TFG Síntesis de Disolventes Verdes para La Valorización de Residuos Agrícolas

TRABAJO FIN DE GRADO
GRADO EN QUÍMICA
SÍNTESIS DE DISOLVENTES VERDES

PARA LA VALORIZACIÓN DE RESIDUOS
AGRÍCOLAS
Alumna: María de los Santos Martín
Tutoras: Ana Sayago Gómez y Pilar del Rocío Franco Márquez
SEPTIEMBRE 2020
María de los Santos Martín Universidad de Huelva
Facultad de Ciencias Experimentales
RESUMEN
En el presente estudio se han sintetizado disolventes eutécticos profundos

naturales (NADES) para desarrollar un método de extracción de compuestos bioactivos
respetuoso con el medio ambiente. Los métodos tradicionales de extracción de
productos naturales a partir de biomasa tienen como inconvenientes principales el
consumo de disolventes orgánicos y el ser perjudiciales para el medio ambiente y los
seres humanos. Se ha desarrollado un método respetuoso con el medio ambiente para
la extracción de compuestos fenólicos con actividad antioxidante de residuos
industriales agroalimentarios, como son las hojas de arándano, mediante disolventes
eutécticos profundos naturales (NADES), con el fin de contribuir con su valorización
sostenible. Hasta el momento son escasos los estudios de extracción mediante este tipo
de disolventes en estas hojas.
Se ha realizado la extracción de compuestos bioactivos de las hojas de arándano a
partir de los disolventes sintetizados y se han estudiado los extractos obtenidos
mediante la determinación del contenido fenólico total y la actividad antioxidante.
Además, se ha realizado la caracterización de algunos de los NADES mediante un
estudio de RMN con el fin de comprobar que no se habían dado reacciones en el
proceso de síntesis. Se ha evaluado la relación entre la viscosidad y el porcentaje de
extracción mediante la caracterización de las propiedades fisicoquímicas y reológicas.
Y, por último, se ha evaluado el efecto de la temperatura, tiempo y relación sólido/liquido
mediante un diseño experimental de Box-Behnken y su posterior análisis (ANOVA) para
determinar las condiciones óptimas de extracción.
Tras la síntesis de los NADES obtenidos, en la mayoría de los casos se han
superado los rendimientos de extracción respecto al disolvente orgánico empleado
como referencia (MeOH 80%). Se ha realizado la optimización del proceso de extracción
de los NADES formados por ChCl:Ox (1:1) y La:AcNa:W (3:1:2) debido a que obtuvieron
una mayor concentración de polifenoles totales.
PALABRAS CLAVE: disolventes eutécticos profundos naturales, extracción,

polifenoles, antioxidante, antocianos, valorización, optimización.
ABSTRACT
In the present study, natural deep eutectic solvents (NADES) have been
synthesized to develop an environmentally friendly extraction method for bioactive
compounds. The main drawbacks of traditional methods of extracting natural products
from biomass are the consumption of organic solvents and are harmful to the
environment and humans. An environmentally friendly method has been developed for
the extraction of phenolic compounds with antioxidant activity from industrial agri-food
residues, such as blueberry leaves, using natural deep eutectic solvents (NADES), in
order to contribute to their sustainable recovery. So far there are few extraction studies
using this type of solvents in these sheets.
The extraction of bioactive compounds from the blueberry leaves has been carried
out from the synthesized solvents and the extracts obtained have been studied by
determining the total phenolic content and the antioxidant activity. Furthermore, the
characterization of some of the NADES has been carried out by means of an NMR study
to verify that no reactions had occurred in the synthesis process. The relationship
between viscosity and extraction percentage has been evaluated by characterizing the
physicochemical and rheological properties. And finally, the effect of temperature, time
and solid/liquid relationship has been evaluated by means of an experimental design by
Box-Behnken and its subsequent analysis (ANOVA) to determine the optimal extraction
conditions.
After the synthesis of the NADES obtained, in most cases the extraction yields have
been exceeded with respect to the organic solvent used as reference (MeOH 80%). The
optimization of the extraction process of the NADES formed by ChCl:Ox (1:1) and
La:AcNa:W (3:1:2) has been carried out due to the fact that they obtained a higher
concentration of total polyphenol.
KEYWORDS: natural deep eutectic solvents, extraction, polyphenols, antioxidant,

anthocyanins, valorization, optimization.
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS ................................................................................. 2
RESUMEN.................................................................................................................... 4
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 5
1.1. La Química Verde ............................................................................................ 5
1.2. Evolución de los extractantes........................................................................... 6
1.3. Aprovechamiento de residuos agrícolas: hojas de arándano ......................... 13
1.4. Compuestos bioactivos .................................................................................. 14
2. OBJETIVOS........................................................................................................... 17
3. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 18
3.1. Muestras ........................................................................................................ 18
3.2. Síntesis de NADES ........................................................................................ 18
3.3. Extracción de compuestos bioactivos ............................................................ 19
3.4. Determinaciones espectrofotométricas .......................................................... 19
3.4.1. Determinación de polifenoles totales ...................................................... 19
3.4.2. Determinación de la actividad antioxidante ............................................ 20
3.4.3. Determinación de antocianos totales ...................................................... 22
3.5. Caracterización de NADES ............................................................................ 23
3.5.1. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear ................................. 23
3.5.2. Estudio reológico .................................................................................... 23
3.5.3. Medidas de pH ....................................................................................... 24
3.6. Optimización del proceso de extracción ......................................................... 24
4. RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIÓN .............................................. 25
4.1. Síntesis de NADES ........................................................................................ 25
4.2. Extracción de compuestos bioactivos ............................................................ 26
4.2.1. Determinación de polifenoles totales ...................................................... 26
4.2.2. Determinación de la actividad antioxidante ............................................ 28
4.3. Caracterización de NADES ............................................................................ 30
4.3.1. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear ................................. 30
4.3.2. Estudio reológico .................................................................................... 31
4.3.3. Medidas de pH ....................................................................................... 31
4.4. Optimización del proceso de extracción ......................................................... 32
4.4.1. Optimización del proceso de extracción empleando ChCl:Ox ................ 35
4.4.2. Optimización del proceso de extracción empleando La:AcNa:W ............ 40
5. CONCLUSIONES .................................................................................................. 43
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 44
7. ANEXOS
-1-
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1.1. Mezcla eutéctica formada a partir de cloruro de colina

(aceptor de hidrógeno) y urea (donador de hidrógeno) ..….………..…..……9
Figura 1.2. Diagrama de fase para una mezcla eutéctica ……………....………....……....9
Figura 1.3. Estructura general de una mezcla eutéctica ...………………....……..……..12
Figura 1.4. Arándanos azules y arándanos rojos ...………………...….…………..……..13
Figura 1.5. Clasificación general de los compuestos fenólicos ...…….……………..…..16
Figura 3.1. Tubos Falcon con la mezcla de los componentes en baño ultrasonidos
a 50 °C ...………...……….………………...……………………………………18
Figura 3.2. Mecanismo de acción del reactivo de Folín-Ciocalteu …….…...……………19
Figura 3.3. Estructura química del ácido gálico (C7H6O5) ………………..………………20
Figura 3.4. Estructura química del reactivo de Folín-Ciocalteu (C10H5NaO5S) …...……20
Figura 3.5. Reacción entre el radical DPPH y la especie oxidante ………………..…….21
Figura 3.6. Estructura química de Trolox (C14H8O4) ………………..……..………………21
Figura 4.1. NADES obtenidos en el proceso de síntesis ……………………………..…..25
Figura 4.2. Representación gráfica de la recta de calibrado de polifenoles totales ...….26
Figura 4.3. Efecto de diferentes NADES sobre la eficiencia de extracción de polifenoles
totales en comparación con una mezcla de metanol/agua (80:20) ………..27
Figura 4.4. Representación gráfica de la recta de calibrado de actividad antioxidante..28
Figura 4.5. Efecto de diferentes NADES sobre la eficiencia de extracción de actividad
antioxidante en comparación con una mezcla de metanol/agua (80:20) ….29
Figura 4.6. Espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Ox …………………………………….....30
Figura 4.7. Relación entre la cantidad de polifenoles extraída (mg/g) y la viscosidad del
NADE (Pa s) …………………………………………………………………….31
Figura 4.8. Extractos de hojas de arándano con ChCl:Ox ………..……………………..32
Figura 4.9. Extractos de hojas de arándano con La:AcNa:W...…...……………………..32
Figura 4.10. Diagramas de Pareto estandarizados para el diseño 33 (ChCl:Ox) ….……35
Figura 4.11. Diagramas de superficie de respuesta (ChCl:Ox) ……………………….....38
Figura 4.12. Perfiles de valores predichos y desiderabilidad (ChCl:Ox) …………...……39
Figura 4.13. Diagramas de Pareto estandarizados para el diseño 33 (La:AcNa:W).……40
Figura 4.14. Diagramas de superficie de respuesta (La:AcNa:W) ……………………….41
Figura 4.15. Perfiles de valores predichos y desiderabilidad (La:AcNa:W) …….....……42
Figura 7.1. Mezclas que no formaron un líquido eutéctico
Figura 7.2. Espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Glic
Figura 7.3. Espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Ox
Figura 7.4. Espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Eg:W
Figura 7.5. Espectro de RMN 1H {13C} de La:Gly:W
Figura 7.6. Espectro de RMN 1H {13C} de La:AcNa:W
-2-
Tabla 1.1. Ventajas e inconvenientes de los disolventes alternativos: puntuación

arbitraria en escala de 1 a 5 ...………………………………...………………...8
Tabla 3.1. Variables y niveles del diseño experimental ………………...…............……24
Tabla 4.1. NADES sintetizados y utilizados en el proceso de síntesis.….........………25
Tabla 4.2. Concentración de polifenoles totales en cada extracto ..…....……...………26
Tabla 4.3. Concentración de actividad antioxidante en cada extracto ..….……………28
Tabla 4.4. Medidas de viscosidad, η, (Pa · s) ..…………………………..….…………31
Tabla 4.5. Valores de pH de los NADES sintetizados ……………….....….……………31
Tabla 4.6. Matriz del diseño experimental (33) y resultados de la optimización del
proceso de extracción empleando ChCl:Ox como extractante …………....33
Tabla 4.7. Matriz del diseño experimental (33) y resultados de la optimización del
proceso de extracción empleando La:AcNa:W como extractante ………...34
Tabla 4.8. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de polifenoles
totales mediante ChCl:Ox para el diseño 33 ………....................................36
Tabla 4.9. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de actividad
antioxidante mediante ChCl:Ox para el diseño 33 …..................................36
Tabla 4.10. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de antocianos
totales mediante ChCl:Ox para el diseño 33 ………....................................37
Tabla 4.11. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de polifenoles
totales mediante La:AcNa:W para el diseño 33 ………...............................40
Tabla 4.12. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de actividad
antioxidante mediante La:AcNa:W para el diseño 33 ….............................41
Tabla 7.1. Combinaciones con cloruro de colina como aceptor de hidrógeno
Tabla 7.2. Combinaciones con prolina como aceptor de hidrógeno
Tabla 7.3. Combinaciones con ácidos como aceptores de hidrógeno
Tabla 7.4. Combinaciones con betaína como aceptor de hidrógeno
Tabla 7.5. Combinaciones con glicina como aceptor de hidrógeno
-3-
RESUMEN
En el presente estudio se han sintetizado disolventes eutécticos profundos

naturales (NADES) para desarrollar un método de extracción de compuestos bioactivos
respetuoso con el medio ambiente. Los métodos tradicionales de extracción de
productos naturales a partir de biomasa tienen como inconvenientes principales el
consumo de disolventes orgánicos y el ser perjudiciales para el medio ambiente y los
seres humanos. Se ha desarrollado un método respetuoso con el medio ambiente para
la extracción de compuestos fenólicos con actividad antioxidante de residuos
industriales agroalimentarios, como son las hojas de arándano, mediante disolventes
eutécticos profundos naturales (NADES), con el fin de contribuir con su valorización
sostenible. Hasta el momento son escasos los estudios de extracción mediante este tipo
de disolventes en estas hojas.
Se ha realizado la extracción de compuestos bioactivos de las hojas de arándano a
partir de los disolventes sintetizados y se han estudiado los extractos obtenidos
mediante la determinación del contenido fenólico total y la actividad antioxidante.
Además, se ha realizado la caracterización de algunos de los NADES mediante un
estudio de RMN con el fin de comprobar que no se habían dado reacciones en el
proceso de síntesis. Se ha evaluado la relación entre la viscosidad y el porcentaje de
extracción mediante la caracterización de las propiedades fisicoquímicas y reológicas.
Y, por último, se ha evaluado el efecto de la temperatura, tiempo y relación sólido/liquido
mediante un diseño experimental de Box-Behnken y su posterior análisis (ANOVA) para
determinar las condiciones óptimas de extracción.
Tras la síntesis de los NADES obtenidos, en la mayoría de los casos se han
superado los rendimientos de extracción respecto al disolvente orgánico empleado
como referencia (MeOH 80%). Se ha realizado la optimización del proceso de extracción
de los NADES formados por ChCl:Ox (1:1) y La:AcNa:W (3:1:2) debido a que obtuvieron
una mayor concentración de polifenoles totales.
.
PALABRAS CLAVE: disolventes eutécticos profundos naturales, extracción,
polifenoles, antioxidantes, antocianos, valorización, optimización.
-4-
1. INTRODUCCIÓN
1.1. LA QUÍMICA VERDE
Los disolventes juegan un papel fundamental tanto en la industria química como en

la farmacéutica, razón por la cual suelen consumirse en grandes cantidades.
Generalmente, la mayoría son compuestos orgánicos volátiles (COV), los cuáles no son
recomendables desde el punto de vista de los objetivos de desarrollo sostenible porque
en muchos casos, son tóxicos y altamente contaminantes debido a su elevada
volatilidad y a que proceden de fuentes no renovables.
A raíz de los problemas de la contaminación ambiental y sus consecuencias, ya
sea la conservación del medio ambiente o el impacto en la salud humana, dentro de la
química surge una nueva corriente denominada Química Verde cuyo objetivo
fundamental es prevenir la contaminación, no remediarla, evitando el desperdicio o el
uso indiscriminado de materias primas no renovables, así como el empleo de materiales
peligrosos o contaminantes.
Los planteamientos de la Química Verde se regulan por un protocolo que consta de
12 principios (Anastas y Warner 1998):
1. Prevención. Es mejor prevenir la formación de residuos que tratar los generados.
2. Eficiencia atómica. Maximizar la incorporación en el producto final de los materiales
empleados en el proceso.
3. Síntesis menos peligrosas. Los métodos de síntesis deberán ser diseñados para
utilizar y generar productos de baja o nula toxicidad, tanto para la salud humana
como para el medio ambiente.
4. Productos más seguros. Diseño de productos que mantengan su eficacia funcional
y se reduzca su toxicidad.
5. Disolventes más seguros. Evitar en la medida de lo posible el uso de sustancias
auxiliares como disolventes y agentes de purificación, procurando su inocuidad.
6. Eficiencia energética. Reducir la demanda energética y realizar la síntesis,
mientras sea posible, en condiciones ambientales de presión y temperatura.
7. Uso de fuentes renovables. La materia prima debe ser preferiblemente renovable
en lugar de agotable, siempre que sea técnica y económicamente viable.
8. Evitar derivados. Evitar, siempre que sea posible, la formación de derivados:
grupos de bloqueo de protección/desprotección modificación procesos
físicos/químicos, etc.
9. Uso de catalizadores. Emplear catalizadores lo más selectivos posibles en lugar
de reactivos estequiométricos.
10. Productos biodegradables. Diseño de productos que al finalizar su función no
persistan en el medio ambiente.
11. Control a tiempo real de la contaminación. Desarrollo de técnicas analíticas para
el control de los procesos químicos.
12. Prevención de accidentes. Elección de sustancias y condiciones de operación, con
el objetivo de minimizar el riesgo de accidentes, incluyendo las emanaciones,
explosiones e incendios.
-5-
1.2. EVOLUCIÓN DE LOS EXTRACTANTES
Los disolventes son ampliamente utilizados como medios de reacción y en los

procesos de extracción y purificación. Durante muchos años, se han utilizado los COV
formados principalmente por alcoholes y derivados petroquímicos de bajo peso
molecular, que presentan a menudo inconvenientes como toxicidad, inflamabilidad y
volatilidad y, en muchos casos, escasa biodegradabilidad (Conceic 2020). Por lo que los
efectos a corto y largo plazo sobre el medio ambiente son muy perjudiciales. Además,
muchos de ellos presentan riesgos tanto para el medio ambiente como para la salud
humana, especialmente por su volatilidad. Es por ello que, una de las áreas más
importantes de la Química Verde es la eliminación o sustitución por disolventes no
peligrosos, los cuales deben cumplir con diferentes criterios referentes a su
disponibilidad, biodegradabilidad, reciclabilidad, no toxicidad, y no inflamabilidad, entre
otros. Entre los disolventes tradicionales que presentan estos riesgos se encuentran:
metanol, etanol, isopropanol, acetona, hexano, acetato de etilo y ácido acético. Es por
ello que, se han desarrollado reacciones que se llevan a cabo sin disolventes, y también
disolventes como alternativa a los COV (Doria Serrano 2009; Anastas y Eghbali 2010).
El agua es la molécula más abundante del planeta y puede ser considerada como
el disolvente universal dado su precio, disponibilidad, toxicidad, inflamabilidad y su
impacto medioambiental. Pero sus limitaciones en cuanto a la solubilidad de muchos
compuestos orgánicos, la imposibilidad de ser usada como disolvente cuando se utilizan
catalizadores o sustratos que puedan sufrir procesos de hidrólisis, así como, su difícil y
cara purificación cuanto está contaminada por compuestos orgánicos, hace que su uso
sea limitado.
Los fluidos supercríticos (FSC) son otra alternativa a los disolventes orgánicos
tradicionales. Son sustancias que se han calentado y comprimido simultáneamente por
encima de sus puntos críticos. Los FSC comunes se generan a partir de agua, dióxido
de carbono, metano, metanol, etanol, o acetona. El dióxido de carbono supercrítico
(scCO2) es uno de los más utilizados debido a su versatilidad, seguridad y facilidad de
manipulación. La importancia de los FSC y particularmente del scCO2 se debe
fundamentalmente al cambio de estado que se produce al enfriar el recipiente o al
reducir la presión. Por encima de los puntos críticos, el CO2 será un líquido en el que se
puedan realizar reacciones y, por debajo, será un gas. Modificando la presión y la
temperatura en valores alrededor del punto crítico se producen reacciones de interés
industrial, como por ejemplo las utilizadas para la obtención de café descafeinado y la
sustitución del percloroetileno en la limpieza en seco.
Otra alternativa son los sistemas bifásicos fluorados (FBS), en los que los enlaces
carbono-hidrógeno se han sustituido, total o parcialmente, por enlaces carbono-flúor
(Gladysz, Curran y Horvath 2004). La fortaleza de este enlace les confiere estabilidad
tanto térmica como química, son no inflamables, inertes y no tóxicos, pudiendo ser
empleados en un rango amplio de temperaturas y condiciones de reacción. Su
miscibilidad con el resto de disolventes orgánicos y con agua es dependiente de la
temperatura. Cuando se calientan, forman un solo medio, lo que permite que la reacción
prosiga. Al enfriar se separan la fase orgánica y el disolvente fluoroso, simplificando el
proceso de purificación. Así, en una mezcla que contiene una fase orgánica y otra
fluorosa, la reacción catalítica homogénea se lleva a cabo a elevada temperatura y la
separación bifásica del catalizador y el producto a baja temperatura. Se han utilizado en
catálisis enzimática, síntesis de moléculas pequeñas a gran escala, separación de
biomoléculas, preparación de nanomateriales, etc. Sin embargo, limitaciones como la
escasa capacidad para disolver sustratos, elevado precio y persistencia en la atmósfera
hacen que su expansión sea muy reducida.
-6-
Los líquidos iónicos (LIs) son sales con bajo punto de fusión, siendo líquidos a
temperatura ambiente (Earle y Seddon 2002). Están formados por cationes orgánicos
grandes, como anillos imidazolio y piridinio y contraiones poco coordinantes como son
hexafluorofosfato (PF6-), tetrafluoroborato (BF4-), nitrato (NO3-) y bromuro (Br-), entre
otros. La adición de dióxido de carbono presurizado en una mezcla orgánica lo
transforma en un líquido iónico, generando, in situ, un disolvente más seguro. Al liberar
la presión se invierte el fenómeno y el líquido iónico se vuelve a transformar en la mezcla
original, eliminando así por completo el disolvente y los tediosos pasos de purificación y
extracción. Sus propiedades, tales como la estabilidad térmica, insignificante presión de
vapor, no volatilidad, no inflamabilidad en diversas condiciones de operación y buena
solubilidad para un amplio rango de compuestos orgánicos, inorgánicos,
organometálicos y también gases, los hace versátiles y buenos sustitutos a los
disolventes orgánicos comunes. Los líquidos iónicos como medios de reacción son
selectivos, permiten rendimientos de reacción más altos y pueden reutilizarse, lo que
permite clasificarlos como disolventes verdes. Variando los aniones y cationes de su
estructura, se pueden diseñar ILs con las características de solvatación adecuadas para
procesos específicos, incluyendo electrolitos en baterías, disolventes en extracciones
líquido-líquido, catálisis por metales de transición y muchos tipos de reacciones
orgánicas e inorgánicas, desde hidrogenaciones catalíticas e hidroformilaciones, hasta
reacciones de Friedel-Crafts y Diels-Alder. Sin embargo, su uso como disolventes
respetuosos con el medio ambiente debe ser evaluado nuevamente, ya que se han
obtenido datos sobre la degradación biótica y abiótica, la acumulación y la actividad
biológica (Docherty y Kulpa Jr 2005; Ranke et al. 2007), y se concluye que la variabilidad
en las estructuras no permite aún una conclusión respecto a su toxicidad y ecotoxicidad,
a pesar de que haya confirmado que la presencia de un enlace éster en la cadena alquilo
aumenta la biodegradabilidad, y que, la toxicidad aumenta con la longitud de la cadena
alquilo unida a los ILs basados en anillos imidazolio y piridinio. Además, su síntesis se
encuentra muy lejos de cumplir con los principios de la Química Verde, pues
generalmente requiere el uso de ingentes cantidades de disolventes y sales con el fin
de asegurar el completo intercambio de aniones.
En la Tabla 1.1 se recogen las ventajas e inconvenientes de las diferentes
categorías de disolventes alternativos, asignando una puntuación arbitraria de 1 a 5 para
cada uno de los ítems evaluados. Ésta fue publicada por Cark y Tavener (2007).
Actualmente, se está llevando a cabo una intensa labor en la búsqueda de nuevos
disolventes no convencionales que puedan sobrepasar las limitaciones de los medios
de reacción tradicionalmente usados como disolventes respetuosos con el medio
ambiente (H2O, FSC, ILs o FBS). En este sentido, los trabajos pioneros de varios grupos
de investigación internacionales han puesto de manifiesto el gran potencial de los
disolventes eutécticos profundos de bajo punto de fusión (Deep Eutectic Solvents, DES)
como medios de reacción baratos y alternativos en diferentes campos de la Química,
como, por ejemplo, la extracción de metales, biocatálisis, electroquímica, síntesis de
materiales y pretratamiento de biomasa.
-7-
Tabla 1.1. Ventajas e inconvenientes de los disolventes alternativos: puntuación arbitraria en escala de 1 a 5 (Clark y Tavener 2007).
H2O scCO2 ILs FBS NADES

Disuelve pequeñas Mal disolvente para
Limitado a compuestos Amplio rango: éteres,
Propiedades cantidades de muchos muchos compuestos; Amplio rango de
apolares; el mejor en ésteres, alcoholes,
como disolvente compuestos; malo para requiere codisolventes variabilidad;
sistemas bifásicos (3) ácidos (4)
apolares (3) o tensioactivos (1) siempre polar (4)
Puede separarse de la Fácil con productos

Forma bifases fácilmente;
Separación y mayoría de orgánicos; Excelente: fácil, volátiles; problemas si
deben destilarse para su Deben destilarse (4)
reutilización la purificación requiere eficiente y selectivo (4) se necesitan altas
reutilización (4)
mucha energía (3) purezas (2)
Pocos datos de Bioacumulativos, gases de

No tóxico; se requieren
Salud y No tóxico; no inflamable toxicidad; algunos son efecto invernadero; los Por lo general, baja
reactores de alta
seguridad y seguro de manejar (5) inflamables y tóxicos perfluoréteres son menos toxicidad (4)
presión (4)
(2) problemáticos (2)
Mucha energía, se El precio disminuye al

Muy baratos; necesita Caros; algunos baratos
Coste del uso requieren reactores Muy caros (1) aumentar el volumen
energía (4) accesibles (2)
especiales; barato y de mercado (4)
abundante (3)
Síntesis desde
petroquímicos con
Fuentes sostenibles;
Sostenible y seguro Sostenible y de residuos y demanda Requiere diversas fuentes;
Impacto biodegradables a COV
para el medio ambiente; múltiples fuentes; vida energía; algunos persisten en el ambiente
medioambiental que pueden causar
necesita purificación (4) útil sin fin (5) sostenibles; destino (2)
problemas (3)
ambiental desconocido
(2)
Puntuación 19 17 12 12 19
-8-
Los disolventes eutécticos profundos (DES) se notificaron por primera vez en 2001
como una nueva clase de disolventes basados en sistemas eutécticos y una alternativa
potencial a los líquidos iónicos (ILs) cuando Abbot y otros observaron disminuciones
significativas en los puntos de fusión de cloruros metálicos y sales de amonio
cuaternario (Abbott et al. 2001) pero el término DES no se introdujo hasta 2003 (Abbott,
Capper y Davies 2003) cuando se presentaron un nuevo tipo de disolventes, que se
formaron mezclando urea y cloruro de colina, ambos materiales de partida sólidos con
altos puntos de fusión. De este modo, se introdujo un nuevo sistema de disolventes
constituidos por materias primas naturales y renovables.
Figura 1.1. Mezcla eutéctica formada a partir de cloruro de colina (aceptor de hidrógeno) y urea
(donador de hidrógeno).
El cloruro de colina (C5H14ClNO) es uno de los componentes más empleados en la

formación de DES, se produce a gran escala en un proceso simple y de gran eficiencia
atómica, y es empleado como aditivo en alimento de aves para estimular su crecimiento.
Otros de los componentes más empleados tienen también su origen en la naturaleza,
como son ciertos aminoácidos, resorcinol, ácidos carboxílicos naturales, urea o
diferentes polialcoholes.
Los DES son mezclas eutécticas de dos o más componentes, generalmente
sólidos, que, en una proporción adecuada, experimentan un cambio de fase de sólido a
líquido conocida como punto eutéctico, a una determinada temperatura, la cual es muy
inferior a la de las temperaturas de fusión de sus componentes por separado.
Las interacciones de enlaces de hidrógeno son la principal fuerza impulsora de este
fenómeno. El estudio de las combinaciones de donador y aceptor de hidrógeno permite
adaptar la naturaleza, las propiedades físicas y el comportamiento de las fases de esta
nueva familia de disolventes de diseño (Kroon et al. 2013).
Figura 1.2. Diagrama de fase para una mezcla eutéctica.
-9-
Aunque las mezclas eutécticas son conocidas desde hace décadas, no fue hasta
principios del presente siglo cuando empezaron a utilizarse como posibles medios de
reacción. Estos DES, generalmente formados por mezas de ácidos y bases de Lewis o
Brønsted pueden contener una gran variedad de especies iónicas, que en comparación
con los disolventes tradicionales tienen propiedades únicas que les permiten llevar a
cabo reacciones de diversos tipos. Además de mantener muchas de las ventajas de los
líquidos iónicos, los DES presentan excelentes propiedades, tales como una presión de
vapor despreciable, lo cual elimina los problemas de volatilidad, elevada
biodegradabilidad, y en consecuencia una baja o nula toxicidad, alta reciclabilidad,
mínima inflamabilidad, fácil preparación y la más importante de todas, la mayoría de los
componentes que forman estas mezclas provienen de recursos naturales y por
consiguiente se obtienen a bajo coste (Gimeno 2019; Maquilón Albaladejo 2016).
Además, debido a la elevada solubilidad en agua, la adición de la misma al medio
de reacción una vez ésta haya finalizado, permite la disolución de la mezcla eutéctica,
de manera que los productos orgánicos precipitan en forma de sólidos o se mantienen
en una fase líquida insoluble en agua y, por tanto, claramente separada. Por tanto, se
puede evitar la extracción con disolventes orgánicos y la posible recuperación del DES
se consigue fácilmente mediante la evaporación del agua (Alonso et al. 2018).
Cabe destacar que, debido al tipo de compuestos que lo forman, si bien los DES
hidrofílicos suelen mostrar una profunda depresión del punto de fusión, los hidrofóbicos
pueden presentar tanto grandes como pequeñas depresiones, por lo que, en el caso de
que la depresión fuese pequeña se debería hablar de disolventes eutécticos y no de
disolventes eutécticos profundos (Florindo, Branco y Marrucho 2019), pero normalmente
a cualquier mezcla eutéctica se le denomina DES, independientemente de la magnitud
de la depresión de la magnitud del punto de fusión (Florindo et al. 2019).
De cara al desarrollo de los DES hidrofóbicos, de acuerdo con Florindo y col. (2019),
es importante seleccionar correctamente los compuestos que los forman, ya que la
hidrofobicidad de estos disolventes depende de la hidrofobicidad de cada uno de ellos,
pues se ha encontrado que los DES formados por un componente hidrofílico y otro
hidrofóbico son inestables en agua (San Segundo 2019). Normalmente, los DES
hidrofóbicos presentan una densidad inferior a la del agua mientras que la de los
hidrofílicos es superior y que los valores de viscosidad, tanto para DES hidrofílicos como
hidrofóbicos, suelen ser altos, con las correspondientes desventajas que ello conlleva
en relación con su manipulación, con las velocidades de reacción, y con la transferencia
de materia. Para solucionar el problema de la viscosidad, a menudo se emplean otros
disolventes para reducirla; sin embargo, se debe ser riguroso con los disolventes
empleados, ya que éstos pueden debilitar los enlaces de hidrógeno (González 2019).
La formación de cualquier DES es sumamente sencilla, no genera ningún tipo de
subproducto y no necesita ninguna etapa de purificación, por lo que su huella ecológica
es ideal. A pesar de todas las ventajas que poseen las mezclas eutécticas, también
tienen algunos inconvenientes, siendo el mayor de ellos su elevada densidad y
viscosidad, que pueden ocasionar serios problemas, especialmente a escala industrial.
Sin embargo, este problema comenzó a resolverse agregando un tercer componente
como puede ser agua, haluros, ácidos carboxílicos, y la formación de mezclas ternarias
eutécticas.
Existen cuatro tipos distintos de DES, clasificados en base a sus propiedades y
composición (Smith, Abbott y Ryder 2014; Alonso et al. 2018; Gimeno 2019):
• Tipo I. Contienen sales de amonio cuaternario y halogenuros metálicos. Debido
al uso de halogenuros metálicos anhidros para su preparación, generalmente
son más tóxicos y costosos comparados con otros tipos de DES, por lo que no
se utilizan como disolventes ecológicos.
-10-
• Tipo II. Son similares a los del tipo I, pero tienen haluros metálicos en su
estructura, lo que los hacen más económicos, generando una extensa variedad
de mezclas eutécticas a baja temperatura.
• Tipo III. Desde el punto de vista de la química orgánica, son los más importantes,
debido a su facilidad de preparación y su potencial uso como disolventes
sostenibles. Normalmente, se forman a partir de sales de amonio cuaternario,
que interactúan con compuestos que tienen carácter dador de hidrógeno. Por lo
general, se obtienen mezclando un compuesto con carácter aceptor de
hidrógeno (HBA), especialmente una sal con alto punto de fusión, como el cloruro
de colina (ChCl), con una sustancia que actúa como donadora de hidrógeno
(HBD). La adición de esta última a la sal dará como resultado el establecimiento
de un enlace de hidrógeno entre los dos componentes, deslocalizándose la carga
del anión de la sal, disminuyendo así la fuerza del enlace iónico entre el catión y
el anión de la sal y, por tanto, la energía de la red cristalina hasta distorsionarla
por completo. Esta disrupción de la estructura cristalina conduce a una
disminución del punto de fusión de la mezcla. La nueva estructura consta de una
extensa red de enlaces de hidrógeno entre los componentes, donde existen
huecos. Tanto el orden de la estructura como la densidad disminuyen. Cuanto
más fuerte es la interacción entre los componentes, mayor es la depresión del
punto de fusión.
• Tipo IV. Se forman combinando un haluro metálico con un ácido de Lewis o de
Brønsted.
Los disolventes eutécticos profundos naturales (Natural Deep Eutectic Solvents,
NADES) fueron introducidos como una subclase de DES (tipo III) (Choi et al. 2011). Son
mezclas de compuestos de origen natural como metabolitos primarios, aminoácidos,
ácidos carboxílicos, azúcares, cloruro de colina y urea con un punto de fusión
significativamente disminuido debido a las interacciones específicas entre los
componentes (Kov et al. 2020). En comparación con los ILs, son menos tóxicos, más
baratos y biodegradables, se pueden fabricar con una economía de átomos al 100 % y
son menos sensibles a impurezas. El mayor potencial de los NADES es su aplicación
como disolventes de diseño (Rengstl, Fischer y Kunz 2014). Éstos son sistemas en los
que las propiedades se pueden adaptar según la aplicación, cambiando los
componentes y su relación molar.
Las propiedades de los NADES son el resultado del sistema intermolecular de unión
de hidrógeno entre los componentes. La fuerza de esta interacción determina en gran
medida las propiedades físico-químicas de la mezcla eutéctica. Durante el desarrollo,
hay muchas propiedades a tener en cuenta como densidad, viscosidad, punto de fusión,
polaridad, conductividad iónica, tensión superficial y acidez o alcalinidad (Kov et al.
2020).
Punto de fusión
Los NADES se forman mediante la combinación de un compuesto con carácter
aceptor de hidrógeno (HBA), normalmente una sal con alto punto de fusión, como el
cloruro de colina con una sustancia que actúe como donadora de hidrógeno (HBD). La
adición de esta última a la sal hace que se establezcan enlaces de hidrógeno entre los
dos componentes, deslocalizando así la carga del anión de la sal, disminuyendo la
fuerza del enlace iónico entre el catión y el anión salino y, por tanto, la energía de la red
cristalina hasta su completa distorsión. Esta alteración de la estructura cristalina (Figura
1.3) hace que el punto de fusión de la mezcla disminuya. La nueva estructura formada
consta de una extensa red de enlaces de hidrógeno con huecos entre los componentes.
Esta estructura está menos ordenada y su densidad disminuye (Alonso et al. 2018).
-11-
Figura 1.3. Estructura general de una mezcla eutéctica.
Cuanto más fuerte es la interacción entre los componentes, mayor es la depresión

del punto de fusión.
Zhang y col. estudiaron exhaustivamente la relación empírica ente la estructura y el
punto de fusión (Zhang et al. 2012). Los componentes de HBD con menor peso
molecular producen una mayor disminución del punto de fusión (Maugeri y de María
2012; Kov et al. 2020).
Densidad, viscosidad y tensión superficial

La mayoría de los NADES presentan densidades superiores a las del agua (entre
1,1 y 1,4 g/cm3)(Dai et al. 2013) y viscosidades significativamente más elevadas que los
disolventes comunes, por ejemplo, la viscosidad del agua es 8,91·10-4 Pa·s a 25 °C,
mientras que la de la mezcla eutéctica de cloruro de colina y urea es de 750·10-3 Pa·s a
25 °C (Alonso et al. 2018). La elevada viscosidad implica limitaciones significativas en
la transferencia de masa y energía durante las reacciones siendo necesario limitar la
viscosidad mediante la selección de moléculas más pequeñas, con menos grupos de
donación/aceptación de enlaces de hidrógeno e interacciones más débiles. Sin
embargo, las fuertes fuerzas intermoleculares contribuyen a una buena solubilidad y a
los bajos puntos de fusión. La tensión superficial de los disolventes eutécticos también
es mayor que la mayoría de los disolventes moleculares y similar a la de los ILs basados
en sales de imidazolio (Zhang et al. 2012). El aumento de la temperatura provoca la
disminución de estas propiedades (Abbott et al. 2011). La densidad mostró una relación
cuadrática con la temperatura, mientras que la relación viscosidad-temperatura sigue la
ecuación de Arrhenius.
Polaridad y conductividad iónica

La polaridad de los NADES aumenta linealmente con la concentración de sal.
Debido a sus elevadas viscosidades, suelen presentar baja conductividad (Abbott et al.
2011). Un aumento de la temperatura conlleva al aumento de la conductividad, ya que
disminuye la viscosidad. La relación molar de los componentes también afecta a la
conductividad a través de su efecto sobre la viscosidad, y el aumento de la
concentración de especies portadoras de carga tiene un efecto positivo en la
conductividad (Kareem et al. 2010).
Muchos NADES son susceptibles a la absorción de agua, ya que esta puede
participar en la red de enlace de hidrógeno. El contenido de agua afecta
significativamente a todas las propiedades ya que interrumpe la interacción entre los
componentes dando lugar a una disminución de la densidad y la viscosidad (Meng et al.
2016; Yadav y Pandey 2014).
-12-
1.3. APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS AGRÍCOLAS: HOJAS DE

ARÁNDANO
El arándano, arbusto perenne del género Vaccinium, de la familia de las Ericáceas,

se cultiva en nuestro país, siendo el tercer productor europeo por detrás de Alemania y
Polonia. El 96% de las exportaciones tiene como destino la UE debido a la demanda
creciente en estos países.
Huelva es la provincia con mayor producción de arándano en España y la mayor
zona productora de Europa para la cosecha temprana de primavera, con una superficie
de cultivo actual de 4.500 hectáreas, que se ha ido incrementando en los últimos años,
en cierta manera, a expensas de la disminución del cultivo de la de la fresa. Desde 2004
la superficie de cultivo bajo plástico ha aumentado en un 76,4% (Berries 2016).
Existen muchas variedades de este frutal, resultado del cruzamiento de varias
especies del género Vaccinium, adaptadas a diferentes condiciones ambientales. El
primer híbrido de arándano fue obtenido por Frederick Coville en 1909. Entre las
especies de Vaccinium, las importantes desde el punto de vista comercial son: arándano
rojo, V. oxycoccus, arándano azul, V. corymbosum, también conocido como arándano
alto (Highbush), arándano bajo, V. angustifolium, (Lowbush) y arándano ojo de conejo,
V. ashei (Rabbit Eye), siendo las tres últimas las más cultivadas en nuestro país
(Anderson 2006). Entre las variedades más comunes en el sector se encuentran: Misty,
Jewel Star, O’neal, Emerald, Biloxi, Camellia, Ventura, Legacy, Stella blue y
Snowchaser.
Figura 1.4. Arándanos azules1 y arándanos rojos2.
Crecen dentro de una amplia gama de climas, requieren de horas de frío que van
desde 400 a 1100 horas. Su temperatura mínima de crecimiento es de 7 ºC, su
temperatura máxima es de 33 ºC y su crecimiento óptimo entre 16 y 25 ºC. Los
arándanos no requieren de una estación calurosa muy larga para madurar sus frutos,
éstos maduran en primavera y no necesitan luminosidad para desarrollar su color,
aunque la calidad, el sabor y el aroma del fruto son superiores si se cultiva en áreas con
noches frías en el periodo de maduración.
El suelo es otro factor crucial para la obtención de grandes rendimientos, siendo
adecuados los suelos ácidos (pH 4-5) con abundante materia orgánica (>5%), húmedos,
arcillosos, no muy profundos y de baja fertilidad (Godoy 2002; Anastas y Eghbali 2010).
Se han publicado numerosos estudios sobre la composición química y aplicaciones
sanitarias de la fruta del arándano (Barnes et al. 2009; Lau et al. 2009; Norberto et al.
2013; Wang et al. 2015). Esto ha llevado a un aumento constante en su consumo a nivel
mundial. Sin embargo, hay grandes cantidades hojas de arándano que se descartan
después de la poda en muchos países.
1 https://viverosgrajera.com/pt/
2 http://greenarea.me/es/207921/la-buena-del-arandano-rojo/
-13-
Las hojas de arándano se han estudiado desde 1927, momento en el que se

utilizaban como té medicinal para los diabéticos (Allen 1927). Se han utilizado como
hierba medicinal tradicional en China durante siglos para prevenir las cataratas, la
anemia y envejecimiento prematuro (Fang y Qin 2003). Al comparar la actividad
antioxidante de las hojas y los frutos del arándano de arbusto alto (V. corymbosum), se
encontró que esta era significativamente mayor en las hojas que los frutos (Ehlenfeldt y
Prior 2001). Posteriormente Naczk y col. (2003) confirmaron que en algunas especies
de arándano salvaje los extractos fenólicos de la hojas tienen mayor capacidad
antioxidante que los frutos (Naczk et al. 2003). En este sentido, un estudio realizado por
Harris y col. (2005) sugirió que el extracto de hojas de arándano de arbusto bajo (V.
angustifolium) es rico en ácido clorogénico y glucósidos de quercetina (Harris et al.
2007). En las hojas de arándano de ojo de conejo (V. ashei), se encontró que los
principales componentes fenólicos eran los flavanoles y proantocianidinas, además de
ácido clorogénico y glucósidos de flavonol (Matsuo et al. 2010).
Se ha demostrado que las proantocianidinas obtenidas a partir de hojas de
arándano tienen un alto potencial para suprimir la expresión del ARN del virus
subgenómico de la hepatitis C (Takeshita et al. 2009). Aunque se han realizado varios
estudios relacionados con las hojas del arándano, no se han estudiado
sistemáticamente más variedades (Wang et al. 2015).
Estos frutos son cada vez más conocidos por sus efectos beneficiosos para la salud,
incluidos efectos antibacterianos, antidiabéticos, antioxidantes ,anticancerígenos, y
efectos positivos contra los trastornos vasculares y neurodegenerativos (Chatterjee
et al. 2004; Martineau et al. 2006; Ramassamy 2006; Seeram et al. 2006; Neto 2007;
Ovaskainen et al. 2008; Grace et al. 2009; Gozzi 2011; Ignat, Volf y Popa 2011; Park
et al. 2011; Li et al. 2013; Routray y Orsat 2014). Estos efectos son atribuidos a su
capacidad antioxidante (Balasundram, Sundram y Samman 2006; Quiñones, Miguel y
Aleixandre 2012; Barreto, Cánoves y Más 2016). Entre los efectos beneficiosos más
conocidos del consumo de arándanos cabe destacar la capacidad de revertir las
pérdidas de memoria asociadas al envejecimiento y a las primeras etapas de
enfermedades como el Alzheimer (Joseph et al. 2003; Vasquez-Castilla et al. 2012).
Según estos mismos autores, los polifenoles de arándano ejercen efectos
antiinflamatorios a nivel celular (Joseph et al. 2003). Otros efectos beneficiosos incluyen
la salud ocular, mejorando la fatiga y la visión nocturna, y la del tracto urinario,
previniendo infecciones bacterianas, además de prevenir diferentes tipos de cáncer y la
isquemia cerebral (Szajdek y Borowska 2008; Vasquez-Castilla et al. 2012).
1.4. COMPUESTOS BIOACTIVOS
Los derivados fenólicos o polifenoles son metabolitos secundarios sintetizados por

las plantas que intervienen en funciones como la fotosíntesis, la asimilación de
nutrientes, la actividad enzimática, la síntesis proteica, la alelopatía y la protección ante
patógenos y radiación UV (Stalikas 2007; Khoddami, Wilkes y Roberts 2013; Lillo et al.
2016).
El contenido en polifenoles de los alimentos puede verse afectado factores como la
exposición a la luz, la temperatura de almacenamiento (Manach et al. 2004), factores
ambientales como respuesta a patógenos, maduración en el momento de la cosecha,
procesamiento y métodos culinarios.
-14-
En los últimos años, numerosos estudios han demostrado que la ingesta de

polifenoles causa efectos beneficiosos sobre la salud, especialmente sobre el sistema
cardiovascular (Schroeter et al. 2006). Además poseen efectos antitrombóticos (Ruf
1999), vasodilatadores (Grandal 2000), antiinflamatorios (Williams et al. 2004),
anticancerígenos (Valdés 2016), antiapoptóticos (Urueta-Cuéllar et al. 2010),
antilipémicos y antiaterogénicos (Quiñones, Miguel y Aleixandre 2012).
Además, se ha confirmado que son capaces de inhibir la enzima convertidora de
la angiotensina (ECA) (Wilcox et al. 2001), mejorar el perfil lipídico y atenuar la oxidación
de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Pal et al. 2003).
Se conocen alrededor de 8.000 compuestos fenólicos presentes en la naturaleza
(Ignat, Volf y Popa 2011; Barreto, Cánoves y Más 2016), los cuales varían y se clasifican
según su estructura, en ácidos fenólicos, flavonoides, lignanos, estilbenos, cumarinas y
polímeros fenólicos (Manach et al. 2004; Craft et al. 2012). La estructura química de
estas sustancias consiste en al menos un anillo aromático con uno o más grupos
hidroxilos que determinan su capacidad antioxidante (Khoddami, Wilkes y Roberts
2013), ya que estos grupos ceden electrones o átomos de hidrógeno neutralizando los
radicales. Una clasificación general de los compuestos fenólicos se muestra en la Figura
1.5.
Los flavonoides, ácidos fenólicos, y taninos son los compuestos principales de
todos los polifenoles:
• Compuestos flavonoides
Los flavonoides, también conocidos como bioflavonoides, actúan como
antioxidantes en alimentos y bebidas. Se sintetizan en plantas y participan en la fase
de fotosíntesis dependiente de la luz, durante la cual catalizan el transporte de
electrones. Su formación tiene lugar a partir de unidades de acetato y aminoácidos
aromáticos como la fenilalanina y la tirosina. Estas dos últimas, dan lugar a los
ácidos cinámico y parahidroxicinámico, que al condensarse con las unidades de
acetato originan la estructura cinamol de los flavonoides (Jáuregui y Escudero 2007;
Escamilla Jiménez, Cuevas Martínez y Guevara Fonseca 2009). Posteriormente se
forman los derivados glicosilados o sulfatados (Quattrocchio et al. 2006). Se
encuentran en las vacuolas de las plantas y algunos poseen colores brillantes
(Benbrook 2005). Existen alrededor de cinco mil especies (Ross y Kasum 2002),
todos ellos comparten el mismo esqueleto básico, el núcleo flavan, que consiste en
dos anillos aromáticos con seis átomos de carbono (anillo A y B) interconectados
por un heterociclo incluyendo tres átomos de carbono (anillo C) (Stalikas 2007; Wang
2007; Lillo et al. 2016).
Se diferencian en el número y la disposición de los grupos hidroxilo, en la
naturaleza y el grado de insaturación y oxidación del segmento de los tres carbonos
En función de sus características estructurales se pueden clasificar en antocianinas
y antoxantinas, y estas a su vez en flavonas (apigenina), flavonoles (quercetina),
flavonas (diosmetina), flavanonas (hesperetina), e isoflavonas (daidzeína), según se
muestra en la Figura 1.5 (Ballester Espigares 2006; Escamilla Jiménez, Cuevas
Martínez y Guevara Fonseca 2009; Zapata 2014; Cubero-Cardoso et al. 2020).
• Ácidos fenólicos
En este grupo se incluye a sustancias que contienen un anillo fenólico y un
grupo carboxilo, y que a su vez se pueden dividir en ácidos hidroxibenzoicos y ácidos
hidroxicinámicos. La diferencia entre ambos está que los primeros presentan un
grupo carboxílico y uno o más grupos hidroxilos en el anillo aromático (ácido gálico),
y los segundos se caracterizan por la presencia del grupo CH=CH-COOH en
reemplazo del grupo carboxilo presente en los del grupo anterior (ácido p-cumárico).
-15-
• Taninos
Teniendo en cuenta la naturaleza química se han distribuido principalmente en

dos grandes grupos como se muestra en la Figura 1.5, los taninos hidrolizables
(ácido elágico) y los taninos condensados. Los taninos hidrolizables son ésteres de
glúcidos y ácidos fenólicos y como su propio nombre indica, son fácilmente
hidrolizables en condiciones ácidas o básicas o por la acción de enzimas, mientras
que los taninos condensados son oligómeros y polímeros de flavanoles unidos por
enlaces C-C (C4/C8 o C4/C6), y no son susceptibles de hidrólisis. Cuando este
Introducción tipo de taninos se calientan en medio fuertemente ácido y en presencia
de iones metálicos, los cuales actúan como catalizadores, la unión interflavánica se
rompe oxidativamente, dando antocianinas como productos de degradación. Por ello
los taninos condensados son designados también como proantocianidinas.
Figura 1.5. Clasificación general de los compuestos fenólicos.
-16-
2. OBJETIVOS
El objetivo principal del presente trabajo es la obtención de disolventes verdes para

la extracción de compuestos bioactivos a partir de subproductos agrícolas como las
hojas de arándanos.
Para la consecución de este objetivo general se plantean los siguientes
subobjetivos específicos:
1. Sintetizar disolventes eutécticos profundos naturales (NADES) a partir de
donadores y aceptores de hidrógeno de diferente naturaleza.
2. Extraer compuestos de elevado valor añadido a partir de hojas de arándano.
3. Determinar el contenido en polifenoles totales y capacidad antioxidante de los
extractos obtenidos para seleccionar el/los NADES que presentes mejores
resultados de extracción.
4. Caracterización de los NADES seleccionados: RMN y características reológicas.
5. Optimización del proceso de extracción.
-17-
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MUESTRAS
En el presente trabajo, la materia prima estaba compuesta por hojas de cuatro

variedades de arándano azul cultivados en la localidad de Moguer (Huelva) y
proporcionadas por la empresa Driscoll’s.
Las hojas se lavaron con agua desionizada y se dejaron secar a temperatura
ambiente durante 7 días. Transcurrido este tiempo, se trituraron mediante un molinillo
de cuchillas y se almacenaron en frascos de propileno a temperatura ambiente hasta su
utilización.
3.2. SÍNTESIS DE NADES
Las mezclas eutécticas empleadas en este trabajo se obtuvieron mediante la

combinación de aceptores (HBA) y donadores (HBD) de hidrógeno. Para la preparación
de las mismas se pesaron y se mezclaron los componentes en las proporciones
adecuadas en un tubo Falcon. A continuación, se llevaron al baño de ultrasonidos
POWERSONIC 405 calentando a 50 °C hasta la formación de un líquido homogéneo.
Figura 3.1. Tubos Falcon con la mezcla de los componentes en baño ultrasonidos a 50 °C.
Los reactivos empleados en la síntesis fueron: cloruro de colina (Algry), urea (Alfa
Aesar), glicerol (Panreac), etilenglicol (Alfa Aesar), ácido láctico (Panreac), ácido oxálico
dihidratado (Scharlau), 1,4-butanodiol (Alfa Aesar), glucosa (Panreac), glicina
(Panreac), ácido cítrico (Merk), acetato de sodio (Panreac), prolina (Panreac) y betaína
(Sigma-Aldrich).
-18-
3.3. EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS
La extracción asistida por ultrasonidos es uno de los métodos de extracción más

recientes, en el que se aplican ondas de sonido a una mezcla de materia vegetal-
disolvente para la extracción eficiente de compuestos fenólicos (Routray y Orsat 2014).
Para llevar a cabo la extracción, se pesan, por duplicado, 0,2 g de hojas y se llevan
a tubos Eppendorf de 2 mL, donde se añaden 1,5 mL del disolvente. Se agitan las
muestras en agitador vórtex (HEIDOLPH REAX TOP) para homogeneizarlas y se lleva
a baño US a 65ºC durante 45 minutos. Se filtran usando lana de vidrio y se centrifugan
a 13.400 rpm durante 15 min (EPPENDORF MINISPIN). Tras esto, se retina el
sobrenadante de las muestras y se llevan a nuevos tubos Eppendorf, almacenándolos
a 4 ºC hasta el momento del análisis.
3.4. DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMÉTRICAS
Mediante métodos espectrofotométricos se evaluó el contenido de polifenoles

totales, la capacidad antioxidante y el contenido en antocianos. Estos métodos no son
nuevos en el campo de la química analítica y son usados frecuentemente para la
determinación de metabolitos secundarios.
3.4.1. Determinación de polifenoles totales
El contenido de polifenoles se determina mediante el método de Folín-Ciocalteu,

empleando una adaptación del método original (Singleton VL 1965). Se trata de uno de
los métodos más antiguos y más comúnmente utilizados para determinar el contenido
en polifenoles totales en materia vegetal debido a su simplicidad, rapidez y
reproducibilidad. Tiene el inconveniente de que otros compuestos reductores presentes
en las plantas como el ácido ascórbico, aminoácidos y azucares como fructosa y glucosa
reaccionan con el reactivo de Folín-Ciocalteu, lo que puede interferir en los resultados.
• Fundamento
El reactivo de Folin-Ciocalteu es una solución ácida de polímeros complejos de
los ácidos fosfomolíbdico y fosfowolfrámico. Este reactivo de color amarillo oxida los
fenolatos, en condiciones básicas (pH 10), para dar lugar a un complejo azul de
molibdeno-wolframio. La coloración producida es proporcional a la concentración de
polifenoles y es susceptible de ser determinada espectrofotométricamente a 725 nm.
Reactivo de Folín (W6+, Mo6+) Reactivo de Folín reducido (W5+, Mo5+)

color amarillo color azul
Figura 3.2. Mecanismo de acción del reactivo de Folín-Ciocalteu.
-19-
Para calcular dicho contenido en polifenoles totales se construyó una recta de

calibrado empleando como estándar ácido gálico. Los resultados se expresan en mg de
equivalente de ácido gálico por g de hoja seca.
Figura 3.3. Estructura química Figura 3.4. Estructura química del reactivo
del ácido gálico (C7H6O5). de Folín-Ciocalteu (C10H5NaO5S).
• Materiales, equipos y reactivos

Matraces aforados de 50 mL, vasos de precipitados, micropipetas graduadas, tubos
de ensayo, gradillas, Espectrofotómetro Thermo SPECTRONIC, cubeta de cuarzo de
10 mm, reactivo de Folín-Ciocalteu (Merk), disolución patrón de ácido gálico 5 g/L,
disolución de carbonato sódico al 20 % (m/v) y agua Mili-Q.
• Procedimiento
Para la recta de calibrado se pipetean, por duplicado, 0, 0.5, 1, 1.5, 2.5, 3.5, 5 y 7.5
mL de la disolución patrón de ácido gálico de 5 g/L en matraces aforados de 50 mL y se
enrasa con agua mili-Q, siendo las concentraciones de ácido gálico en estas
disoluciones 0, 50, 100, 150, 250, 350, 500 y 750 mg/L, respectivamente.
Posteriormente, se pipetean, por duplicado, 20 µL de cada disolución patrón de ácido
gálico o de las muestras, diluidas (1:50), en su correspondiente tubo de ensayo y se le
adiciona 1,58 mL de agua Mili-Q y 100 µL del reactivo de Folín. Se agitan los tubos de
ensayo de 30 segundos a 1 minuto en agitador vórtex HEIDOLPH REAX TOP para
homogeneizar la mezcla.
Posteriormente se añaden 300 µL de Na2CO3 y se agitan nuevamente. Todos los
tubos de ensayo se llevan al baño maría durante 1h-1h30 a 40 °C. Finalmente, se retiran
los tubos del baño y se dejan enfriar, para medir su absorbancia a 725 nm frente a un
blanco de agua Mili-Q.
3.4.2. Determinación de la actividad antioxidante
La actividad antioxidante se determinó mediante el método del DPPH (Brand-

Williams, Cuvelier y Berset 1995). Se trata de un método rápido y sencillo, que no
requiere de un equipamiento sofisticado y es ampliamente utilizado para la evaluación
de la actividad antioxidante total. No obstante, presenta como inconvenientes que solo
se puede disolver en medio orgánico y que, en algunos casos, la interpretación resulta
complicada ya que algunos antioxidantes y/o moléculas pueden causar interferencias si
poseen un espectro de absorción similar al DPPH.
-20-
• Fundamento
El nombre de este ensayo se debe al reactivo utilizado para realizar la
determinación de la capacidad antioxidante, el radical DPPH, (2,2-difenil-1-
picrilhidrazilo), un radical orgánico, estable por resonancia y que presenta color, éste
decae progresivamente cuando se le añade la muestra, donadora de un átomo de
hidrogeno dando lugar al DPPH reducido de color amarillo. La decoloración del radical
se determina a 515 nm. Los tiempos de reacción son variables, dependiendo de la
naturaleza de los antioxidantes. En general, las moléculas pequeñas con mejor
accesibilidad al centro activo del radical poseen aparentemente una mayor actividad
antioxidante empleando este método.
DPPH oxidado (C18H12N5O6) DPPH reducido (C18H13N5O6)

color púrpura color amarillo
Figura 3.5. Reacción entre el radical DPPH y la especie oxidante.
.
Para calcular dicha actividad antioxidante se construyó una recta de calibrado
empleando disoluciones patrón de Trolox (análogo de la Vitamina C). Los resultados se
expresan en mg de equivalente a Trolox por g de hoja seca.
Figura 3.6. Estructura química de Trolox (C14H18O4).

Matraces aforados de 10 mL, 100 mL y 1L, vasos de precipitados, micropipetas
graduadas, tubos de ensayo, gradillas, Espectrofotómetro Thermo SPECTRONIC,
cubeta de cuarzo de 10 mm, metanol, disolución metanólica de Trolox 10 mM y
disolución metanólica de DPPH 1 mM y 0.1 mM.
• Procedimiento
Para la recta de calibrado se pipetean, por duplicado, 0, 400, 600, 800, 1000, 1200
y 1600 µL de la disolución de Trolox 10 mM en matraces aforados de 10 mL y se enrasa
con metanol, siendo las concentraciones de Trolox en estas disoluciones, 0, 0.4, 0.6,
0.8, 1.0, 1.2, 1.4 y 1.6 mM, respectivamente. Posteriormente, se pipetean, también por
duplicado, 100 µL de cada disolución patrón de DPPH 0.1 mM en su correspondiente
tubo de ensayo y se le adiciona 3.9 mL de la disolución de DPPH 0.1 mM y se agitan en
Vortex para homogeneizar la mezcla. Finalmente, se mide la albsorbancia frente a un
blanco de metanol, justo después de la mezcla y a los 30 min.
Para las muestras se procede de igual modo, tomando en este caso 100 µL de
extracto diluido (1:50).
-21-
3.4.3. Determinación de antocianos totales
Las antocianinas son flavonoides pigmentados, hidrosolubles, responsables de una

amplia gama de colores que abarcan desde el rojo hasta el azul de muchas frutas,
vegetales y cereales (Fennema 1993). Estas sufren transformaciones estructurales con
el cambio de pH, adquieren la conformación de catión flavilio (color rojo) a pH 1 y la de
hemicetal (incolora) a pH 4.5. El contenido de antocianinas determina mediante el
método de la diferencia de pH (Lee, Durst y Wrolstad 2005).
• Fundamento
Debido a una deficiencia del núcleo del flavilio, estos pigmentos funcionan como
verdaderos indicadores de pH; es decir, su color depende de las condiciones de acidez
o alcalinidad del sistema en que se encuentran: a pH ácido adquiere una estructura
estable del catión flavilio de color rojo, representado por la fórmula (AH+); cuando se
incrementa el pH, la distribución electrónica se modifica hasta llegar a la forma quinoidea
azul (A) o base anhidra; tanto, la sal del flavilio como la base anhidra pueden convertirse
a la base del carbinol incolora (B), que predomina en el rango de pH de 4 a 5.
En resumen, el método de la diferencia de pH se basa en las transformaciones
estructurales y con ellas el cambio de color que sufren las antocianinas monoméricas
con una variación en el pH. La medición de las absorbancias de los dos buffers de pH
1.0 y 4.5 se realiza a 510 y 700 nm, empleando para el cálculo de la diferencia de pH la
siguiente ecuación:
A = (A510 nm pH 1.0 – A700 nm pH 1.0) – (A510 nm pH 4.5 – A700 nm pH 4.5)
El contenido en antocianinas totales en la muestra se expresa expresan en mg de

cianidina-3-glucósido por g de hoja seca (PM=449.2 g/mol), y se calcula haciendo uso
de la ecuación de Lambert-Beer:
A= ε∙ b∙ c
donde:
A= diferencia de absorbancia
b: longitud de paso óptico
ε: coeficiente de absortividad molar de la cianidina-3-glucósido (26900 L ∙ mol-1 ∙ cm-1)

Matraces aforados de 100 mL, y 250 mL, vasos de precipitados, micropipetas
graduadas, tubos de ensayo, gradillas, Espectrofotómetro Thermo ELECTRO
CORPORATION, cubeta de cuarzo de 10 mm, disolución de pH 1.0, disolución tampón
de pH 4.5 y agua Mili-Q.
• Procedimiento
Se pipetean, por duplicado, 100 µL de extracto diluido (1:2) en su correspondiente
tubo de ensayo y se le adiciona 2,5 mL de disolución de pH 1.0 y de pH 4.5 a cada uno
de los respectivos tubos. Se agitan en Vortex para homogeneizar la mezcla. Finalmente,
se mide la absorbancia a 510 nm y 700 nm frente a un blanco de agua Mili-Q.
-22-
3.5. CARACTERIZACIÓN DE NADES
3.5.1. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear
La técnica espectroscópica de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) representa

una de las técnicas analíticas más útiles y empleadas en la determinación estructural de
compuestos químicos. Se fundamenta en las propiedades magnéticas intrínsecas de
los núcleos atómicos, basadas en la interacción del momento magnético nuclear con un
campo magnético externo, que conduce a la generación de diferentes niveles
energéticos. La respuesta entre la transición entre estos niveles por la absorción de
energía de radiofrecuencia por parte de los núcleos atómicos, puede ser detectada,
amplificada y registrada en una línea espectral o señal de resonancia. («Unidad de
Resonancia Magnética Nuclear»). De este modo se generan espectros de RMN con
núcleos de momento magnético distinto de cero, incluidos el protón (1H) y otros como
13
C, 31P,19F, 14N, 15N, etc. Para un mismo tipo de núcleo, debido a que los entornos
químicos son diferentes, las frecuencias de resonancia también son diferentes. Por esta
razón, se define el desplazamiento químico (δ).
En la espectroscopia de 1H RMN, el área de una señal de resonancia es
directamente proporcional al número de núcleos que generan la señal, lo que permite
su integración. Debido al acoplamiento entre los espines nucleares de núcleos
adyacentes, se produce la división de la señal, separada por la frecuencia característica
o la frecuencia constante de acoplamiento (J).
Las medidas de RMN se realizaron en un espectrómetro Bruker Avance a 500 MHz
utilizándose dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) como disolvente.
El objetivo de este estudio es corroborar que no se dan reacciones en el proceso
de síntesis, esperando, por tanto, un espectro para el líquido eutéctico con las señales
espectroscópicas a los mismos desplazamientos que se encuentran en los espectros de
los componentes que lo forman.
3.5.2. Estudio reológico
El estudio reológico se centra en el análisis de los principios que determinan cómo

se mueven los fluidos. Estos estudios son realizados con un equipo llamado reómetro,
que mide el esfuerzo de cizallamiento bajo el control de diferentes parámetros físicos.
De esta forma, se puede determinar el coeficiente de esfuerzo y la viscosidad de cada
fluido, entre otras propiedades. La viscosidad debe ser entendida como la resistencia
que ofrece un fluido antes de deformarse cuando se es sometido a un esfuerzo
(«Definición de reología»).
Las mediciones de la viscosidad de los NADES se realizaron con la ayuda de un
reómetro de velocidad de cizallamiento controlado ARES GII (TA Instruments, EE.UU.),
equipado con un controlador de temperatura Peltier a 25 ºC, empleando una geometría
de couette (copa de 20 mm de diámetro, 27,9 mm de longitud y bobina de 18,6 mm de
diámetro). Durante las pruebas se fijó un rango de velocidad de cizallamiento de 10-2 -
102 s-1 (Cortés-Triviño et al. 2018).
-23-
3.5.3. Medidas de pH
Para medir el pH de los NADES se utiliza papel tornasol que se sumerge en el

disolvente. Este papel que está impregnado en un indicador de pH cambia de color en
contacto con el disolvente y por comparación con la escala de color en función al pH se
determina su valor.
3.6. OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE EXTRACCIÓN
Para la optimización de las condiciones de extracción, se estudiaron los factores

temperatura, tiempo de extracción y relación hoja de arándano-disolvente utilizando un
diseño de tipo Box-Behnken (33), con tres variables (tiempo, temperatura y ratio) a tres
niveles (-1, 0, 1) con el fin de determinar qué factores tenían una influencia significativa
en la eficiencia de extracción. Este diseño se llevó a cabo mediante el programa
STATISTICA. El ensayo se realizó con un total de 15 experimentos para cada uno de
los NADES a optimizar y en orden aleatorio, con el fin de evitar de errores sistemáticos.
Tabla 3.1. Variables y niveles del diseño experimental.
Nivel de variable codificada

Variable
Símbolo
independiente
-1 0 +1
Tiempo (min) X1 30 45 60
Temperatura (º C) X2 25 45 65
Ratio X3 15 30 75
-24-
4. RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIÓN
4.1. SÍNTESIS DE NADES
Siguiendo el proceso de síntesis descrito en el apartado 3.2 se ensayaron distintas

mezclas entre donadores y aceptores de hidrógeno. De las diferentes mezclas
probadas, la Tabla 4.1 recoge aquellas que resultaron satisfactorias y dieron lugar a una
única fase. En el anexo 7.1 de esta memoria se muestran las tablas con las mezclas
que no formaron un líquido eutéctico. La Figura 4.1 muestra una imagen de 5 de los
NADES obtenidos.
Tabla 4.1. NADES sintetizados y utilizados en el proceso de extracción.
Componentes
Abreviatura Proporción molar
Aceptores de Donadores de
Hidrógeno Hidrógeno
ChCl:U:W Cloruro de colina Urea Agua 1:2:1
ChCl:Glic:W Cloruro de colina Glicerol Agua 1:2:1
ChCl:Eg:W Cloruro de colina Etilenglicol Agua 1:2:1
ChCl:U Cloruro de colina Urea 1:2
ChCl:Glic Cloruro de colina Glicerol 1:2
ChCl:Eg Cloruro de colina Etilenglicol 1:2
ChCl:La Cloruro de colina Ácido láctico 1:2
ChCl:Ox Cloruro de colina Ácido oxálico dihidratado 1:1
ChCl:But Cloruro de colina 1,4-Butanodiol 1:6
La:Glu:W Ácido láctico Glucosa Agua 6:1:6
La:Gly:W Ácido láctico Glicina Agua 3:1:3
Ca:Glu Ácido cítrico Glucosa 1:2 [20% v/v W]
La:AcNa:W Ácido láctico Acetato de Sodio Agua 3:1:2
Pro:La Prolina Ácido láctico 1:1
Pro:Glic Prolina Glicerol 2:5
Pro:Ox Prolina Ácido oxálico dihidratado 1:1
Bet:Glic:W Betaína Glicerol Agua 1:2:1
Bet:Eg:W Betaína Etilenglicol Agua 1:2:1
Figura 4.1. NADES obtenidos en el proceso de síntesis.
-25-
4.2. EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS
Para la selección de aquellos disolventes más efectivos en la extracción de

compuestos bioactivos a partir de hojas de arándanos, se prepararon las siguientes
mezclas siguiendo el método de extracción descrito en el apartado 3.3, analizando el
contenido en polifenoles totales y la actividad antioxidante de los diferentes extractos
obtenidos.
4.2.1. Determinación de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales, expresado en mg de ácido gálico por gramo de

hoja, se determinó siguiendo el método espectrofotométrico de Folín-Ciocalteu, descrito
en el apartado 3.4.1. La Figura 4.2 recoge la representación gráfica de la recta de
calibrado de los distintos valores de absorbancia frente a los valores de concentración
de las disoluciones patrón.
Polifenoles totales
0,9
Absorbancia (U.A)
0,8 y = 0,0011x + 0,0152

0,7
R² = 0,9974
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 200 400 600 800
Concentración (mg/L)
Figura 4.2. Representación gráfica de la recta de calibrado de polifenoles totales.
La concentración de polifenoles totales, para cada una de las muestras, se obtiene

interpolando los valores de absorbancia en la ecuación de la recta, teniendo en cuenta
las diluciones realizadas. Los resultados, expresados en mg de equivalente de ácido
gálicos por g de hoja seca, se recogen en la Tabla 4.2 y se representan graficamente,
mediante un diagrama de barras en la Figura 4.3.
Tabla 4.2. Concentración de polifenoles totales en cada extracto.
Concentración Concentración
Extractante Extractante
(mg/g) (mg /g)
MeOH 86,88 ± 2,31 La:Glu:W 92,11 ± 3,33
ChCl:U:W 76,79 ± 2,09 La:Gly:W 108,24 ± 0,72
ChCl:Glic:W 69,46 ± 2,19 Ca:Glu [20% W] 104,50 ± 1,35
ChCl:Eg:W 86,37 ± 0,15 La:AcNa:W 135,07 ± 1,06
ChCl:U 57,78 ± 1,42 Pro:La 39,22 ± 1,24
ChCl:Glic 49,07 ± 1,34 Pro:Glic 56,54 ± 1,70
ChCl:Eg 76,10 ± 0,27 Pro:Ox 55,94 ± 3,69
ChCl:La 83,95 ± 0,57 Bet:Glic:W 57,76 ± 0,86
ChCl:Ox 108,89 ± 0,84 Bet:Eg:W 72,35 ± 1,85
ChCl:But 90,26 ± 0,59
-26-
Polifenoles totales
160
140
120
100
80
60
40
20
Figura 4.3. Efecto de diferentes NADES sobre la eficiencia de extracción de polifenoles totales
en comparación con una mezcla de metanol / agua (80:20).
Atendiendo a los resultados, se observa que los mayores rendimientos de

extracción de polifenoles totales se obtienen con los NADES que emplean ácidos como
aceptores de enlaces de hidrógeno, superando, en todos los casos, el rendimiento de
extracción con metanol al 80%, lo que concuerda con los resultados obtenidos previos
(Bakirtzi, Triantafyllidou y Makris 2016; Zainal-Abidin et al. 2017). Dentro de este grupo,
la combinación más eficiente resultó ser la de ácido láctico, acetato de sodio y agua,
mostrando un rendimiento de extracción mayor al del metanol en torno a un 55%.
El segundo grupo con mayores rendimientos de extracción es el de NADES
formados a partir de cloruro de colina. En este caso, no todos los disolventes superan
la extracción con metanol, influyendo positivamente la adición de agua en la síntesis de
NADES como un tercer componente o el uso de un componente hidratado como el ácido
oxálico. Esto favorece la polaridad de la mezcla y con ello el rendimiento de extracción,
tal y como se mostró en estudios similares, a partir de hojas de olivo (Nam et al. 2015;
Huang et al. 2017; Zhou et al. 2018). Este efecto puede observarse en el la Figura 4.3
si comparamos ChCl:U, ChCl:Glic y ChCl:Eg con sus análogos acuosos ChCl:U:W,
ChCl:Glic:W y ChCl:Eg:W Dentro de este grupo, la combinación más eficiente fue
ChCl:Ox, mostrando un rendimiento de extracción superior al del metanol en un 25%.
Los grupos de disolventes que utilizan prolina y betaína como aceptores de
hidrógeno mostraron menor rendimiento de extracción que el metanol, resultados que
concuerdan con un estudio similar en hojas de morera (Zhou et al. 2018). La viscosidad
de los NADES de estos grupos influyó desfavorablemente en los rendimientos de
extracción.
-27-
4.2.2. Determinación de la actividad antioxidante
La actividad antioxidanre, expresada en mg de equivalente a Trolox por gramo de

hoja, se determinó siguiendo el método espectrofotométrico del DPPH, descrito en el
apartado 3.4.2. La Figura 4.4 recoge la representación gráfica de la recta de calibrado
de los distintos valores de absorbancia frente a los valores de concentración de las
disoluciones patrón.
Actividad antioxidante
0,9
Absorbancia (U.A)
0,8
0,7 y = -0,002x + 0,8283
0,6 R² = 0,996
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 500,0
Concentración (mg/L)
Figura 4.4. Representación gráfica de la recta de calibrado de la actividad antioxidante.
La actividad antioxidante, para cada una de las muestras, se obtiene interpolando los
valores de absorbancia en la ecuación de la recta, teniendo en cuenta las diluciones
realizadas. Los resustados, expresados en mg de equivalente a Trolox por g de hoja
seca, se recogen en la Tabla 4.3 y se representan graficamente, mediante un diagrama
de barras en la Figura 4.5.
Tabla 4.3. Concentración de actividad antioxidante de cada extracto.
Extractante Concentración (mg/g) Extractante Concentración (mg/g)
MeOH 130,12 ± 2,05 La:Glu:W 102,43 ± 1,35

ChCl:U:W 131,02 ± 0,71 La:Gly:W 152,44 ± 0,20
ChCl:Glic:W 107,85 ± 1,02 Ca:Glu [20% W] 151,97 ± 0,41
ChCl:Eg:W 133,65 ± 0,76 La:AcNa:W 153,15 ± 0,04
ChCl:U 108,99 ± 2,74 Pro:La 73,25 ± 2,52
ChCl:Glic 97,13 ± 1,46 Pro:Glic 103,57 ± 3,30
ChCl:Eg 123,59 ± 0,61 Pro:Ox 111,45 ± 1,43
ChCl:La 99,11 ± 0,95 Bet:Glic:W 109,17 ± 1,98
ChCl:Ox 136,65 ± 1,33 Bet:Eg:W 128,75 ± 0,86
ChCl:But 114,06 ± 2,74
-28-
Actividad antioxidante
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Figura 4.5. Efecto de diferentes NADES sobre la eficiencia de extracción de actividad

antioxidante en comparación con una mezcla de metanol / agua (80:20).
Se puede observar, al igual que ocurre en la determinación de polifenoles totales,

que los mayores valores para la actividad antioxidante de los extractos obtenidos se
presentan para el grupo de disolventes que emplean ácidos como aceptores de
hidrógeno, superando tres de ellos el valor del extracto metanólico. Resultados
similares, empleando ácido láctico con diferentes donadores de hidrógeno, fueron
obtenidos por Bakirtzi y col. (2016). Dentro de este grupo, la combinación más eficiente
resultó ser, nuevamente, la de ácido láctico, acetato de sodio y agua, mostrando un
rendimiento de extracción superior al de metanol en un 15%.
El segundo grupo con mayores valores para la actividad antioxidante es el de
disolventes preparados con cloruro de colina. En este caso, solo tres de los NADES
superan la actividad antioxidante del extracto obtenido con MeOH al 80%. Esto podría
ser debido a la adición de agua en la síntesis de los disolventes, como es el caso del
ChCl:U:W y del ChCl:Eg:W, o el uso de un componente hidratado como es el ácido
oxálico, utilizado en la combinación de ChCl:Ox, favorecen la polaridad de la mezcla y
con ello la extracción de compuestos con actividad antioxidante, tal y como se mostró
en estudios similares, a partir de hoja de olivo (Mouratoglou, Malliou y Makris 2016;
Jeong et al. 2018). En la Figura 4.5 se puede observar que los extractos obtenidos con
los NADES que contienen agua tienen mayor actividad antioxidante. Dentro de este
grupo, la combinación más eficiente fue, al igual que en la extracción de polifenoles
totales, la de cloruro de colina y ácido oxálico dihidratado, mostrando los extractos una
actividad antioxidante mayor al de los extractos metanólicos en un 5%.
Los extractos obtenidos con los NADES de prolina y betaína como aceptores de
hidrógeno resultaron tener menor actividad antioxidante que los obtenidos con metanol,
de acuerdo con un estudio similar, realizado en hojas de morera (Zhou et al. 2018). Esto
puede deberse a la elevada viscosidad que presentan estas mezclas.
-29-
4.3. CARACTERIZACIÓN DE NADES
4.3.1. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear
Siguiendo la metodología descrita en el apartado 3.5.1 se realiza el análisis

espectroscópico de resonancia magnética nuclear (RMN). A modo de ejemplo se
muestra el espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Eg. Los espectros de RMN del resto de
disolventes analizados se recogen en el Anexo 7.2 del presente trabajo.
Figura 4.6. Espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Eg.
RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz, δ ppm): δ=5.51 (t, 1Ha J=4.12 Hz), 4.51 (t, 2He, J=5.40
Hz), 3.82 (c, 2Hb, J=4.85 Hz), 3.42 (t, 2Hc, J=5.30 Hz), 3.38 (c, 4Hf, J=2.67 Hz), 3.13 (s,
9Hd).
En la Figura 4.6 se observa que se no dan reacciones en el proceso de síntesis ya que

en el espectro de RMN para el líquido eutéctico aparecen las mismas señales
espectroscópicas y a los mismos desplazamientos que se encuentran en los espectros
de los componentes que lo forman, tal y como se muestra en estudios similares (Yang
et al. 2013; Abou-Taleb et al. 2020).
-30-
4.3.2. Estudio reológico
Se seleccionaron para el estudio reológico dos grupos de NADES, los formados con
cloruro de colina y ácido láctico como aceptores de hidrógeno, variando la sustancia
donadora. En la Tabla 4.4 se recogen los resultados de las medidas de viscosidad de
los NADES seleccionados, realizadas siguiendo la metodología descrita en el apartado
3.5.2.
En el estudio de la viscosidad se observa que los NADES siguen el comportamiento
de un fluido newtoniano, ya que la viscosidad se mantuvo constante con el aumento del
esfuerzo de cizallamiento.
Si se representa el contenido en polifenoles totales frente a la viscosidad del NADE
(Figura 4.7), se observa que en el grupo de NADES formados por ácido láctico la
capacidad de extracción de compuestos fenólicos aumenta con la disminución de la
viscosidad. Para el grupo de NADES formados por cloruro de colina se muestra la
misma tendencia. Como se ha observado en otros estudios, la capacidad de extracción
de compuestos fenólicos aumenta con la disminución de la viscosidad (Wang et al.
2015). Esto puede ser debido a la que los fluidos menos viscosos penetran con mayor
facilidad en la matriz de la muestra.
Polifenoles vs. Viscosidad
Tabla 4.4. Medidas de viscosidad, 160
η, (Pa s).
140
120 ChCl:Eg:W
NADE η (Pa s)
100
ChCl:GlIC
ChCl:Eg:W 0.029 80
ChCl:Eg
ChCl:Glic 0.400 60
La:Gly:W
ChCl:Eg 0.049 40
La:AcNa:W
La:Gly:W 0.083 20
La:AcNa:W 0.040 0
0 0,2 0,4 0,6
Figura 4.7. Relación entre la cantidad de polifenoles

extraída (mg/g) y la viscosidad del NADE (Pa s).
4.3.3. Medidas de pH
La Tabla 4.5 muestra los valores de pH para los NADES sintetizados siguiendo la
metodología descrita en el apartado 3.5.3.
Tabla 4.5. Valores de pH de los NADES sintetizados.
NADE pH NADE pH NADE pH

ChCl:U:W 8 ChCl:La 2 La:AcNa:W 2
ChCl:Glic:W 7 ChCl:Ox 1 Pro:La 3
ChCl:Eg:W 8 ChCl:But 7 Pro:Glic 8
ChCl:U 8 La:Glu:W 1 Pro:Ox 1
ChCl:Glic 7 La:Gly:W 2 Bet:Glic:W 7
ChCl:Eg 8 Ca:Glu [20% W] 2 Bet:Eg:W 7
-31-
A partir de los valores de pH obtenidos para cada uno de los NADES (Tabla 4.5) se
observa que tienen una gran variedad de pH, dependiendo de los componentes
utilizados. Además, no se ha observado influencia significativa entre el pH de los NADES
y la capacidad de extracción de polifenoles totales.
4.4. OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE EXTRACCIÓN
A la vista de los resultados obtenidos para la extracción asistida por ultrasonidos de

polifenoles totales y actividad antioxidante presentes en las hojas de arándano, se
seleccionan los dos disolventes, cada uno de un grupo diferente, que proporcionaron
los mejores resultados. Los dos grupos con mayores rendimientos de extracción y
actividad antioxidante fueron el de NADES de cloruro de colina y el NADES de ácidos,
y dentro de cada uno de ellos, las combinaciones de ChCl:Ox y La:AcNa:W, como se
ha comentado en los apartados 4.2.1 y 4.2.2.
Inicialmente las respuestas analizadas fueron el contenido en polifenoles totales de los
extractos y su actividad antioxidante, pero tras realizar el proceso de extracción, se
observó una clara diferencia de color entre los extractos de los dos NADES. Los de
ChCl:Ox presentaban una coloración rojiza, mientras que los extractos de La:AcNa;W
mostraban una tonalidad verdosa, por lo que se procedió a realizar la determinación de
antocianos totales como nueva variable de respuesta. En las Figuras 4.8 y 4.9 se
muestran diferentes extractos obtenidos empleando como extractantes ChCl:Ox y
La:AcNa:W, respectivamente.
En la Tabla 4.6 se muestra la matriz de diseño experimental y los resultados del proceso
de extracción para la mezcla de ChCl:Ox. En la Tabla 4.7 se muestra la matriz de diseño
experimental y los resultados del proceso de extracción para la mezcla de La:AcNa:W.
Figura 4.8. Extractos de hojas de arándano Figura 4.9. Extractos de hojas de arándano
con ChCl:Ox. con La:AcNa:W.
-32-
Tabla 4.6. Matriz de diseño experimental (33) y resultados de la optimización del proceso de extracción empleando ChCl:Ox como extractante.
Variable independiente Resultados de la extracción

Orden aleatorio
Polifenoles totales Actividad antioxidante Antocianinas totales
X1 X2 X3
(mg/g) (mg/g) (102 mg/g)
14 45 45 30 68,87 179,10 38,67
7 30 45 75 79,41 275,28 33,77
13 45 45 30 113,92 118,64 43,75
3 30 65 30 99,15 165,75 80,15
1 30 25 30 24,75 121,43 11,20
11 45 25 75 82,46 300,37 43,62
2 60 25 30 92,03 161,82 9,98
6 60 45 15 93,08 119,67 30,68
12 45 65 75 136,40 368,34 217,95
5 30 45 15 76,87 108,78 14,39
4 60 65 30 195,51 233,72 58,75
15 45 45 30 98,01 176,29 43,66
9 45 25 15 52,31 99,02 8,10
10 45 65 15 133,95 168,42 65,13
8 60 45 75 111,21 299,72 43,19
X1: tiempo (min); X2: temperatura (º C); X3: ratio
-33-
Tabla 4.7. Matriz de diseño experimental (33) y resultados de la optimización del proceso de extracción empleando La:AcNa:W como extractante.
Variable independiente Resultados de la extracción

Orden aleatorio
Polifenoles totales Actividad antioxidante Antocianinas totales
X1 X2 X3
(mg/g) (mg/g) (102 mg/g)
14 45 45 30 100,25 126,34 0
7 30 45 75 86,76 73,07 0
13 45 45 30 90,18 117,93 0
3 30 65 30 97,07 159,64 0
1 30 25 30 38,32 55,95 0
11 45 25 75 108,82 63,88 0
2 60 25 30 83,81 98,33 0
6 60 45 15 76,57 116,74 0
12 45 65 75 148,54 145,88 0
5 30 45 15 71,56 90,66 0
4 60 65 30 126,39 217,85 0
15 45 45 30 57,55 102,32 0
9 45 25 15 47,70 80,77 0
10 45 65 15 142,52 220,03 0
8 60 45 75 99,25 69,50 0
X1: tiempo (min); X2: temperatura (º C); X3: ratio
-34-
A partir de los resultados obtenidos (Tablas 4.6 y 4.7) se analizó el efecto de los
diferentes factores sobre la eficacia del proceso de extracción a través de los diagramas
de Pareto, el análisis de la varianza (ANOVA), superficies de respuesta y los diagramas
de probabilidad. En los diagramas de Pareto, la longitud de cada barra es proporcional
al efecto estandarizado (efecto estimado dividido por su error estándar), pudiendo
emplearse la línea vertical para juzgar qué efectos son estadísticamente significativos a
un valor de 95% de confianza.
La validez estadística de estos modelos fue evaluada mediante un análisis de la
varianza o ANOVA con un nivel de confianza del 95% para cada variable de respuesta
y la importancia de cada cociente se determinó utilizado la prueba F, por comparación
entre las F de Snédecor, Fcalculada y Ftabulada (probabilidad p<0.05). En resumen, un
modelo se considera bien adaptado a los datos experimentales si presenta una
regresión significativa y una falta de ajuste no significativa. Considerando los factores
cuyo valor de p es menor de 0.05, es decir, aquellos que son significativamente
diferentes de cero al 95% de confianza, pueden determinarse los factores más
influyentes. Este estudio, permite confirmar lo obtenido en el diagrama de Pareto.
En la metodología de superficie de respuesta (RSM) se representa en el eje Z la variable
respuesta frente a los dos factores más significativos (eje X y eje Y). De esta gráfica se
deduce la dirección en la que hay que moverse sobre dicha superficie para lograr
encontrar el óptimo en el cual la respuesta alcanzaría un valor máximo.
Finalmente, se aplicó un enfoque de función de conveniencia (Desirability). Este método
se basa en la transformación de cada variable de respuesta en un valor sin dimensiones.
El valor de la función de desiderabilidad oscila entre 0 y 1. El valor 0 se observa cuando
los factores dan resultados indeseables, mientras que el valor 1 se atribuye a una
respuesta óptima para los factores de estudio (Lee, Jeong y Kim 2018). Este enfoque
se utiliza para producir una formulación robusta deseada que cumpla con la máxima
necesidad de todas las respuestas dentro de las restricciones dadas.
4.4.1. Optimización del proceso de extracción empleando ChCl:Ox
En la Figura 4.10 se muestran los diagramas de Pareto obtenidos considerando

como respuesta el contenido de polifenoles totales, actividad antioxidante y antocianos
totales.
(2) TEMPERATURA (L)
(2)TEMPERATURA(L) 5,3590 (3) RATIO (L)
(3)RATIO(L) 12,356
(1) TIEMPO (L)

(1)TIEMPO(L)
3,618411 (2) TEMPERATURA (L)
(2)TEMPERATURA(L)
4,190196
TEMPERATURA (Q)TEMPERATURA(Q)
-,947725 (1) TIEMPO (L) (1)TIEMPO(L)
2,374487
(3) RATIO (L)

(3)RATIO(L)
,9107194 TEMPERATURA (Q)
TEMPERATURA(Q)
-2,05858
RATIO(Q)
,5146246 TIEMPO (Q)
TIEMPO(Q)
,9207167
TIEMPO(Q)
,0873497 RATIORATIO(Q)
(Q) -,541461
p=,05 p=,05
POLIFENOLES TOTALES
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
(2) TEMPERATURA (L)

(2)TEMPERATURA(L) 3,778049
(3) RATIO (L)

(3)RATIO(L)
2,383433
TIEMPO (Q) TIEMPO(Q)
1,623373 2
TEMPERATURA (Q)
TEMPERATURA(Q) -1,50546 2
RATIO RATIO(Q)
(Q) -,128921
(1) TIEMPO (L)

(1)TIEMPO(L) ,0333653
p=,05
ANTOCIANOS TOTALES
Figura 4.10. Diagramas de Pareto estandarizados para el diseño 33 (ChCl:Ox).
-35-
Se observa que la temperatura tiene un efecto significativo sobre las tres respuestas
analizadas, la ratio influye de manera significativa sobre la actividad antioxidante,
mientras que el tiempo de extracción influye principalmente en la extracción de
polifenoles totales y en la actividad antioxidante.
Se procede a realizar el análisis de la varianza o ANOVA con un nivel de confianza
del 95% para cada variable de respuesta (Tablas 4.8, 4.9 y 4.10), con el objetivo de
confirmar las observaciones realizadas sobre los diagramas de Pareto (Figura 4.10).
Tabla 4.8. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de polifenoles totales

mediante ChCl:Ox para el diseño 33.
SS df MS F P
(1) TIEMPO (L) 5598,74 1 5598,74 13,09290 0,006798
TIEMPO (Q) 3,26 1 3,26 0,00763 0,932540
(2) TEMPERATURA(L) 12281,09 1 12281,09 28,71985 0,000678
TEMPERATURA(Q) 384,08 1 384,08 0,89818 0,371014
(3) RATIO (L) 354,67 1 354,67 0,82941 0,389059
RATIO (Q) 113,25 1 113,25 0,26484 0,620728
Error 3420,94 8 427,62
Total SS 22088,35 14
R2 0.845
SS: suma de cuadrados; df: grados de libertad; MS: media de cuadrados; p: nivel de significación
Como se puede observar, el modelo confirma los resultados del diagrama de Pareto
(Figura 4.10), donde tanto el tiempo como la temperatura presentan efectos
significativos (p<0.05) en el proceso de extracción de polifenoles totales. El modelo
explica un elevado porcentaje de la varianza de los datos, como se puede apreciar en
el valor de coeficiente de regresión (R2 = 0.845).
Tabla 4.9. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de actividad antioxidante

SS df MS F p
(1) TIEMPO (L) 2581,25 1 2581,25 5,6382 0,044931

TIEMPO (Q) 388,10 1 388,10 0,8477 0,384122
(2) TEMPERATURA(L) 8038,20 1 8038,20 17,5577 0,003037
TEMPERATURA(Q) 1940,10 1 1940,10 4,2377 0,073522
(3) RATIO (L) 69902,86 1 69902,86 152,6879 0,000002
RATIO (Q) 134,22 1 134,22 0,2932 0,602938
Error 3662,52 8 457,82
Total SS 96834,25 14
R2 0.96218
-36-
Al igual que en el caso anterior, el modelo confirma los resultados del diagrama de
Pareto (Figura 4.10), donde, tanto la temperatura como la ratio presentan efectos
significativos (p<0.05) en el proceso de extracción de actividad antioxidante. El modelo
explica un porcentaje elevado de la varianza de los datos, como se puede apreciar en
el valor de coeficiente de regresión (R2 = 0.96218), lo cual indica un buen ajuste del
método.
Tabla 4.10. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de antocianos totales

SS df MS F p
(1) TIEMPO (L) 0,000119 1 0,000119 0,00111 0,974201

TIEMPO (Q) 0,281215 1 0,281215 2,63534 0,143166
(2) TEMPERATURA(L) 1,523130 1 1,523130 14,27366 0,005403
TEMPERATURA(Q) 0,241846 1 0,241846 2,26640 0,170625
(3) RATIO (L) 0,606188 1 0,606188 5,68075 0,044308
RATIO (Q) 0,001774 1 0,001774 0,01662 0,900603
Error 0,853673 8 0,106709
Total SS 3,647880 14
R2 0.76598
Cuando se realiza el análisis de la varianza para el contenido en antocianos, el

modelo confirma los resultados del diagrama de Pareto (Figura 4.10), donde la
temperatura y la ratio presentan efectos significativos (p<0.05) en el proceso de
extracción de actividad antioxidante. Al igual que en los modelos anteriores, este explica
un elevado porcentaje de la varianza de los datos, como se puede apreciar en el valor
de coeficiente de regresión (R2 = 0.76598).
Una vez identificados los factores que influyen significativamente en la extracción
de los diferentes compuestos fenólicos se lleva a cabo un análisis de superficie de
respuesta (Figura 4.11) con objeto de encontrar los valores óptimos de estos factores.
De estas gráficas se deduce la dirección en la que hay que moverse sobre dicha
superficie para lograr encontrar el óptimo en el cual la respuesta alcanza su valor
máximo.
Para la extracción de polifenoles totales se representa en el eje Z la concentración
en mg/ g de hoja seca frente a los dos factores significativos; tiempo (eje X) y
temperatura (eje Y). Tanto para la actividad antioxidante como para la concentración de
antocianos totales los dos factores significativos son la temperatura de extracción y la
ratio. Por lo que se representan en el eje Z la concentración en mg/g frente a la ratio (eje
X) y temperatura (eje Y).
-37-
POLIFENOLES TOTALES ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
ANTOCIANOS TOTALES
Figura 4.11. Diagramas de superficie de respuesta (ChCl:Ox).
Para los tres casos de estudio los puntos críticos de extracción se alcanzan fuera
del diseño experimental. Esto es debido principalmente a la influencia positiva de la
temperatura en la extracción ya que el aumento de la misma conlleva a mayores
rendimientos de extracción.
Por último, se representan los valores predichos y la función ‘Desirability’ (Figura
4.12) para las concentraciones de polifenoles totales, actividad antioxidante y
antocianos, de donde se puede concluir las condiciones óptimas de extracción de
polifenoles totales, actividad antioxidante y antocianos empleando ChCl:Ox como
extractante.
-38-
Figura 4.12. Perfiles de valores predichos y desiderabilidad (ChCl:Ox).
Se puede concluir que el tiempo óptimo de extracción se alcanza a los 45 minutos

y que el aumento de la temperatura y la ratio mejora los rendimientos de extracción y
que los puntos óptimos no se encuentran dentro del diseño experimental, por tanto,
serían necesarios estudios complementarios. Dentro del diseño los valores óptimos para
la extracción son:
• Tiempo: 45 minutos
• Temperatura: 65 ºC
• Ratio: 75
-39-
4.4.2. Optimización del proceso de extracción empleando La:AcNa:W
Como se observa en la Tabla 4.7 no se extrajo antocianos utilizando la combinación

La:AcNa:W como extractante en ninguna de las condiciones del diseño experimental,
obteniendo en todos los casos un valor de cero.
En la Figura 4.13 se muestran los diagramas de Pareto obtenidos considerando
como respuesta el contenido de polifenoles totales y actividad antioxidante.
(2) TEMPERATURA (L)

(2)TEMPERATURA(L) 4,72646 (2) TEMPERATURA (L)
(2)TEMPERATURA(L) 9,375849
(3) RATIO (L)

(3)RATIO(L)
2,10477 TEMPERATURA (Q)
TEMPERATURA(Q)
-3,29918
(1) TIEMPO (L)

(1)TIEMPO(L)
1,84998 (3) RATIO (L)
(3)RATIO(L) -3,28798
TEMPERATURA (Q)
TEMPERATURA(Q) -1,748 (1) TIEMPO (L)
(1)TIEMPO(L) 2,596588
TIEMPO (Q)TIEMPO(Q)
1,34075 TIEMPO (Q) TIEMPO(Q)
1,303353
RATIORATIO(Q)
(Q) -,682764 RATIORATIO(Q)
(Q) ,7520034
p=,05 p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value) Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 4.13. Diagramas de Pareto estandarizados para el diseño 33 (La:AcNa:W).
Se observa que la temperatura tiene un efecto significativo sobre las dos respuestas
analizadas, mientras que la ratio y el tiempo de extracción únicamente influyen de
manera significativa sobre la actividad antioxidante.
Se procede a realizar el análisis de la varianza o ANOVA con un nivel de confianza
del 95% para cada variable de respuesta (Tablas 4.11 y 4.12), con el objetivo de
confirmar las observaciones realizadas a partir de los diagramas de Pareto (Figura 4.13).
Tabla 4.11. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de polifenoles totales

mediante La:AcNa:W para el diseño 33.
SS df MS F p
(1) TIEMPO L+Q 1624,87 2 812,433 2,61002 0,134100
(2) TEMPERATURA L+Q 7904,81 2 3952,407 12,69747 0,003293
(3) RATIO L+Q 2020,88 2 1010,438 3,24613 0,092857
Error 2490,20 8 311,275
Total SS 14143,75 14
2
R 0.82394
Como se observa en la tabla, el modelo confirma los resultados del diagrama de

Pareto (Figura 4.13), donde la temperatura es el único factor que presenta efectos
significativos (p<0.05) en el proceso de extracción de polifenoles totales. El modelo
explica un elevado porcentaje de la varianza de los datos, como se puede apreciar en
el valor de coeficiente de regresión (R2 = 0.82394).
-40-
Tabla 4.12. Análisis de la varianza en la optimización de la extracción de actividad antioxidante
mediante La:AcNa:W para el diseño 33.
SS df MS F p
(1)TIEMPO L+Q 2371,24 2 1185,62 4,22050 0,056059
(2)TEMPERATURA L+Q 27752,40 2 13876,20 49,39557 0,000031
(3)RATIO L+Q 4062,95 2 2031,47 7,23150 0,016088
Error 2247,36 8 280,92
Total SS 36813,88 14
2
R 0.93895
Al igual que en el caso anterior, el modelo confirma los resultados del diagrama de
Pareto (Figura 4.13), donde tanto la ratio como la temperatura presentan efectos
significativos en el proceso de extracción de actividad antioxidante. La temperatura
también tiene influencia sobre la respuesta. El modelo explica un porcentaje elevado de
la varianza de los datos, como se puede apreciar en el valor de coeficiente de regresión
(R2 = 0.93895), lo cual indica un buen ajuste del método.
Una vez identificados los factores que influyen significativamente en la extracción
de polifenoles totales y actividad antioxidante se lleva a cabo un análisis de superficie
de respuesta (Figura 4.14) con objeto de encontrar los valores óptimos de estos
factores. De estas gráficas se deduce la dirección en la que hay que moverse sobre
dicha superficie para lograr encontrar el óptimo en el cual la respuesta alcanza su valor
máximo.
Para los dos casos de estudio, los dos factores que mayores efectos presentan
sobre son la respuesta son la ratio y la temperatura de extracción. Por lo que se
representan en el eje Z la concentración en mg/g frente a la ratio (eje X) y temperatura
(eje Y). Tanto para la concentración de polifenoles totales como para la actividad
antioxidantes los puntos críticos de extracción se alcanzan fuera del diseño
experimental. Esto se debe principalmente a la influencia positiva de la temperatura en
la extracción ya que el aumento de la misma conlleva a mayores rendimientos de
extracción.
Figura 4.14. Diagramas de superficie de respuesta (La:AcNa).
-41-
Finalmente, se representan los valores predichos y la función ‘Desirability’ (Figura

4.15) para la concentraciones de polifenoles totales y la actividad antioxidante, de donde
se puede concluir las condiciones óptimas de extracción empleando La:AcNa como
extractante.
Figura 4.15. Perfiles de valores predichos y desiderabilidad (La:AcNa:W).
Se puede concluir que el tiempo óptimo de extracción se alcanza a los 45 minutos

al igual que en el caso anterior, y que para una ratio de 38 el aumento de la temperatura
mejora los rendimientos de extracción, pero el valor óptimo no se encuentra dentro del
diseño experimental, por tanto, para predecirlo serían necesarias más experiencias.
Dentro del diseño, los valores óptimos para la extracción son:
• Tiempo: 45 minutos
• Temperatura: 65 ºC
• Ratio: 38
-42-
5. CONCLUSIONES
1. Se han sintetizado 18 disolventes eutécticos profundos naturales (NADES),

empleando como aceptores de hidrógeno (cloruro de colina, ácido láctico, ácido
cítrico, prolina y betaína) y como donadores de hidrógeno (urea, glicerol,
etilenglicol, ácido láctico, ácido oxálico dihidratado, 1,4-butanodiol, glucosa,
glicina y acetato de sodio).
2. Se ha evaluado la capacidad extractante de los NADES preparados utilizando
como matriz la hoja de arándano y determinando el contenido en polifenoles
totales y la actividad antioxidante de los extractos obtenidos, utilizando como
referencia los extractos realizados con MeOH al 80%.
3. Todos los NADES basados en ácidos como aceptores de hidrógeno mostraron
rendimientos de extracción de compuestos fenólicos en hojas de arándanos
superiores a los obtenidos para el MeOH al 80%, mientras que los NADES
formados a partir de cloruro de colina mostraron rendimientos similares al del
disolvente orgánico salvo para ChCl:Ox y ChCl:But para los que fueron
ligeramente superiores.
4. Los NADES preparados a partir de aminoácidos como la betaína y la prolina,
mostraron rendimientos de extracción inferiores a los de MeOH al 80%.
5. La eficiencia de la extracción de los NADES puede verse afectada por su
viscosidad, que puede ser regulada a través de la combinación con agua.
6. Se han optimizado la temperatura, la ratio hoja/disolvente y el tiempo de
extracción para las mezclas eutécticas ChCl:Ox y La:AcNa:W mediante un
diseño experimental de Box-Behnken (33), analizando como respuesta el
contenido en polifenoles totales, la actividad antioxidante y el contenido en
antocianos.
7. Los valores óptimos para la extracción utilizando la mezcla ChCl:Ox obtenidos
a partir de los resultados del diseño experimental fueron: tiempo de extracción
45 minutos, temperatura 65 ºC y ratio 75.
8. Los valores óptimos para la extracción utilizando la mezcla La:AcNa:W
obtenidos a partir de los resultados del diseño experimental fueron: tiempo de
extracción 45 minutos, temperatura 65 ºC y ratio 38.
9. La caracterización de los NADES mediante espectroscopía de RMN 1H {13C}
mostró que no se producían reacciones en el proceso de síntesis.
10. La caracterización reológica de los NADES mostró que la capacidad como
extractante aumentaba con la disminución de la viscosidad.
11. Estos disolventes se pueden utilizar como un método alternativo para la
extracción ecológica y eficiente de compuestos fenólicos a partir de fuentes
naturales. Esta nueva estrategia puede representar un enfoque sostenible para
los productos bioactivos, y con ello, hacer que la fitoquímica sea más atractiva
y respetuosa con el medio ambiente.
-43-
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBOTT, A.P., CAPPER, G. y DAVIES, D.L., RASHEED, RK.,TAMBYRAJAH, V. 2003.

Novel solvent properties of choline chloride/urea mixtures. Chem. Commun, pp. 70-
71.
ABBOTT, A.P., CAPPER, G., DAVIES, D.L., MUNRO, H.L., RASHEED, R.K. y
TAMBYRAJAH, V., 2001. Preparation of novel, moisture-stable, Lewis-acidic ionic
liquids containing quaternary ammonium salts with functional side chains. Chemical
Communications, no. 19, pp. 2010-2011. ISSN 1359-7345. DOI 10.1039/B106357J.
Disponible en: http://dx.doi.org/10.1039/B106357J.
ABBOTT, A.P., HARRIS, R.C., RYDER, K.S., D’AGOSTINO, C., GLADDEN, L.F. y
MANTLE, M.D., 2011. Glycerol eutectics as sustainable solvent systems. Green
Chemistry, vol. 13, no. 1, pp. 82-90.
ABOU-TALEB, N.H., EL-SHERBINY, D.T., EL-ENANY, N.M. y EL-SUBBAGH, H.I.,
2020. A novel application of deep eutectic solvents in quantitative nuclear magnetic
resonance using grey relational analysis for multi-response optimization.
Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, vol. 206, pp. 104125. ISSN
0169-7439.
ALLEN, F.M., 1927. Blueberry leaf extract: physiologic and clinical properties in relation
to carbohydrate metabolism. Journal of the American Medical Association, vol. 89,
no. 19, pp. 1577-1581. ISSN 0002-9955.
ALONSO, D.A., BAEZA, A., CHINCHILLA, R., GÓMEZ, C., GUILLENA, G., MARSET,
X., PASTOR, I.M., RAMÓN, D.J., ROS, D. y SAAVEDRA, B., 2018. Mezclas
eutécticas como alternativa sostenible a los disolventes convencionales en
Química Orgánica. , vol. 114, no. 2, pp. 79-87.
ANASTAS, P. y EGHBALI, N., 2010. Green Chemistry: Principles and Practice.
Chemical Society Reviews, vol. 39, no. 1, pp. 301-312. ISSN 0306-0012. DOI
10.1039/B918763B. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1039/B918763B.
ANASTAS, P.T. y WARNER, J.C., 1998. Green Chemistry: Theory and Practice. Green
Chemistry: Theory and Practice, Oxford University Press, New York,
ANDERSON, A.C., 2006. Cosecha De Arandano Buenas Practicas Agricolas. Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria.
BAKIRTZI, C., TRIANTAFYLLIDOU, K. y MAKRIS, D.P., 2016. Novel lactic acid-based
natural deep eutectic solvents: Efficiency in the ultrasound-assisted extraction of
antioxidant polyphenols from common native Greek medicinal plants. Journal of
Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, vol. 3, no. 3, pp. 120-127.
ISSN 2214-7861. DOI https://doi.org/10.1016/j.jarmap.2016.03.003.
BALASUNDRAM, N., SUNDRAM, K. y SAMMAN, S., 2006. Phenolic compounds in
plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential
uses. Food chemistry, vol. 99, no. 1, pp. 191-203. ISSN 0308-8146.
BALLESTER ESPIGARES, I.M., 2006. Relación estructura-actividad de los flavonoides
como agentes antiinflamatorios intestinales. Tesis Doctoral. Universidad de
Granada. Facultad de Farmacia. Granada. España.
BARNES, J.S., NGUYEN, H.P., SHEN, S. y SCHUG, K.A., 2009. General method for
extraction of blueberry anthocyanins and identification using high performance
liquid chromatography–electrospray ionization-ion trap-time of flight-mass
spectrometry. Journal of Chromatography A, vol. 1216, no. 23, pp. 4728-4735.
ISSN 0021-9673.
-44-
BARRETO, M.A., CÁNOVES, A.F. y MÁS, M.J.E., 2016. Determinación de polifenoles

totales en arándanos y productos derivados. UCV-Scientia, vol. 8, no. 1, pp. 13-21.
ISSN 2410-891X.
BENBROOK, C.M., 2005. Elevating antioxidant levels in food through organic farming
and food processing. S.l.: Organic Center Washington, DC.
BRAND-WILLIAMS, W., CUVELIER, M.-E. y BERSET, C., 1995. Use of a free radical
method to evaluate antioxidant activity. LWT-Food science and Technology, vol.
28, no. 1, pp. 25-30. ISSN 0023-6438.
CHATTERJEE, A., YASMIN, T., BAGCHI, D. y STOHS, S.J., 2004. Inhibition of
Helicobacter pylori in vitro by various berry extracts, with enhanced susceptibility to
clarithromycin. Molecular and cellular biochemistry, vol. 265, no. 1-2, pp. 19-26.
ISSN 0300-8177.
CHOI, Y.H., VAN SPRONSEN, J., DAI, Y. y VERBENE, M., 2011. F. hollmann, IWCE
Arends, GJ Witkamp and R. Verpoorte. Plant Physiol, vol. 156, pp. 1701-1705.
CLARK, J.H. y TAVENER, S.J., 2007. Alternative Solvents: Shades of Green. Organic
Process Research & Development, vol. 11, no. 1, pp. 149-155. ISSN 1083-6160.
DOI 10.1021/op060160g. Disponible en: https://doi.org/10.1021/op060160g.
CONCEIC, H.F., 2020. Eutectic Mixtures Based on Polyalcohols as Sustainable
Solvents: Screening and Characterization ́. ACS Sustainable Chem. Ing. 8 ,
40 , 15317–15326 , DOI 10.1021/acssuschemeng.0c05518.
CORTÉS-TRIVIÑO, E., VALENCIA, C., DELGADO, M.A. y FRANCO, J.M., 2018.
Rheology of epoxidized cellulose pulp gel-like dispersions in castor oil: Influence of
epoxidation degree and the epoxide chemical structure. Carbohydrate polymers,
vol. 199, pp. 563-571. ISSN 0144-8617.
CRAFT, B.D., KERRIHARD, A.L., AMAROWICZ, R. y PEGG, R.B., 2012. Phenol‐based
antioxidants and the in vitro methods used for their assessment. Comprehensive
Reviews in Food Science and Food Safety, vol. 11, no. 2, pp. 148-173. ISSN 1541-
4337.
CUBERO-CARDOSO, J., SERRANO, A., TRUJILLO-REYES, Á., VILLA-GOMEZ, D.,
BORJA PADILLA, R. y FERMOSO, F.G., 2020. Valorization Options of Strawberry
Extrudate Agro-Waste. A Review. Innovation in the Food Sector Through the
Valorization of Food and Agro-Food By-Products. InTechOpen.
DAI, Y., VAN SPRONSEN, J., WITKAMP, G.-J., VERPOORTE, R. y CHOI, Y.H., 2013.
Natural deep eutectic solvents as new potential media for green technology.
Analytica chimica acta, vol. 766, pp. 61-68. ISSN 0003-2670.
Definición de reología - Qué es, Significado y Concepto.. [Consulta: 3 diciembre 2020].
Disponible en: https://definicion.de/reologia/.
DELL’AGLI, M., BUSCIALÀ, A. y BOSISIO, E., 2004. Vascular effects of wine
polyphenols. Cardiovascular Research, vol. 63, no. 4, pp. 593-602. ISSN 1755-
3245.
DOCHERTY, K.M. y KULPA JR, C.F., 2005. Toxicity and antimicrobial activity of
imidazolium and pyridinium ionic liquids. Green Chemistry, vol. 7, no. 4, pp. 185-
189.
DORIA SERRANO, M., 2009. Química verde: un nuevo enfoque para el cuidado del
medio ambiente. Educación química, vol. 20, no. 4, pp. 412-420. ISSN 0187-893X.
EARLE, M.J. y SEDDON, K.R., 2002. Ionic liquids: Green solvents for the future. . S.l.:
ACS Publications, ISBN 1947-5918.
-45-
EHLENFELDT, M.K. y PRIOR, R.L., 2001. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC)
and phenolic and anthocyanin concentrations in fruit and leaf tissues of highbush
blueberry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 49, no. 5, pp. 2222-2227.
ESCAMILLA JIMÉNEZ, C.I., CUEVAS MARTÍNEZ, E.Y. y GUEVARA FONSECA, J.,
2009. Flavonoides y sus acciones antioxidantes. Revista de la Facultad de
Medicina, vol. 52, no. 002. ISSN 0026-1742.
FANG, Y.L. y QIN, M.Z., 2003. Research advance of oriental blueberry. Shanghai
Journal of Traditional Chinese Medicine, vol. 37, no. 5, pp. 59-61.
FENNEMA, O., 1993. Química de los Alimentos. Food Chemistry. Zaragoza, Spain:
Editorial Acribia, SA,
FLORINDO, C., BRANCO, L.C. y MARRUCHO, I.M., 2019. Quest for Green‐Solvent
Design: From Hydrophilic to Hydrophobic (Deep) Eutectic Solvents.
ChemSusChem, vol. 12, no. 8, pp. 1549-1559. ISSN 1864-5631.
FLORINDO, C., LIMA, F., RIBEIRO, B.D. y MARRUCHO, I.M., 2019. Deep eutectic
solvents: overcoming 21st century challenges. Current Opinion in Green and
Sustainable Chemistry, vol. 18, pp. 31-36. ISSN 2452-2236.
GIMENO, X.M., 2019. Deep eutectic solvents: à la carte solvents for cross-coupling
reactions. 2019. S.l.: Universitat d’Alacant. Alicante. España.
GLADYSZ, J.A., CURRAN, D.P. y HORVATH, I.T., 2004. Handbook of Fluorous
Catalysis. 2004. S.l.: Wiley-VCH Verlag GmbH and Co., KGaA, Weinheim.
GODOY, C., 2002. El arándano: plantación y manejo del cultivo. [Consulta: 14
Noviembre 2020]. Disponible:
http://www.agrobit.com.ar/Documentos/I_1_7_Cultivos/MI000007ar.htm
GONZÁLEZ, M., 2019. Formación y caracterización de disolventes eutécticos
profundos: aplicación a la extracción de moléculas de interés. TFG, Universidad
Politéctica De Madrid. Madrid. España
GOZZI, I.M.S., 2011. Variabilidad de la capacidad antioxidante de extractos foliares de
arándano vaccinium ashei obtenidos en diferentes condiciones de extracción. Tesis
Doctoral. Universidad Nacional de San Martín. San Martín. Argentina.
GRACE, M.H., RIBNICKY, D.M., KUHN, P., POULEV, A., LOGENDRA, S., YOUSEF,
G.G., RASKIN, I. y LILA, M.A., 2009. Hypoglycemic activity of a novel anthocyanin-
rich formulation from lowbush blueberry, Vaccinium angustifolium Aiton.
Phytomedicine, vol. 16, no. 5, pp. 406-415. ISSN 0944-7113.
GRANDAL, M.D.F., 2000. Influencia de la hipertensión genética de rata en la producción
basal de óxido nítrico y estudio de los efectos vasodilatadores de distintos extractos
vegetales ricos en polifenoles. Universidad de Santiago de Compostela. Santiago
de Compostela. España.
HARRIS, C.S., BURT, A.J., SALEEM, A., LE, P.M., MARTINEAU, L.C., HADDAD, P.S.,
BENNETT, S.A.L. y ARNASON, J.T., 2007. A single HPLC‐PAD‐APCI/MS method
for the quantitative comparison of phenolic compounds found in leaf, stem, root and
fruit extracts of Vaccinium angustifolium. Phytochemical Analysis: An International
Journal of Plant Chemical and Biochemical Techniques, vol. 18, no. 2, pp. 161-169.
ISSN 0958-0344.
HUANG, Y., FENG, F., JIANG, J., QIAO, Y., WU, T., VOGLMEIR, J. y CHEN, Z.-G.,
2017. Green and efficient extraction of rutin from tartary buckwheat hull by using
natural deep eutectic solvents. Food Chemistry [en línea], vol. 221, pp. 1400-1405.
ISSN 0308-8146. DOI https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.11.013. Disponible
en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814616318350.
-46-
IGNAT, I., VOLF, I. y POPA, V.I., 2011. A critical review of methods for characterisation
of polyphenolic compounds in fruits and vegetables. Food chemistry, vol. 126, no.
4, pp. 1821-1835. ISSN 0308-8146.
JEONG, K.M., JIN, Y., YOO, D.E., HAN, S.Y., KIM, E.M. y LEE, J., 2018. One-step
sample preparation for convenient examination of volatile monoterpenes and
phenolic compounds in peppermint leaves using deep eutectic solvents. Food
Chemistry, vol. 251, pp. 69-76. ISSN 0308-8146. DOI
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.01.079. Disponible en:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814618300888.
JOSEPH, J.A., ARENDASH, G., GORDON, M., DIAMOND, D., SHUKITT-HALE, B.,
MORGAN, D. y DENISOVA, N.A., 2003. Blueberry supplementation enhances
signaling and prevents behavioral deficits in an Alzheimer disease model.
Nutritional neuroscience, vol. 6, no. 3, pp. 153-162. ISSN 1028-415X.
KAREEM, M.A., MJALLI, F.S., HASHIM, M.A. y ALNASHEF, I.M., 2010. Phosphonium-
based ionic liquids analogues and their physical properties. Journal of Chemical &
Engineering Data, vol. 55, no. 11, pp. 4632-4637. ISSN 0021-9568.
KHODDAMI, A., WILKES, M.A. y ROBERTS, T.H., 2013. Techniques for analysis of
plant phenolic compounds. Molecules, vol. 18, no. 2, pp. 2328-2375.
KOV, A., NEYTS, E.C., CORNET, I., WIJNANTS, M. y BILLEN, P., 2020. Modeling the
Physicochemical Properties of Natural Deep Eutectic Solvents. , pp. 3789-3804.
DOI 10.1002/cssc.202000286.
KROON, M C, FRANCISCO, M., BRUINHORST, A. Van Den y KROON, Maaike C,
2013. Low-Transition-Temperature Mixtures ( LTTMs ): A New Generation of
Designer Solvents. , vol. 2012, no. October 2012, pp. 3074-3085. DOI
10.1002/anie.201207548.
LAU, F.C., JOSEPH, J.A., MCDONALD, J.E. y KALT, W., 2009. Attenuation of iNOS and
COX2 by blueberry polyphenols is mediated through the suppression of NF-κB
activation. Journal of Functional Foods, vol. 1, no. 3, pp. 274-283. ISSN 1756-4646.
LEE, D., JEONG, I. y KIM, K., 2018. A desirability function method for optimizing mean
and variability of multiple responses using a posterior preference articulation
approach. Quality and Reliability Engineering International, vol. 34, no. 3, pp. 360-
376. ISSN 0748-8017.
LEE, J., DURST, R.W. y WROLSTAD, R.E., 2005. Determination of total monomeric
anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines
by the pH differential method: collaborative study. Journal of AOAC international,
vol. 88, no. 5, pp. 1269-1278. ISSN 1060-3271.
LI, C., FENG, J., HUANG, W.-Y. y AN, X.-T., 2013. Composition of polyphenols and
antioxidant activity of rabbiteye blueberry (Vaccinium ashei) in Nanjing. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, vol. 61, no. 3, pp. 523-531. ISSN 0021-8561.
LILLO, A., CARVAJAL-CAICONTE, F., NUÑEZ, D., BALBOA, N. y ZAMORA, M.A.,
2016. Cuantificacióne espectrofotométrica de compuestos fenólicos y actividad
antioxidante en distintos berries nativos del Cono Sur de América. RIA. Revista de
investigaciones agropecuarias, vol. 42, no. 2, pp. 168-174. ISSN 0325-8718.
MANACH, C., SCALBERT, A., MORAND, C., RÉMÉSY, C. y JIMÉNEZ, L., 2004.
Polyphenols: food sources and bioavailability. The American journal of clinical
nutrition, vol. 79, no. 5, pp. 727-747. ISSN 0002-9165.
MAQUILÓN ALBALADEJO, C., 2016. Complejos metálicos para la captura y fijación de
CO2 en moléculas orgánicas en disolventes eutécticos. Tesis Doctoral. Universidad
de Alicante. Alicante. España.
-47-
MARTINEAU, L.C., COUTURE, A., SPOOR, D., BENHADDOU-ANDALOUSSI, A.,

HARRIS, C., MEDDAH, B., LEDUC, C., BURT, A., VUONG, T. y LE, P.M., 2006.
Anti-diabetic properties of the Canadian lowbush blueberry Vaccinium angustifolium
Ait. Phytomedicine, vol. 13, no. 9-10, pp. 612-623. ISSN 0944-7113.
MATSUO, Y., FUJITA, Y., OHNISHI, S., TANAKA, T., HIRABARU, H., KAI, T.,
SAKAIDA, H., NISHIZONO, S. y KOUNO, I., 2010. Chemical constituents of the
leaves of rabbiteye blueberry (Vaccinium ashei) and characterisation of polymeric
proanthocyanidins containing phenylpropanoid units and A-type linkages. Food
Chemistry, vol. 121, no. 4, pp. 1073-1079. ISSN 0308-8146.
MAUGERI, Z. y DE MARÍA, P.D., 2012. Novel choline-chloride-based deep-eutectic-
solvents with renewable hydrogen bond donors: levulinic acid and sugar-based
polyols. Rsc Advances, vol. 2, no. 2, pp. 421-425.
MEDINA, J. J L., 2016. Los Berries en la provincia de Huelva : Desafíos y Oportunidades.
Plan Estratégico de la Provincia de Huelva. IFAPA.
MENG, X., BALLERAT-BUSSEROLLES, K., HUSSON, P. y ANDANSON, J.-M., 2016.
Impact of water on the melting temperature of urea+ choline chloride deep eutectic
solvent. New Journal of Chemistry, vol. 40, no. 5, pp. 4492-4499.
MOURATOGLOU, E., MALLIOU, V. y MAKRIS, D.P., 2016. Novel Glycerol-Based
Natural Eutectic Mixtures and Their Efficiency in the Ultrasound-Assisted Extraction
of Antioxidant Polyphenols from Agri-Food Waste Biomass. Waste and Biomass
Valorization, vol. 7, no. 6, pp. 1377-1387. ISSN 1877-265X.
NACZK, M., AMAROWICZ, R., ZADERNOWSKI, R., PEGG, R.B. y SHAHIDI, F., 2003.
Antioxidant activity of crude phenolic extracts from wild blueberry leaves. Pol J Food
Nutr Sci, vol. 12, no. 13, pp. 166-169.
NAM, M.W., ZHAO, J., LEE, M.S., JEONG, J.H. y LEE, J., 2015. Enhanced extraction of
bioactive natural products using tailor-made deep eutectic solvents: application to
flavonoid extraction from Flos sophorae. Green Chemistry, vol. 17, no. 3, pp. 1718-
1727. ISSN 1463-9262. DOI 10.1039/C4GC01556H.
NETO, C.C., 2007. Cranberry and blueberry: evidence for protective effects against
cancer and vascular diseases. Molecular nutrition & food research, vol. 51, no. 6.
NORBERTO, S., SILVA, S., MEIRELES, M., FARIA, A., PINTADO, M. y CALHAU, C.,
2013. Blueberry anthocyanins in health promotion: A metabolic overview. Journal
of Functional Foods, vol. 5, no. 4, pp. 1518-1528. ISSN 1756-4646.
PAL, S., HO, N., SANTOS, C., DUBOIS, P., MAMO, J., CROFT, K. y ALLISTER, E.,
2003. Red wine polyphenolics increase LDL receptor expression and activity and
suppress the secretion of ApoB100 from human HepG2 cells. The Journal of
nutrition, vol. 133, no. 3, pp. 700-706. ISSN 0022-3166.
PARK, Y.J., BISWAS, R., PHILLIPS, R.D. y CHEN, J., 2011. Antibacterial activities of
blueberry and muscadine phenolic extracts. Journal of food science, vol. 76, no. 2.
QUATTROCCHIO, F., BAUDRY, A., LEPINIEC, L. y GROTEWOLD, E., 2006. The
regulation of flavonoid biosynthesis. The science of flavonoids. S.l.: Springer, pp.
97-122.
QUIÑONES, M., MIGUEL, M. y ALEIXANDRE, A., 2012. Los polifenoles, compuestos
de origen natural con efectos saludables sobre el sistema cardiovascular. Nutrición
hospitalaria, vol. 27, no. 1, pp. 76-89. ISSN 0212-1611.
RAMASSAMY, C., 2006. Emerging role of polyphenolic compounds in the treatment of
neurodegenerative diseases: a review of their intracellular targets. European journal
of pharmacology, vol. 545, no. 1, pp. 51-64. ISSN 0014-2999.
-48-
RANKE, J., STOLTE, S., STÖRMANN, R., ARNING, J. y JASTORFF, B., 2007. Design
of sustainable chemical products the example of ionic liquids. Chemical Reviews,
vol. 107, no. 6, pp. 2183-2206. ISSN 0009-2665.
RENGSTL, D., FISCHER, V. y KUNZ, W., 2014. Low-melting mixtures based on choline
ionic liquids. Physical Chemistry Chemical Physics, vol. 16, no. 41, pp. 22815-
22822.
ROSS, J.A. y KASUM, C.M., 2002. Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects,
and safety. Annual review of Nutrition, vol. 22, no. 1, pp. 19-34. ISSN 0199-9885.
ROUTRAY, W. y ORSAT, V., 2014. MAE of phenolic compounds from blueberry leaves
and comparison with other extraction methods. Industrial Crops and Products, vol.
58, pp. 36-45. ISSN 0926-6690.
RUF, J.C., 1999. Wine and polyphenols related to platelet aggregation and
atherothrombosis. Drugs under experimental and clinical research, vol. 25, no. 2-3,
pp. 125. ISSN 0378-6501.
SAN SEGUNDO, J.S., 2019. Formación y caracterización de disolventes eutécticos
profundos: aplicación a la extracción de moléculas de interés. E.T.S.I. Universidad
Politéctica de Madrid. Madrid. España.
SCHROETER, H., HEISS, C., BALZER, J., KLEINBONGARD, P., KEEN, C.L.,
HOLLENBERG, N.K., SIES, H., KWIK-URIBE, C., SCHMITZ, H.H. y KELM, M.,
2006. (–)-Epicatechin mediates beneficial effects of flavanol-rich cocoa on vascular
function in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 103,
no. 4, pp. 1024-1029. ISSN 0027-8424.
SEERAM, N.P., ADAMS, L.S., ZHANG, Y., LEE, R., SAND, D., SCHEULLER, H.S. y
HEBER, D., 2006. Blackberry, black raspberry, blueberry, cranberry, red raspberry,
and strawberry extracts inhibit growth and stimulate apoptosis of human cancer
cells in vitro. Journal of agricultural and food chemistry, vol. 54, no. 25, pp. 9329-
9339. ISSN 0021-8561.
SINGLETON VL, R.J.A., 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-
phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture 16:
144-158.
SMITH, E.L., ABBOTT, A.P. y RYDER, K.S., 2014. Deep Eutectic Solvents (DESs) and
Their Applications. Chemical Reviews, vol. 114, no. 21, pp. 11060-11082. ISSN
0009-2665. DOI 10.1021/cr300162p.
STALIKAS, C.D., 2007. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids
and flavonoids. Journal of separation science, vol. 30, no. 18, pp. 3268-3295.
SZAJDEK, A. y BOROWSKA, E.J., 2008. Bioactive compounds and health-promoting
properties of berry fruits: a review. Plant foods for human nutrition, vol. 63, no. 4,
pp. 147-156. ISSN 0921-9668.
TAKESHITA, M., ISHIDA, Y., AKAMATSU, E., OHMORI, Y., SUDOH, M., UTO, H.,
TSUBOUCHI, H. y KATAOKA, H., 2009. Proanthocyanidin from blueberry leaves
suppresses expression of subgenomic hepatitis C virus RNA. Journal of biological
chemistry, vol. 284, no. 32, pp. 21165-21176. ISSN 0021-9258.
Unidad de Resonancia Magnética Nuclear. [Consulta: 29 noviembre 2020]. Disponible
en: http://www.scai.uma.es/areas/aqcm/rmn/rmn.html.
URUETA-CUÉLLAR, H., ALBORES, M., AGUILAR, R. y DE JIMÉNEZ, E.S., 2010.
Efecto protector de los polifenoles ante el daño provocado por especies reactivas
de oxígeno en maíz (Zea mays L.). TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-
Biológicas, vol. 13, no. 1, pp. 5-15.
VALDÉS, A., 2016. Una evaluación alimentómica de la actividad anticancerígena de
polifenoles de origen alimentario. 2016. S.l.: Universidad Autónoma de Madrid.
-49-
VASQUEZ-CASTILLA, S., GUILLÉN-BEJARANO, R., JARAMILLO-CARMONA, S. y

JIMENEZ-ARAUJO, A., 2012. Funcionalidad de distintas variedades de arándanos.
Instituto de la Grasa. Sevilla. Departamento de Biotecnología de los Alimentos. 11p.
WANG, L.-J., WU, J., WANG, H.-X., LI, S.-S., ZHENG, X.-C., DU, H., XU, Y.-J. y WANG,
L.-S., 2015. Composition of phenolic compounds and antioxidant activity in the
leaves of blueberry cultivars. Journal of Functional Foods, vol. 16, pp. 295-304.
ISSN 1756-4646.
WANG, S.Y., 2007. Antioxidant capacity and phenolic content of berry fruits as affected
by genotype, preharvest conditions, maturity, and postharvest handling. FOOD
SCIENCE AND TECHNOLOGY-NEW YORK-MARCEL DEKKER-, vol. 168, pp.
147. ISSN 0891-8961.
WILCOX, L.J., BORRADAILE, N.M., DE DREU, L.E. y HUFF, M.W., 2001. Secretion of
hepatocyte apoB is inhibited by the flavonoids, naringenin and hesperetin, via
reduced activity and expression of ACAT2 and MTP. Journal of lipid research, vol.
42, no. 5, pp. 725-734. ISSN 0022-2275.
WILLIAMS, M.J.A., SUTHERLAND, W.H.F., WHELAN, A.P., MCCORMICK, M.P. y DE
JONG, S.A., 2004. Acute effect of drinking red and white wines on circulating levels
of inflammation-sensitive molecules in men with coronary artery disease.
Metabolism, vol. 53, no. 3, pp. 318-323. ISSN 0026-0495.
YADAV, A. y PANDEY, S., 2014. Densities and Viscosities of (Choline Chloride + Urea)
Deep Eutectic Solvent and Its Aqueous Mixtures in the Temperature Range 293.15
K to 363.15 K. Journal of Chemical & Engineering Data [en línea], vol. 59, no. 7, pp.
2221-2229. ISSN 0021-9568. DOI 10.1021/je5001796. Disponible en:
https://doi.org/10.1021/je5001796.
YANG, D., HOU, M., NING, H., ZHANG, J., MA, J., YANG, G. y HAN, B., 2013. Efficient
SO 2 absorption by renewable choline chloride–glycerol deep eutectic solvents.
Green chemistry, vol. 15, no. 8, pp. 2261-2265.
ZAINAL-ABIDIN, M.H., HAYYAN, M., HAYYAN, A. y JAYAKUMAR, N.S., 2017. New
horizons in the extraction of bioactive compounds using deep eutectic solvents: A
review. Analytica Chimica Acta, vol. 979, pp. 1-23. ISSN 0003-2670.
ZAPATA, L.M., 2014. Obtención de extracto de antocianinas a partir de arándanos para
ser utilizado como antioxidante y colorante en la industria alimentaria. Tesis
Doctoral. Universitat Politècnica de Valencia. València. España. Disponible en:
https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/39105
ZHANG, Q., VIGIER, K.D.O., ROYER, S. y JEROME, F., 2012. Deep eutectic solvents:
syntheses, properties and applications. Chemical Society Reviews, vol. 41, no. 21,
pp. 7108-7146.
ZHOU, P., WANG, X., LIU, P., HUANG, J., WANG, C., PAN, M. y KUANG, Z., 2018.
Enhanced phenolic compounds extraction from Morus alba L. leaves by deep
eutectic solvents combined with ultrasonic-assisted extraction. Industrial Crops and
Products, vol. 120, pp. 147-154. ISSN 0926-6690.
-50-
7. ANEXOS
7.1. MEZCLAS QUE NO FORMARON UN LÍQUIDO EUTÉCTICO
En las Tablas 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 y 7.5 se recogen los datos pertenecientes a los
disolventes que no llegaron a formar un líquido completamente homogéneo.
Tabla 7.1. Combinaciones con cloruro de colina como aceptor de hidrógeno.
Componentes
ChCl:Ca Cloruro de colina Ácido cítrico 2:1
ChCl:Ma Cloruro de colina Ácido málico 1:1
ChCl:Glu Cloruro de colina Glucosa 5:2
ChCl:Fru:W Cloruro de colina Fructosa Agua 1:1:1
ChCl:Ca:W Cloruro de colina Ácido cítrico Agua 1:1:1
ChCl:Tart Cloruro de colina Ácido tartárico 2:1
ChCl:Prop Cloruro de colina 1,2-Propanodiol 1:1
ChCl:Mal Cloruro de colina Maltosa 3:1
ChCl:Xyl Cloruro de colina Xilitol 2:1
Tabla 7.2. Combinaciones con prolina como aceptor de hidrógeno.
Componentes
Pro:Ma Prolina Ácido málico 1:1
Pro:Glu Prolina Glucosa 5:3
Pro:Ca Prolina Ácido cítrico 2:1
Pro:Fru Prolina Fructosa 5:3
Pro:Mal Prolina Maltosa 3:1
Pro:Eg Prolina Etilenglicol 1:2
Pro:But Prolina 1,4-Butanodiol 1:2
Pro:Xyl Prolina Xilitol 2:1
Tabla 7.3. Combinaciones con ácidos como aceptores de hidrógeno.
Componentes
Ma:Glu Ácido málico Glucosa 1:1
Ma:Bet Ácido málico Betaína Agua 1:1:2
La:Glu Ácido láctico Glucosa 5:2
La:Fru Ácido láctico Fructosa 5:2
Ca:Glic Ácido cítrico Glicerol 1:2
Ca:Xyl Ácido cítrico Xilitol 1:1
Ca:Glu Ácido cítrico Glucosa 1:1
Ca:Fru Ácido cítrico Fructosa 1:1
Ca:Mal Ácido cítrico Maltosa 2:1
Ca:Pro Ácido cítrico Prolina 1:2
Ca:Gly:W Ácido cítrico Glicina Agua 2:1:1
Ca:Bet Ácido cítrico Betaína 1:1
Tabla 7.4. Combinaciones con betaína como aceptor de hidrógeno.
Componentes
Bet:La Betaína Ácido láctico 1:1
Bet:Ma Betaína Ácido málico 1:1
Bet:Ca Betaína Ácido cítrico 1:1
Bet:Tar Betaína Ácido tartárico 2:1
Bet:Ox Betaína Ácido oxálico dihidratado 1:1
Bet:U Betaína Urea 1:1
Bet:Sac Betaína Sacarosa 1:2
Bet:Glu Betaína Glucosa 5:2
Bet:Mal Betaína Maltosa 3:1
Bet:Xyl Betaína Xilitol 1:1
Bet:Eg Betaína Etilenglicol 1:2
Tabla 7.5. Combinaciones con glicina como aceptor de hidrógeno.
Componentes
Gly:Ma Glicina Ácido málico 1:1
Gly:La Glicina Ácido láctico 1:1
Gly:Tar:W Glicina Ácido tartárico Agua 2:1:2
Gly:Ca Glicina Ácido cítrico 2:1
Gly:Ox Glicina Ácido oxálico dihidratado 1:1
Gly:U Glicina Urea 1:1
Gly:Glu Glicina Glucosa 5:3
Gly:Fru Glicina Fructosa 5:3
Gly:Mal Glicina Maltosa 3:1
Gly:Eg Glicina Etilenglicol 1:2
Gly:Prop Glicina 1,2-Propanodiol 1:2
Gly:But Glicina 1,4-Butanodiol 1:2
Gly:Xyl Glicina Xilitol 2:1
Gly:Glic Glicina Glicerol 2:5
Gly:Glic:W Glicina Glicerol Agua 2:1:3
Figura 7.1. Mezclas que no formaron un líquido eutéctico.

7.2. ESPECTROS DE RMN 1H {13C}
Figura 7.2. Espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Glic.
RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz, δ ppm): δ=5.48 (s, 1Ha), 4.52 (d, 1He, J=4.88 Hz), 4.44
(t, 1Hf, J=5.63 Hz), 3.82 (c, 2Hb, J=4.77 Hz), 3.45-3.25 (m, 2Hc, 4Hh, 1Hg, J=5.55 Hz),
3.13 (s, 9Hd).
Figura 7.3. Espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Ox.
RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz, δ ppm): δ=3.82 (c, 2Hb, J= 4.77 Hz), 3.42 (t, 2Hc, J=5.30
Hz), 3.13 (s, 9Hd).
No se observan los protones de ácido oxálico (He).
Figura 7.4. Espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Eg:W.
RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz, δ ppm): δ=5.51 (t, 1Ha J=4.12 Hz), 4.51 (t, 2He, J=5.40
Hz), 3.82 (c, 2Hb, J=4.85 Hz), 3.42 (t, 2Hc, J=5.30 Hz), 3.38 (c, 4Hf, J=2.67 Hz), 3.13 (s,
9Hd).
No se observan diferencias con el espectro de RMN 1H {13C} de ChCl:Eg (Figura 4.6).
Figura 7.5. Espectro de RMN 1H {13C} de La:Gly:W.
RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz, δ ppm): δ=4.92 (m, 1Hb, J=7.05 Hz), 4.18-4.04 (dc, 1Hc,
J= 6.88 Hz), 3.31 (s, 2Hg), 1.40-1.29-1.23 (td, 3Hd, J= 6.85Hz).
No se observan los protones del grupo amino (Hf) ni del ácido carboxílico (He).
Figura 7.6. La:AcNa:W.
RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz, δ ppm): δ=4.84 (m, 1Hb, J=7.05 Hz), 4.15-3.95 (dc, 1Hc,
J= 6.88 Hz), 1.35-1.28-1.20 (td, 3Hd, J= 6.87Hz).
Los 3 protones que pertenecen al grupo metilo del acetato de sodio (3He) no se observan
en el espectro del NADE.

TFG Síntesis de Disolventes Verdes para La Valorización de Residuos Agrícolas

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

TFG Síntesis de Disolventes Verdes para La Valorización de Residuos Agrícolas

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

TRABAJO FIN DE GRADO

SÍNTESIS DE DISOLVENTES VERDES

Alumna: María de los Santos Martín

Tutoras: Ana Sayago Gómez y Pilar del Rocío Franco Márquez

En el presente estudio se han sintetizado disolventes eutécticos profundos

PALABRAS CLAVE: disolventes eutécticos profundos naturales, extracción,

KEYWORDS: natural deep eutectic solvents, extraction, polyphenols, antioxidant,

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS

Figura 1.1. Mezcla eutéctica formada a partir de cloruro de colina

Tabla 1.1. Ventajas e inconvenientes de los disolventes alternativos: puntuación

En el presente estudio se han sintetizado disolventes eutécticos profundos

1.1. LA QUÍMICA VERDE

Los disolventes juegan un papel fundamental tanto en la industria química como en

1.2. EVOLUCIÓN DE LOS EXTRACTANTES

Los disolventes son ampliamente utilizados como medios de reacción y en los

H2O scCO2 ILs FBS NADES

Puede separarse de la Fácil con productos

Pocos datos de Bioacumulativos, gases de

Mucha energía, se El precio disminuye al

El cloruro de colina (C5H14ClNO) es uno de los componentes más empleados en la

Figura 1.2. Diagrama de fase para una mezcla eutéctica.

Figura 1.3. Estructura general de una mezcla eutéctica.

Cuanto más fuerte es la interacción entre los componentes, mayor es la depresión

Densidad, viscosidad y tensión superficial

Polaridad y conductividad iónica

1.3. APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS AGRÍCOLAS: HOJAS DE

El arándano, arbusto perenne del género Vaccinium, de la familia de las Ericáceas,

Figura 1.4. Arándanos azules1 y arándanos rojos2.

Las hojas de arándano se han estudiado desde 1927, momento en el que se

1.4. COMPUESTOS BIOACTIVOS

Los derivados fenólicos o polifenoles son metabolitos secundarios sintetizados por

En los últimos años, numerosos estudios han demostrado que la ingesta de

Teniendo en cuenta la naturaleza química se han distribuido principalmente en

Figura 1.5. Clasificación general de los compuestos fenólicos.

El objetivo principal del presente trabajo es la obtención de disolventes verdes para

En el presente trabajo, la materia prima estaba compuesta por hojas de cuatro

3.2. SÍNTESIS DE NADES

Las mezclas eutécticas empleadas en este trabajo se obtuvieron mediante la

3.3. EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS

La extracción asistida por ultrasonidos es uno de los métodos de extracción más

3.4. DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMÉTRICAS

Mediante métodos espectrofotométricos se evaluó el contenido de polifenoles

3.4.1. Determinación de polifenoles totales

El contenido de polifenoles se determina mediante el método de Folín-Ciocalteu,

Reactivo de Folín (W6+, Mo6+) Reactivo de Folín reducido (W5+, Mo5+)

Figura 3.2. Mecanismo de acción del reactivo de Folín-Ciocalteu.

Para calcular dicho contenido en polifenoles totales se construyó una recta de

• Materiales, equipos y reactivos

3.4.2. Determinación de la actividad antioxidante

La actividad antioxidante se determinó mediante el método del DPPH (Brand-

DPPH oxidado (C18H12N5O6) DPPH reducido (C18H13N5O6)

Figura 3.6. Estructura química de Trolox (C14H18O4).

• Materiales, equipos y reactivos

3.4.3. Determinación de antocianos totales

Las antocianinas son flavonoides pigmentados, hidrosolubles, responsables de una

El contenido en antocianinas totales en la muestra se expresa expresan en mg de

• Materiales, equipos y reactivos

3.5. CARACTERIZACIÓN DE NADES

3.5.1. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear

La técnica espectroscópica de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) representa

3.5.2. Estudio reológico

El estudio reológico se centra en el análisis de los principios que determinan cómo