff pathway empowers

Pseudomonas putida KT2440 with a high tolerance to oxidative stress’.
Environmental microbiology Volume 15, Issue 6, Pages 1772–1785.

Diaz, C. (2011) Tesis de doctorado: Adherencia y colonización

de Pseudomonas fluorescens sobre sustratos sólidos: influencia de la
topografía y composición química de la superficie. [online] disponible en
http://hdl.handle.net/10915/2685

Dong-ju, K., Seung-gun, C. (2012) ‘Relation of microbial biomass to counting

units for Pseudomonas aeruginosa’ African Journal of Microbiology Research
vol. 6(21), 4620-4622.

Escobar, M., Rivera, A. (2010). ‘Estudio comparativo de los métodos de

resazurina y MTT en estudios de citotoxicidad en líneas celulares tumorales
humanas’. Vitae vol. 17. Núm. 1, 67-74.

Espejo, J. (1977) ‘Estudio comparado de tres metodos para catalogar la calidad

microbiológica de la leche cruda en zonas de clima cálido’. Archivos de
zootecnia, Vol. 26, núm. 103, 271-279.

Fernández, I. (2012) Tesis de doctorado: Estudio del metabolismo de

polihidroxialcanoatos en Pseudomonas putida: implicaciones fisiológicas y
aplicaciones en el desarrollo de bioplásticos funcionalizados [online] disponible
en http://eprints.ucm.es/16903/

Fields, R., Lancaster, M. (1993) ‘Dual-attribute continuous monitoring of cell

proliferation/cytotoxicity.’ Am Biotechnology Lab vol. 11, 48-50.

26
Figueredo, F., Núñez, P.N. (2010) ‘Pseudomona putida como elemento
biológico de un sensor inespecífico para la determinación de toxicidad aguda en
agua’ Ibersensor 2010, 9-11.

Figueredo, F., Ximena C.A. (2015) ‘A new P.putida instrumental toxicity

bioassay’ Environ monit Assess, 187:294.

Fung, D., Miller, R. (1973) ‘Effect of dyes on bacterial growth’. Applied

Microbiology Vol. 25, 793–799.

Giró, M., Carrillo, N.(2006) ‘Glucose-6-phosphate dehydrogenase and

ferredoxin-NADP(H) reductase contribute to damage repair during
the soxRS response of Escherichia coli’. Microbiology Research 152:1119–
1128.

Guerin, T., Mondido, M. (2001) ‘Application of resazurin for estimating

abundance of contaminant-degrading micro-organisms’. Letters in Applied
Microbiology 2001, 32, 340-345.

Jiménez, J.I., Miñambres, B. (2002) ‘Genomic analysis of the aromatic catabolic

pathways from Pseudomonas putida KT2440’. Environmental
microbiology 4(12), 824-841.

Karakashev, D., Galabova, D. (2003) ‘A simple and rapid test for differentiation
of aerobic from anaerobic bacteria’. World Journal of Microbiology and
Biotechnology 19(3), 233-238.

La Rosa, R., Behrends, V. (2016) ‘Influence of the Crc regulator on the

hierarchical use of carbon sources from a complete medium in Pseudomonas’.
Environmental microbiology 18(3), 807-18.

Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R.M. (2009) ‘Fluorescent assay based on

resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial
biofilm’. Applied microbiology and biotechnology 82(4), 773-783.

McNicholl, B., McGrath, J. (2007) ‘Development and application of a resazurin-

based biomass activity test for activated sludge plant management’. Water
Research. vol. 41, 127–133.

Min, T., Kang, W. (2011) ‘Simple, quick and nondestructive method for
Brassicaceae seed viability measurement with single seed base using
resazurin’. Horticulture, Environment, and Biotechnology 52(3), 240-245.

Nakayama, G.R., Caton, M. C. (1997) ‘Assessment of the Alamar blue assay for
cellular growth and viability in vitro’. J. Immunol. Methods 204, 205–208.

Nikel, P. I., Chavarría, M. (2015) ‘Pseudomonas putida KT2440 Strain

Metabolizes Glucose through a Cycle Formed by Enzymes of the Entner-
Doudoroff, Embden-Meyerhof-Parnas, and Pentose Phosphate Pathways’. The
Journal of Biological Chemistry 290(43), 25920–25932.

O'Brien, J., Wilson, I. (2000) ‘Investigation of the Alamar Blue (resazurin)

fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity’. Eur. J.
Biochem. 267, 5421-5426.
27
Rasmussen, E., Nicolaisen, G. (1999) ‘Stability of resazurin in buffers and
mammalian cell culture media’. Vitro and Molecular Toxicology vol. 12, Issue 4,
195-202.

Rolón, M., Vega, C. (2006) ‘Development of resazurin microtiter assay for drug
sensibility testing of Trypanosoma cruzi epimastigotes’. Parasitology Research
volume 99, 103- 107.

Worthington Bioquemical Corporation (1999) Diaphorase Manual text [online]

disponible en http://www.worthington-biochem.com/dil/default.html

Yeom, J., Jeon, C. O. (2009) ‘Ferredoxin-NADP+Reductase from Pseudomonas

putida Functions as a Ferric Reductase’. Journal of Bacteriology 191(5), 1472–
1479.

Yunho, L., Peña-Llopis, S. (2005) ‘Expression analysis of the fpr (ferredoxin-

NADP+ reductase) gene in Pseudomonas putida KT 2440’. Biochemical and
Biophysical Research Communications 336 (2006) 1246-1254.

Zhang, H., Du, G. (2004) ‘Assay of mitochondrial functions by resazurin in vitro’.

Acta Pharmacologica Sinica 25: 385-389.

Zhu, A., Romero, R. (2009) ‘An enzymatic fluorimetric assay for glucose-6-
phosphate: application in an in vitro Warburg-like effect’. Analytical
biochemistry 388(1), 97-101.

Ziegler, V., Knaup, J. (2011) ‘Fluorescence detection and depletion of T47D

breast cancer cells from human mononuclear cell-enriched blood preparations
by photodynamic treatment: Basic in vitro experiments towards the removal of
circulating tumor cells’. Lasers Surg. Med. 42, 548–556.

28
ANEXO 1
Estabilidad de controles negativos

URF 20 ppm
AGUA PREINÓCULO N.B. 3,5-DCP
120

110

100

90

80

70

60 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 (min)
URF AGUA PREINÓCULO N.B. 3,5-DCP 50 ppm
120

110

100

90

80

70

60 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 (min)

29
ANEXO 2
5 horas de incubación

URF 8 0 ppm
Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2
230
210
190
170
150
130
110
90
70
50 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 1 5 0 ppm
230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)

Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 3 0 0 ppm

230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)

30
ANEXO 3
12 horas de incubación

URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 8 0 ppm

230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 3 0 0 ppm
230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 5 0 0 ppm
230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)

31
ANEXO 4
24 horas de incubación

URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 2 0 ppm

90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 8 0 ppm
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
URF Blanco 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 1 5 0 ppm
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)

32
ANEXO 5
Contribución de la temperatura

URF 2 0 ppm
Blanco 0,01 0,1 0,15 0,2
230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)

URF Blanco 0,01 0,1 0,15 0,2 8 0 ppm

230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)

33
ANEXO 6
Optimización del método: Ensayo adicional a 35ºC
URF Blanco 0,01 0,1 0,15 0,2 5 ppm
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
URF Blanco 0,01 0,1 0,15 0,2 1 0 ppm
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)
URF Blanco 0,01 0,1 0,15 0,2 2 0 ppm
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30 TIEMPO
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (min)

34
ANEXO 7
Curvas “dosis-efecto”

El eje Y (Fa) muestra el efecto en tanto por 1 y representa los %INH.

El eje X muestra la concentración del tóxico (3,5-DCP) en ppm.
Resultados cosechados en dos concentraciones de resazurina: 10 y 20 ppm.

10 ppm

20 ppm

35