APUNTES DE ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº 2

ENZIMAS: CATALIZADORES BIOLOGICOS

La variedad de reacciones bioquímicas que sustentan la vida están en su mayoría
mediadas por una serie de catalizadores biológicos. Estos permiten que dichas reacciones se
lleven a cabo en las condiciones en que los sistemas vivos mantienen en su medio interno y bajo
las cuales normalmente no se producirían o lo harían muy lentamente. Un catalizador es una
sustancia que aumenta la velocidad de una reacción química, sin que ella se vea alterada como
resultado del proceso. La mayoría de los catalizadores biológicos son proteínas denominadas
ENZIMAS del griego en: dentro de y zima: levadura. Las enzimas en su calidad de
macromoléculas están sujetas a las mismas leyes físicas y químicas que gobiernan el
comportamiento del resto de la materia; sin embargo, estas moléculas presentan características
que las distinguen de los catalizadores químicos.

1. CARACTERISTICAS DE LA ACCION ENZIMATICA

Especificidad de la reacción: Las enzimas presentan una alta especificidad en cuanto a la

identidad de su sustrato (reactantes) y el producto de la reacción que ellas catalizan. La reacción
catalizada por una enzima en muy pocas oportunidades genera productos secundarios no
deseados. La especificidad fluctúa entre 2 rangos: especificidad molecular o absoluta y
especificidad de grupo o relativa. En el primer caso, la enzima actúa exclusivamente sobre un
tipo de molécula. Por ejemplo, la lactasa ejerce su acción nada más que sobre la lactosa. Mientras
que en el segundo caso, la enzima actúa sobre un conjunto de sustancias que tienen una estructura
semejante. Por ejemplo, la lipasa actúa sobre cualquier lípido.

Velocidad de reacción: Una reacción catalizada enzimáticamente es habitualmente 106 a 1012

veces más rápida que la reacción no catalizada y es al menos varios órdenes de magnitud mayor
que aquella correspondiente a la reacción catalizada químicamente. Por ejemplo, una reacción
que requiere muchas horas para completarse no puede ser útil desde el punto de vista metabólico
para una bacteria que ha de reproducirse en 20 minutos.

Actúan a concentración muy baja. Su acción catalítica permite pensar que su renovación sería
innecesaria; sin embargo, los organismos las sintetizan permanentemente debido a que se gastan
por destrucción o por arrastre hacia el exterior.

Condiciones de reacción: Las reacciones catalizadas enzimáticamente se llevan a cabo bajo

condiciones relativamente suaves: Temperaturas bajo los 100º C, a presión atmosférica y un pH
cercano al neutro. En contraste, una eficiente catálisis química a menudo requiere elevadas
temperaturas y presiones así como pHs extremos.

Capacidad de regulación: La actividad catalítica de muchas enzimas varía en respuesta a la

concentración de sustancias distintas a su sustrato. Los mecanismos de este proceso regulatorio
incluyen el control alostérico, la modificación covalente (fosforilación, nitrosilación, prenilación,
etc.), la proteólisis limitada y la regulación de la cantidad de enzima sintetizada.

Funcionan entre ciertos límites de temperatura. Requieren una temperatura óptima, la que en
nuestro organismo es de 36,5º C. Temperaturas bajas inhiben su acción y las muy altas paralizan
su efecto, ya que como todas las proteínas, pueden desnaturalizarse completamente por acción del
calor. Se ha calculado que dentro de los Límites de temperaturas en que actúan, su acción se
duplica a medida que la temperatura sube en 10º C.

Su acción se manifiesta únicamente a cierta concentración de protones (pH). Su condición

proteica presenta un punto isoeléctrico fijo. Ejemplo. la pepsina requiere de un pH = 2, y la
amilasa salival de un pH = 6,9.

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Su acción varía de acuerdo a la concentración del sustrato.

Sólo aceleran las reacciones sin que intervengan en su dirección ni en su intensidad, ya que
estas características están determinadas por la Ley de Acción de Masas, la que establece el
siguiente principio: “la velocidad de una reacción es proporcional al producto de las
concentraciones de las sustancias reaccionantes”. En otras palabras, las enzimas, entres muchas
funciones, reducen la energía necesaria para la activación que requieren los sustratos para
transformarse en productos (ver Figura 1).

Figura 1. Diagrama esquemático

ilustrando el efecto de un catalizador
sobre el estado de transición de una
reacción. El catalizador actúa
disminuyendo la barrera de activación de
la reacción. La catálisis disminuye la
energía de activación en la misma
cantidad tanto para la reacción directa
como para la reacción inversa. Por ello el
catalizador acelera ambas reacciones; sin
embargo, la constante de equilibrio de la
reacción permanece inalterada. (Tomado
de Biochemistry, Voet y Voet, 1990).

La naturaleza aprovecha estas características de las enzimas y el hecho de que la mayoría

de las reacciones deban ser catalizadas por ellas para canalizar los metabolitos celulares hacia
rutas que sean provechosas a los requerimientos de la célula.

Los organismos vivientes se asemejan a una fábrica que debe producir ciertos productos a
partir de un número limitado de materias primas. Para ello debe disponer de máquinas capaces de
realizar tales transformaciones como son las enzimas. No sería conveniente para la célula que
todas sus máquinas trabajaran a su máxima velocidad, puesto que cada máquina tiene una
potencia diferente de acuerdo a la operación que realiza. De ser así, en poco tiempo existiría una
descoordinación entre los productos que salen de una máquina para entrar a la siguiente. Por esta
razón, es necesaria una coordinación y una regulación para hacer que una fábrica grande funcione
de manera eficiente. Bajo este concepto, es lógico pensar que la mayoría de las reacciones en las
células no ocurren en forma independiente una de otra o a una velocidad constante. La eficiencia
con la que actúan las enzimas debe controlarse de una forma que refleje la disponibilidad de los
sustratos, la utilización de los productos, de la presencia de otras moléculas que participan en la
vía en forma directa o indirecta y de las necesidades de la célula.
Los mecanismos a través de los cuales esta regulación se lleva a cabo en la célula es
modificando la cantidad de enzima disponible (produciendo más enzima o degradándola) o
modificando en las enzimas existentes su actividad enzimática (activando o inhibiendo la
enzima).

2. LA ENZIMOLOGIA COMO HERRAMIENTA BIOQUIMICA

Comprender los mecanismos a través de los cuales las enzimas realizan su trabajo ha sido
uno de los primeros desafíos en el desarrollo histórico de la bioquímica, constituyendo una
disciplina denominada Enzimología. El conocer como ellas trabajan ha permitido su
manipulación y su modificación para el mejoramiento de procesos farmacológicos y
biotecnológicos así como la generación de nuevas herramientas para la investigación científica.

La enzimología como disciplina, es aún más antigua que la misma bioquímica, pero se
relacionaron íntimamente a partir del siglo XIX gracias a las investigaciones de los procesos
fermentativos. El estudio del proceso de fermentación se considera que partió en 1810 con las
determinaciones de Joseph Gay-Lussac de que el etanol y el C02 son los principales productos de

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la descomposición del azúcar por las levaduras. Posteriormente, Jacob Berzelius postuló en su
teoría general de la catálisis química en 1835, que lo que él llamó diastasa (un extracto de malta
que contiene la enzima -amilasa) cataliza la hidrólisis del almidón en forma más eficiente que el
ácido sulfúrico. Si bien algunos ácidos minerales eran capaces de imitar los efectos de la diastasa,
muy pocas reacciones bioquímicas eran capaces de ser reproducidas en el laboratorio. Este hecho
llevó a Louis Pasteur a postular que el proceso de fermentación podía ocurrir sólo en células
vivas, asumiendo que los sistemas vivos poseían una "fuerza vital" que les permitía evadir las
leyes de la naturaleza y gobernar la materia inanimada. Otros, sin embargo, como Justus Liebig,
consideraron que estos procesos son causados por la acción de sustancias químicas que se
encuentran presentes dentro de las células y que fueron denominadas como fermentos. De hecho,
el nombre enzima fue acuñado en 1878 por Fedrich Wilhelm Kühne enfatizando la existencia de
algo dentro de la levadura que cataliza las reacciones de fermentación.

En 1894 el bioquímico alemán Emil Fischer propuso la hipótesis de llave y cerradura

para explicar el modo de trabajo de las enzimas (figura 2 y figura 3A). Según este modelo, la
enzima acomoda su sustrato del mismo modo en que la cerradura acomoda su llave específica
gracias a la complementariedad geométrica entre ambas (figura 2). Estudios muy posteriores
demostraron que termodinámicamente, lo que hace un catalizador es reducir la energía libre
estándar de transición, que corresponde a la energía libre adicional que han de alcanzar las
moléculas para llegar al estado de transición. Esto lo hace facilitando la formación del estado de
transición o un estado similar a éste. La enzima une su o sus sustratos en una región que recibe el
nombre de sitio de activo. El sitio activo corresponde habitualmente a un bolsillo conformado
por cadenas laterales de aminoácidos que participan en la unión de los sustratos (sitio de unión)
y por cadenas laterales de aminoácidos que participan en la catálisis de la reacción (sitio de
catálisis). El plegamiento de las cadenas de aminoácidos que determina la compleja estructura
terciaria de las enzimas, hace posible que en este bolsillo se ajuste el sustrato a la enzima de
manera muy estrecha., lo cual explica la extraordinaria especificidad de la catálisis enzimática
(figura 2).

Figura 2. Complejo enzima-sustrato. La

formación del complejo enzima-sustrato
depende de la complementariedad tanto física
como geométrica entre la enzima y su sustrato.
Como establece el modelo de llave y cerradura,
el plegamiento de las cadenas laterales de la
enzima determinan la formación del sitio
catalítico al cual se une el sustrato. En este
esquema, los grupos hidrofóbicos están
representados por una h dentro de un círculo,
mientras que los puentes de hidrógeno
establecidos entre la los grupos químicos de la
proteína y el sustrato se muestran como líneas
punteadas (Tomado de Biochemistry, Voet y
Voet, 1990).

En 1926, James Sumner cristalizó por primera vez una enzima (ureasa de frijol) y
demostró que dichos cristales correspondían a una proteína. Sin embargo debido a la impureza de
los experimentos de Sumner no fue hasta 1930 que se reconoció la naturaleza proteica de las
enzimas, cuando John Northrop y Moses Kunitz mostraron la existencia de una correlación
directa entre la actividad enzimática de la pepsina, tripsina y quimiotripsina cristalizada y la
cantidad de proteínas presentes. Sin embargo, hoy en día se ha demostrado que algunas especies
de RNAs (ribosimas) poseen propiedades catalíticas, con lo cual no sólo las proteínas tienen
actividad enzimática sino también algunos ácidos nucleicos.

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 El modelo de Fischer ayudó a comprender la especificidad de las enzimas; sin embargo,
no daba luces acerca de la catálisis en sí, puesto que una cerradura no modifica la llave que aloja.
En definitiva, lo que se propone actualmente, es que la enzima no sólo acepta su sustrato sino que
también exige que el sustrato se distorsione a algo similar al estado de transición. Esta
interpretación y modificación del modelo de Fischer fue propuesta por Daniel Koshland en 1958
como el modelo de ajuste inducido y constituye en la actualidad para la bioquímica moderna el
modelo más aceptado acerca de la catálisis enzimática (figura 3A). Según este modelo, si
aceptamos que el sustrato sufrirá una distorsión dentro del sitio activo de la enzima, debemos
aceptar que este hecho necesariamente exige un cambio en la conformación de la enzima. Este
cambio conformacional puede ser local o general. Una vez ocurrida la catálisis de la reacción, la
enzima recobra su conformación original al liberar los productos de la reacción. Una
visualización gráfica de esta distorsión puede observarse con la enzima hexoquinasa (figura 3B),
que cataliza la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato en el primer paso de la vía
glicolítica. La determinación de la estructura de esta proteína en presencia y en ausencia de su
sustrato (glucosa) ha demostrado que la unión de la glucosa a la hexoquinasa promueve el
plegamiento de los dominios de la enzima uno contra el otro a modo de pinza, con lo que se
cierra la hendidura de unión al sustrato.

Frecuentemente, cadenas conteniendo aminoácidos específicos se disponen

estratégicamente dentro de la conformación tridimensional de la enzima para facilitar tanto el
proceso de unión como el de catálisis. Estos aminoácidos contienen grupos químicos ácidos o
básicos que pueden promover la adición o eliminación de protones. Análogamente, algunas
enzimas contienen un ión metálico en la posición exacta para participar en la catálisis. En
resumen, una enzima une su sustrato, reduce la energía del estado de transición e impulsa
directamente el proceso catalítico. Cuando la catálisis se ha concretado, la enzima debe liberar el
o los productos y volver a su estado original, para poder volver a iniciar un nuevo ciclo de
catálisis.

Figura 3. Modelos de la interacción entre A

una enzima y su sustrato. A) Arriba:
Modelo de la llave y cerradura, el sitio
activo de la enzima ajusta el sustrato de la
misma manera en que lo hace una
cerradura con su llave. Abajo: Modelo de
ajuste inducido, derivado del modelo
anterior, establece que tanto la enzima
como el sustrato sufren distorsión al unirse.
El sustrato es forzado a adoptar una
conformación que se aproxima al estado de
transición; la enzima mantiene al sustrato
en tensión para poder lograr esta
conformación. B) Cambio conformacional
inducido en la hexoquinasa. La unión de B
glucosa a la hexoquinasa induce un
cambió conformacional importante en la
enzima, la enzima es una única cadena
polipeptídica, pero se han sombreado los
dominios más importantes para poder
diferenciarlos. La hendidura existente entre
los dos dominios se cierra alrededor de la
molécula de glucosa. (Tomado de
Bioquímica, Mathews, C y Van Holde.
K.E. 1998).

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 Mucho de nuestro entendimiento con relación a la naturaleza y función de las enzimas
producto de la las investigaciones realizadas durante la segunda mitad del siglo recién pasado. No
fue hasta 1963 que fue reportada la primera secuencia aminoacídica completa de una enzima, la
ribonucleasa pancreática de bovino de tipo A. Recién en 1965 se determinó la primera estructura
de una enzima por difracción de rayos X, que correspondió a la lisozima de huevo de gallina. El
desarrollo del proyecto Genoma Humano, ha planteado nuevas perspectivas y nuevas
interrogantes en relación al contexto fisiológico en que las enzimas y las proteínas en general
trabajan. El desarrollo del próximo gran proyecto científico de la humanidad conocido como
Proyecto Proteoma Humano permitirá relacionar los genes descritos con funciones fisiológicas
para las cuales no se conoce la proteína efectora, ¿Cuántas de estas nuevas proteínas serán
enzimas?

3. COFACTORES ENZIMATICOS

La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteína,

mientras que otras necesitan además uno o más componentes no proteicos, llamados cofactores o
coenzimas. El cofactor puede ser un ión metálico, y la coenzima una molécula orgánica; algunas
enzimas requieren de ambos. Los cofactores son generalmente estables frente al calor, mientras
que muchas proteínas enzimáticas, pierden la actividad por calentamiento. El complejo enzima-
cofactor (coenzima) cataliticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el
cofactor (coenzima), la proteína que por si misma es inactiva catalíticamente se designa con el
nombre de apoenzima. A manera de ejemplo se pueden citar entre los cofactores enzimáticos, los
del tipo ión metálico: Cu+2, Zn+2, Mg+2, Mn+2, etc. Entre las moléculas orgánicas no proteicas
denominadas coenzimas, y que derivan principalmente de las vitaminas hidrosolubles se
encuentran las siguientes:

1.- FMN (flavina mononucleótido) y FAD (flavina adenina dinucleótido), derivados de la

vitamina B2 o riboflavina.

2.- NAD (nicotinamida adenina dinucleótido) y NADP (nicotinamida adenina dinucleótido

fosfato), ambas derivadas de la proteína PP, preventiva de la pelagra, también llamada
nicotinamida o niacina.

3.- CoA (coenzimaA), derivada del ácido pantoténico (vitamina B5) una vitamina hidrosoluble.

4. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

A.- Temperatura: al aumentar la temperatura en el medio en que ocurre una reacción, la

velocidad inicial de ésta también aumenta. Sin embargo, llegando a cierto valor de temperatura,
la enzima pierde sus propiedades catalíticas y se inactiva rápidamente.

Pueden distinguirse tres rangos típicos de temperatura:

A.1.- temperatura mínima: al descender la temperatura, también lo hace la actividad

enzimática, hasta hacerse mínima. A una temperatura aún inferior, la enzima no actúa porque
adquiere una conformación espacial menos favorable para la catálisis. La enzima se inactiva.

A.2.- temperatura óptima: la temperatura óptima se define como aquella temperatura en la cual
la actividad enzimática es máxima. Es importante destacar que este concepto es experimental, ya
que cada enzima tiene una temperatura óptima propia que no es por necesidad 37º C.

A.3.- temperatura máxima: a medida que la temperatura aumenta, también lo hace la actividad
de la enzima, pero hasta cierto nivel de temperatura. Más allá de ese límite, la actividad
enzimática cesa porque la enzima se denatura (pierde la estructura espacial que posibilita la
catálisis).

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B.- pH: las enzimas son también afectadas por el pH, ya que realizan su función a una
determinada acidez o alcalinidad deL medio en el cual actúan. Muchas enzimas presentan
actividad máxima en un pH cercano a la neutralidad (figura 4), otras enzimas actúan mejor en
medios alcalinos o ácidos. Por ejemplo, el pH óptimo de la pepsina es 2-3 y el de la tripsina es de
8-9.

Figura 4. Relación entre la velocidad de reacción de

una enzima y el pH del medio en el cual se lleva a
cabo la catálisis. (Tomado de Bioquímica Mathews, C
y Van Holde, K.E., 1998).

En cada valor de acidez, la enzima tiene cierta

conformación espacial, en la que participan
grandemente los enlaces de hidrógeno. Los cambios de
pH cambian esta conformación y también el poder
catalítico de la enzima.

C.- Concentración del sustrato: a mayor concentración de sustrato, la velocidad de reacción

aumenta, hasta alcanzar cierto valor, a partir del cual se hace constante. Eso último se debe a que
la enzima está saturada con las moléculas de sustrato. En esta condición se están usando todos los
sitios activos simultáneamente.

D.- Concentración de la enzima: en este caso, hay un exceso de sustrato todo el tiempo. La
velocidad de la reacción es, por lo tanto, directamente proporcional a la concentración de la
enzima.

E.- lnhibidores: existen algunos compuestos químicos capaces de bloquear o disminuir la

actividad enzimática. La inhibición enzimática se puede clasificar en:

 Reversibles: -competitivo
-acompetitivo

 Irreversibles o inactivadores

5. CINETICA ENZIMATICA

El estudio de la velocidad con que ocurren las reacciones enzimáticas y el saber cómo
cambian, en respuesta a modificaciones de ciertas condiciones experimentales, se conoce como
cinética enzimática. El avance de la reacción puede representarse en un gráfico que se conoce
como curva de progreso y relaciona la variación en la concentración de sustrato consumido en el
tiempo o bien el producto formado en ese mismo lapso.

La curva de progreso entrega información que permite conocer la velocidad con que
ocurre la reacción. Se calcula el cuociente entre la variación de la concentración de producto y el
tiempo requerido para lograrlo. Sin embargo, hay un factor limitante: la concentración de sustrato
varía de manera directamente proporcional sólo en el inicio de la reacción. Luego muestra una
relación no lineal que dificulta el cálculo de la velocidad. Este problema se ha resuelto
determinando la Velocidad inicial de la reacción (V0) a partir del primer segmento de la curva de
progreso.

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Figura 6. Estado estacionario de la
cinética enzimática. Para una reacción
simple E + S = ES ---- E + P, el gráfico
muestra la manera en que varían a lo
largo del tiempo las concentraciones de
sustrato [S], enzima libre [E] complejo
enzima-sustrato [ES], y producto [P].
Tras un breve período inicial [ES] alcanza
un estado estacionario en el que ES se
consume con una velocidad
aproximadamente igual a la de su
formación. (Tomado de Bioquímica ,
Mathews, C y Van Holde, K.E., 1998).

Al estudiar el efecto entre la concentración de sustrato [S] y la velocidad inicial, se

observa que a bajas concentraciones de sustrato, V0 aumenta en relación casi directa con [S]. Sin
embargo, a concentraciones mayores, la velocidad va en disminución. Finalmente a
concentraciones muy elevadas, la velocidad de la reacción llega a un máximo y se mantiene
constante (Vmax) (figura 6).

En 1913, dos pioneras en el análisis de la cinética enzimática: Leonor Michaelis y

Maude Menten postularon la formación de un complejo enzima-sustrato que se unía
rápidamente y de manera reversible. Posteriormente, el complejo se separaba lentamente para dar
lugar al producto y a la enzima libre, lista para iniciar una y otra vez en el proceso de la catálisis.
La siguiente ecuación explica el comportamiento enzimático postulado por Michaelis y Menten:

Vmax x [S]
V0 = Km +[S]

Figura 7. Efecto de la concentración de

sustrato sobre la velocidad de reacción
según la cinética de Michaelis-Menten. En
el punto en que [S] = Km la reacción tiene
exactamente la mitad de su velocidad
máxima. Obsérvese que es difícil valorar la
velocidad máxima a partir de los datos con
el empleo de este gráfico, puesto que se
produce una aproximación asintótica a Vmax.
(Tomado de Bioquímica , Mathews, C y
Van Holde, K.E., 1998).

Esta ecuación permite calcular la velocidad inicial, la velocidad máxima y la Km, un

indicador de la afinidad de la enzima por su sustrato (figura 7). Si bien la ecuación predice la
velocidad de reacción de la mayoría de las enzimas, ésta no es aplicable para las enzimas
alostéricas, quienes aumentan o disminuyen su velocidad frente a ciertas sustancias químicas.

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Interpretación de los datos obtenidos a partir de una cinética de Michaelis-Menten.

Las dos constantes que son características de una enzima que obedece a la cinética de
Michaelis-Menten son Km y kcat.

La constante de Michaelis, Km se asocia a menudo con la afinidad que presenta la enzima

por su sustrato, y corresponde numéricamente a la concentración de sustrato a la que la velocidad
de reacción ha alcanzado la mitad de su valor máximo. Una enzima con una K m alta requiere una
concentración de sustrato mayor para alcanzar una velocidad de reacción dada, que una enzima
con una Km baja.

La constante catalítica, kcat, constituye una medida directa de la generación de producto

por acción de la enzima en condiciones en que ésta se encuentra saturada. La unidad de kcat es S-
1, por lo que el recíproco de la kcat puede interpretarse como un tiempo, el tiempo necesario para
que una molécula de enzima recambie una molécula de sustrato. Otra interpretación aceptada de
esta constante es considerarla como el número de moléculas de sustrato recambiadas por
molécula de enzima en 1 segundo. De esta forma, kcat se denomina a veces número de recambio.

La relación entre la kcat y la Km puede proporcionar cierta información en condiciones en

que la concentración de sustrato es pequeña; es decir, cuando la concentración de sustrato es
mucho menor a la Km y la mayor parte de la enzima está libre. En estas circunstancias la relación
kcat / Km proporciona una medida directa de la eficiencia y de la especificidad de la enzima.
Muestra lo que la enzima y el sustrato pueden realizar juntos cuando se dispone de sitios activos
abundantes y permite una comparación directa de la eficacia de una enzima respecto a diferentes
sustratos.