Editor

Chai An Mao
Ruiz Departamento de Oftalmología y
Ciencias Visuales
Escuela de Medicina McGovern en la Universidad
del Centro de Ciencias de la Salud de Texas en Houston (UTHealth)
Houston, TX, EE. UU.

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electrónico)

Métodos en biología molecular
ISBN 978-1-0716-0174-7 ISBN 978-1-0716-0175-4 (libro electrónico)
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0175-4

©Springer Science+Business Media, LLC, parte de Springer Nature 2023

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Nature.
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Contenido
Capítulo 1: Investigación de la neurogénesis en aves
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 2: Estudio de la proliferación de células progenitoras retinales in vivo en Xenopus laevis

1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 3: Cultura tridimensional de los oculares de ratón

1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 4: Imágenes en vivo de cortes de retina de ratón

1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 5: Cultivo de tiras de retina para estudiar el crecimiento de axones de células ganglionares
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 6: Múltiples enfoques para mejorar la actividad neuronal para promover el crecimiento de neuritas
de los explantes de retina
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 7: Virus adenoasociado como vehículo de administración de genes en la retina

1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 8: Supresión estable de la expresión génica mediada por transposones en la retina de pollos en desarrollo
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 9: Una guía simple para generar animales transgénicos BAC para la investigación de la retina
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

viii
viii Contenido

Capítulo 10: Identificación y caracterización de elementos reguladores cis para la transcripción específica del tipo
de fotorreceptor en ZebraFish
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 11: Sistema de hibridación in situ RNAscope ultrasensible en retinas embrionarias y de ratones adultos
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 12: Captura de células individuales, ARN-seq y análisis transcriptómico de la retina neural
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 13: Sistema de etiquetado disperso dirigido genéticamente para estudios anatómicos de las células
ganglionares de la retina
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 14: Microinyección de colorante intracelular en estudios morfológicos y de comunicación de la retina

1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 15: Registro de matriz de electrodos múltiples de retinas de ratón trasplantadas con láminas retinales
derivadas de células madre
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas

Capítulo 16: Grabación pareada para estudiar el acoplamiento eléctrico entre fotorreceptores en retina de ratón
1 Introducción
2 materiales
3 métodos
4 notas
 Estudios in vivo de proliferación de RPC 27

Figura 4Métodos para estudiar el crecimiento de los ojos y la proliferación de RPC. (a)Inmunotinción de montaje completo
de un st. 46 renacuajo. El color verde indica tejidos neurales (Xen1). El color magenta indica señal nuclear (TO-PRO-3). (b)
Sección transversal del ojo generada por vibratome que muestra un st. 40–41 ojos inmunoteñidos con anticuerpos anti-
Pax6 y Xen1. El color verde indica células retinianas en el ganglio y las capas nucleares internas (anti-Pax6). El color rojo
indica tejidos neurales (Xen1). (C)La microinyección dirigida de ARNm de GFP en el blastómero dorsal de embriones de
cuatro células resultó en una alta expresión de GFP en la región del ojo por st. 22. (d, e)Tratamiento con inhibidores
químicos de embriones con un (d)Control de vehículos DMSO y (mi)MG132, un inhibidor del proteasoma permeable a las
células. (a) Arriba¼anterior, abajo¼posterior. (b)Arriba¼dorsal, abajo¼ventral. (c–e)Arriba¼dorsal, abajo¼ventral, izquierda
¼anterior, derecha¼posterior. Barras de escala: (ayC)¼500 micras y (b)¼50 micras

identifica los tejidos neurales, incluida la copa del ojo [28]. La

membrana basal que rodea el ojo se puede visualizar usando un
anticuerpo anti-laminina [28]. Para evaluar el alcance de la ablación
quirúrgica, obtenga imágenes digitales de las secciones del ojo ([28];
verNota 10).Seleccione la sección que contenga la mayor cantidad de
tejido ocular remanente (según la etiqueta del anticuerpo Xen1).
Mida el área del tejido ocular remanente y el control contralateral no
operado individualmente para calcular el porcentaje de tejido ocular
extirpado (Fig.3a).
38 Cuervo Diacou et al.

Figura 2Los oculares de ratón cultivados muestran una diferenciación celular adecuada, una estructura retiniana estratificada y
márgenes ciliares. Los oculares de ratón después de varios días de cultivo 3D se analizaron mediante inmunotinción en secciones.
(anuncio)Los oculares de ratón E13.5 cultivados durante 4 días expresaron los marcadores de fotorreceptores Crx y Otx2, el
marcador de células ganglionares de la retina Pou4f2 y el marcador de proliferación pH3 en las capas apropiadas. (e–f)Los oculares
de ratón E12.5 cultivados durante 6 días expresaron el marcador progenitor retiniano Six3 y el marcador de margen ciliar Cdon.
Barras de escala, 100 μm

2.4 Cultura del ocular
1. Medio de cultivo (DMEM/F12 (3:1), suero bovino fetal al 8 %
(Gibco), B27 al 2 %, 1-NEAA, taurina 100 μM (Sigma-Aldrich) y
GlutaMAX 2 mM, 1-PenStrep)
2. Pipeta Pasteur curva estéril con tapón de algodón (verNota
1) (Higo.1)
3. Bulbo de goma para pipeta de vidrio

4. Placa de veinticuatro pocillos

56 Masayuki Yamashita

se requiere disociación y suministro de matriz extracelular tridimensional.

Para ello, uno de los métodos adecuados es cultivar una tira de retina
embrionaria en un sustrato similar a la ILM.
En este capítulo se describen técnicas detalladas del cultivo de tiras de
retina. Una tira retinal de un pollito embrionario está incrustada en Matrigel®,
que forma la matriz extracelular que contiene colágeno, laminina y
proteoglicanos. Los axones RGC expresan integrina [5], que se une a las
proteínas de la matriz extracelular [6], y envía la señal intracelular para el
enlace entre la matriz extracelular y el citoesqueleto [7]. Los factores de
crecimiento cooperan en esta señalización, y los proteoglicanos extracelulares
son esenciales para esta cooperación.8]. Mediante el uso del cultivo de la tira
retinal, se estudió con éxito el efecto de los campos eléctricos en la dirección
de la extensión del axón de RGC.9].

2 materiales

Prepare una habitación limpia y oscura que contenga una pequeña mesa de
laboratorio. Se colocan una incubadora y un microscopio de disección en el banco.
Es conveniente configurar un microscopio de fluorescencia en un aislador de
vibraciones dentro del cuarto oscuro para tomar fotos de los axones. No se utiliza
un banco limpio convencional para trabajar.

2.1 Huevos fertilizados
1. Incubadora: coloque los huevos fertilizados y ajuste la temperatura a
38,0–38,3-C. La rotación de los huevos no es necesaria hasta los 6 días de
incubación. Mantenga alta humedad (verNota 1).
2. Refrigerador: Guarde los huevos fertilizados antes de la incubación hasta por 2
semanas. Fije la temperatura entre 10 y 12-C. Ponga un plato lleno de agua
para mantener la humedad.

3. Huevos fertilizados: Compra de un granjero local o un proveedor de

animales de experimentación (verNota 2).

2.2 Sala Limpia 1. Cuarto limpio oscuro equipado con una unidad de filtro HEPA con ventilador de techo
motorizado (verNota 3).

2. Mesa de laboratorio.

3. Microscopio de disección.
4. Incubadora seca (37,5–37,9-C).
5. Aislador de vibraciones: una mesa pesada sostenida por cojines de
aire comprimido o gas nitrógeno.
6. Microscopio de fluorescencia confocal: un microscopio vertical con
objetivos de inmersión en agua de gran aumento (-20, -40,
- 100) y objetivos de bajo aumento (-4, -10).

2.3 Cámara de Cultura 1. Cámara de cultivo redonda (25 mm de diámetro, 2 mm de

espesor) (verNota 4).
64 Masayuki Yamashita

Figura 2Axones RGC de crecimiento irregular. (a)La tira retinal se desprendió del filtro de membrana y se enroscó sobre él.
(b)La parte central del borde ventral se separó del filtro de membrana y se levantó. (discos compactos)Una tira retiniana
desprendida del filtro de membrana en la periferia. (C)Los bordes dorsal, nasal y ventral se separaron del filtro de
membrana. (d)Axones extendidos desde las partes superiores de la tira retiniana.

Referencias

1. Halfter W, Dong S, Schurer B et al (2005) Síntesis
embrionaria de la membrana limitante interna y
el cuerpo vítreo. Invest Ophthalmol Vis Sci
46:2202–2209
2. Randlett O, Poggi L, Zolessi FR et al (2011) La
emergencia orientada de axones de las células
ganglionares de la retina está dirigida por el contacto
de laminina in vivo. Neurona 70: 266–280
3. Halfter W, Willem M, Mayer U (2005) Supervivencia
dependiente de la membrana basal de las células
ganglionares de la retina. Invest Ophthalmol Vis Sci
46:1000–1009
4. Halfter W, Dong S, Balasubramani M et al (2001)
Interrupción temporal de la lámina basal de la
retina y su efecto sobre la histogénesis de la retina.
Dev Biol 238: 79–96
5. de Curtis I, Reichardt LF (1993) Función y distribución
espacial en el desarrollo de retina de pollo de
el receptor de laminina α6β1y sus isoformas.
Desarrollo 118:377–388
6. Hynes RO (2002) Integrinas: máquinas de señalización
alostéricas bidireccionales. Celda 110: 673–687
7. Srichai MB, Zent R (2010) Estructura y función de la
integrina. En: Zent R, Pozzi A (eds) Interacciones de
la matriz celular extracelular en el cáncer. Springer,
Berlín
8. Kim SH, Turnbull J, Guimond S (2011) Matriz
extracelular y señalización celular: la
cooperación dinámica de la integrina, el
proteoglicano y el receptor del factor de
crecimiento. J Endocrinol 209:139–151
9. Yamashita M (2015) Los campos eléctricos débiles sirven como
señales de guía que dirigen los axones de las células
ganglionares de la retina in vitro. Biochem Biophys Rep 4: 83–88
 Múltiples enfoques para mejorar la actividad neuronal para promover la neurita. . . 73

Figura 9Diagrama de flujo del enfoque utilizado para cuantificar el crecimiento de neuritas del explante de retina. La
imagen del explante de retina inmunoteñido doble fue (1)dividido en diferentes canales de color, verde (TUJ1) y azul (DAPI).
(2)La imagen del canal azul se binarizó y se definió el área del explante de retina. (3)Se eliminó la señal verde
(neuritas RGC) dentro del área del explante de retina. (4)Se delinearon dos contornos concéntricos de una
circunferencia en expansión fuera del explante de retina (intervalo de 100 μm), y el área fuera del explante se
dividió en tres áreas: 100 μm (rosa), 100–200 μm (azul claro) y >200 micras (naranja). (5)Las áreas de neuritas
(canal verde) que crecieron a partir de los explantes se midieron en estas tres áreas por separado.

3.6 Viabilidad celular Se examinó el estado de varios explantes de retina utilizando el kit de
Ensayo ensayo de apoptosis Vybrant (Y3603;Thermo Fisher Scientific, Waltham,
Massachusetts, EE. UU.). YO-PRO-1 en este ensayo es capaz de marcar
tanto las células muertas como las células en apoptosis con fluorescencia
verde [9]. Los explantes después de ser cultivados durante 5 días se
incubaron con 100 nM YO-PRO-1 durante 1 h en un 37-C y 5% CO2
incubadora humidificada. Luego se capturaron imágenes de los explantes
inmediatamente usando un microscopio invertido (Axio Observer.Z1, Zeiss) en
un tiempo de exposición fijo. La condición de cada explante de retina se
cuantificó midiendo el área positiva de YO-PRO-1 (fluorescencia por encima del
umbral) en comparación con el área total del explante. La especificidad de la
supervivencia de RGC se examinó utilizando un marcador TUJ1 específico de
RGC para establecer una correlación entre la supervivencia de RGC y la señal
de YO-PRO-1. A continuación, los resultados se normalizaron frente a los
explantes bajo la condición de control. El análisis de imágenes se realizó
utilizando ImageJ.

3.7 Eléctrico Los explantes de retina en el MEA se perfundieron constantemente con

Estímulo medio de Ames oxigenado fresco (~ 1 ml / min) y se mantuvieron a 31–33-
C. Se permitió que los explantes se asentaran en el MEA durante más de
30 minutos antes de la estimulación eléctrica. La estimulación se realizó
utilizando un sistema USB-MEA in vitro (Multichannel Systems, Alemania)
con un chip MEA (60MEA200/10iR-ITO-pr-T) que
 Orientación de la expresión génica por electroporación de transposones que contienen miARN 97

Micromanipulador (p. ej., Narishige (Japón), MM3),http://

products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/
english.html
Agujas 18G
Tubería de PVC (VWR, Cat. No. 228-3830)
Jeringa Hamilton (50 μL, Sigma Cat. No. 20715,
Hamilton Cat. No. 80901).
Agujas de micropipeta de vidrio:
Las agujas de micropipeta utilizadas para la microinyección
se fabrican tirando del tubo capilar de borosilicato FHC con fibra
de punto omega (1 mm DE - 0,75 mm DI, FHC Inc. ME, EE. UU.,
Cat. No. 30-30-1) con un extractor de micropipetas Instrumento
Sutter P97,https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97. html).
Pellizque la punta de los tubos capilares tirados con unas pinzas
finas para generar una abertura.
4. Aparato de electroporación:
Electroporador: electroporador de onda cuadrada CUY21 (Nepa
Gene)
Electrodos (CUY611P3-1, Sonidel) https://
www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94

Titular (CUY580, Sonidel) https://www.sonidel.com/

product_info.php?products_id¼85

cables:
cable c117,https://www.sonidel.com/product_info.
php?productos_id¼252
Cables C115CB,https://www.sonidel.com/product_info.
php?productos_id¼254
5. Pinzas: finas, curvas y rectas Tijeras:
medianas y pequeñas
6. Aceite mineral pesado (Sigma-Aldrich).
7. Solución verde rápida al 1%:
Se disuelven 100 mg de Fast Green FCF (Sigma-Aldrich) en 10 mL de
PBS (con Ca2+y magnesio2+; pH 7,4). Filtre la solución a través de un
filtro de jeringa de 0,2 μm en un tubo cónico de 15 ml. Almacenar a
temperatura ambiente.
8. Solución salina de Hank

3 métodos

3.1 Diseño El diseño de oligonucleótidos pre-miARN es fundamental para el silenciamiento

ADN monocatenario génico exitoso. Utilizamos una herramienta en línea proporcionada por Invitrogen,
Oligos para focalización diseñador de ARNi,que ayuda a elegir secuencias objetivo y diseñar oligos pre-
el gen del interés [ miARN. Para un gen objetivo dado, puede ser necesario generar múltiples
14] secuencias de pre-miARN y examinarlas en busca de
126 Wei Fang et al.

3 Equipo

1. Se puede usar un extractor de micropipetas Flaming/Brown (Modelo

P-97; Sutter Instrument Co.) para preparar agujas de inyección de
embriones con capilares de vidrio de borosilicato (Kwik-FilTM; World
Precision Instruments, Inc. Cat #: 1B100-4) [18,19].
2. Se puede usar una PicoPump neumática (World Precision Instruments,
Inc.; PV820) para inyectar construcciones de ADN en embriones de
pez cebra [18,19].

4 métodos

4.1 Fase I:
Bioinformática
Predicción del
Promotor Central
y potenciador de un
gen de pez cebra
4.1.1 Justificación
Los promotores y potenciadores centrales se pueden predecir con muchos
algoritmos bioinformáticos. Tal predicción se basa en la lógica de que las
secuencias de ADN que poseen propiedades características de las CRE son
probablemente CRE. Las siguientes tres propiedades características son
particularmente importantes para predecir los promotores y potenciadores
centrales: ubicaciones, conservación de secuencias y posesión de sitios de
unión de factores de transcripción.
Las ubicaciones de los principales promotores y potenciadores:Los promotores
principales contienen TSS [4,8,9,20]. Por el contrario, los potenciadores no se
superponen con los TSS y, a menudo, residen a miles de pares de bases de distancia
de los TSS, hasta 100 kb de distancia. (En algunos genes, los potenciadores también
pueden residir no muy lejos de los TSS, como a 100–200 pb de distancia de los TSS).
Los potenciadores pueden localizarse aguas arriba o aguas abajo de los TSS [10].
Cuando reside aguas abajo de un TSS, un potenciador puede ubicarse dentro de un
intrón o aguas abajo del gen. Esta versatilidad de las ubicaciones de los
potenciadores hace que sea más difícil identificarlos que los principales
promotores.
Conservación de secuencias de promotores y potenciadores principales:Los
promotores centrales y los potenciadores generalmente residen en regiones no
codificantes conservadas, flanqueadas por tanto por secuencias de ADN no
conservadas. Tales conservaciones de secuencia existen tanto entre ortólogos de
múltiples especies como entre diferentes genes corregulados dentro de un solo
genoma.21–24].
Posesión de sitios de unión para factores de transcripción:Los promotores
centrales y los potenciadores están densamente empaquetados con motivos
de secuencia corta altamente conservados (entre 6 y 17 pb), algunos de los
cuales son palindrómicos o repeticiones directas. Estos motivos de secuencia
son sitios de unión para factores de transcripción.4,25], que a menudo se unen
al ADN como dímeros o incluso trímeros, y cada factor de transcripción se une
a una secuencia tan corta como 3 residuos de nucleótidos [1,3,26]. Por
ejemplo, una caja TATA rica en AT, que normalmente reside 30 pb aguas arriba
de los TSS de algunos promotores centrales, recluta TBP del complejo TFIID.27
], y un iniciador, que abarca los TSS, recluta un dímero TAFII250– TAFII150 [28].
De manera similar, múltiples sitios de unión en potenciadores
 RNAscope ISH en retina de ratón FFPE 149

tinción inmunofluorescente para visualizar tanto los ARNm como la

localización de proteínas en la retina del ratón.11]. También se ha utilizado en
peces cebra completos y embriones de pollo y también se puede utilizar en
retinas de montaje plano [12,13] (verNota 2).Aquí describimos un protocolo
para RNAscope ISH utilizando retinas de ratón adultas y embrionarias
seccionadas por FFPE con reacción de color marrón.

2 materiales

2.1 ARNscopio 1. Reactivo de detección RNAscope 2.5 HD-MARRÓN: almacenar a 4-

reactivos C.
2. Sondas de destino (canal de color 1): almacenar en 4-C.
3. Proteinasa III: almacenar a 4-C.
4. Reactivos de recuperación de objetivos: prepare el reactivo de recuperación de
1 objetivo agregando 10 ml de reactivo de recuperación de 10 objetivos a 90
ml de agua tratada con DEPC (DEPC-DW).

5. Tampón de lavado: prepare 200 ml de tampón de lavado 1 agregando

4 ml de tampón de lavado 50 a 180 ml de agua destilada. Mezclar
bien.

2.2 Equipo 1. Sistema de hibridación HybEZ: el horno HybEZ y la bandeja de control

de humedad HybEZ con tapa se utilizan para la hibridación y la
reacción de color con el sistema RNAscope.
2. Horno al vacío para mantener la temperatura a 65-C para la inclusión de
muestras en parafina.

3. Microtomo (ThermoFisher Scientific) para seccionar la muestra FFPE.

4. Baño de agua para mantener la temperatura a 40-C para seccionamiento FFPE.

5. Placa calefactora (VWR) para recuperación de objetivos de pretratamiento.

2.3 Otros materiales 1. Formalina tamponada neutra al 10%.

y reactivos 2. Solución salina tamponada con fosfato (PBS).

2.3.1 Fijación, 3. Etanol (EtOH) al 30 %, 50 %, 70 % y 100 %.

Deshidratación, Incrustación 4. Xileno.
y Seccionamiento
5. Cera de parafina.

6. Portaobjetos SuperFrost Plus (Fisher Scientific).

7. DEPC-DW.

2.3.2 Pretratamiento 1. Peróxido de hidrógeno (Mallinckrodt Chemicals): Prepare una solución de

peróxido de hidrógeno al 3 % agregando 5 ml de peróxido de hidrógeno
al 30 % a 45 ml de DEPC-DW. Mezclar bien.
2. Lápiz hidrofóbico ImmEdge (Vector Laboratories).
 RNAscope ISH en retina de ratón FFPE 155

5 notas

1. El ensayo RNAscope aplica nuevas sondas ISH. Se diseña y adquiere una

mezcla de múltiples sondas para reconocer genes diana específicos de
Advanced Cell Diagnostics (Newark, CA). Estas sondas contienen
secuencias únicas para unirse al ARN objetivo, un espaciador y una
secuencia de cola. Se utilizan un par de secuencias de cola para la
amplificación de la señal (diseño de doble Z). El diseño de doble Z permite
una especificidad de objetivo significativa y una reducción de fondo. Los
mecanismos detallados se pueden encontrar en el sitio web del fabricante
(https://acdbio.com/science/how-it-works).
2. RNAscope ISH es compatible con retinas de montaje plano. Realizamos ISH
de color marrón de RNAscope con una sonda RNAscope Jam2 en una
retina de ratón de montaje plano. Jam2, la molécula de adhesión de la
unión 2, se expresa en un subconjunto de células ganglionares de la
retina OFF (RGC) [14,15]. Usando la tecnología RNAscope, detectamos
señales claras en la capa de células ganglionares de la retina (Fig.3). Sin
embargo, las retinas tienden a desintegrarse durante el procedimiento
debido al tratamiento con proteinasa.
3. La fijación insuficiente causará problemas con la hibridación y la
detección de señales. El tamaño de la muestra debe ser inferior a 4 -
4 - 4 mm. Para embriones de ratón mayores de E16.5, recortar

Fig. 3Ejemplo de ISH de color marrón de RNAscope en retina de ratón de montaje plano utilizando la
sonda RNAscope Jam2. Se montó plana una retina de ratón P7 de tipo salvaje con el lado GCL hacia
arriba. Para el pretratamiento, las retinas se colocaron en una bandeja de metal que contenía 50 ml de
solución de recuperación de objetivos. Luego la bandeja se calentó en un vaporizador durante 5 min.
Después del pretratamiento, las retinas se trataron en una placa de cultivo de 24 pocillos durante todo el
procedimiento. Las CGR positivas para Jam2 se indican mediante puntas de flecha. Barras de escala: 50
μm.GCLcapa de células ganglionares
192 Leila Jamal et al.

Figura 2Imagen representativa que muestra el patrón de tinción AP en montajes planos de retina. (a)Tbr1CreERT2/+:rosaiAP/+
retina, (b)Tbr1CreERT2/+:Pou4f1CKOAP/+retina. Nota: EnTbr1CreERT2/+:Pou4f1CKOAP/+retina, la tinción de fondo AP
inespecífica a menudo aparece en los axones, pero no en los somas. Barra de escala: 200 μm

Fig. 3Imagen representativa de la galería que muestra la tinción AP en RGC individuales que expresan Tbr1 a través de
secciones ópticas. (a)Un J-RGC asimétrico que expresa Tbr1, (b)un RGC OFF que expresa Tbr1 simétrico con un tamaño de
árbol dendrítico más pequeño, y (C)un OFF RGC simétrico que expresa Tbr1 con un tamaño de árbol dendrítico más
grande. Este subtipo de RGC recuerda a los RGC OFF alpha. Nota: El fondo de tinción AP no específico en Tbr1CreERT2/+
:Pou4f1CKOAP/+las retinas en los axones se indican mediante puntas de flecha blancas
202 Vosotros largo

Figura 2La comparación de un MicroFil (28GAUGE/67MM) (abajo) y una aguja de llenado hecha a sí
misma con una punta de pipeta de 200 μL (arriba)

con conejo El vítreo del ratón está parcialmente adherido a la lente, por lo que
no fuerce la separación de la lente de los puntos de fijación. Con unas pinzas
finas y/o un cepillo, saque suavemente el vítreo con la lente a lo largo de la ora
serrata.

9. Una malla y/o arpa ayudan a asentar la retina en la cámara de superfusión

(Fig.3), pero la malla y el arpa pueden impedir que los microelectrodos
lleguen a las células y luego estrechar el espacio de trabajo de la retina.
La esclerótica mantiene la retina en una condición más fisiológica que es
beneficiosa para el acoplamiento celular, pero dificulta el aplanamiento
de la retina. Aplanar la retina aislada en un papel de filtro negro es otra
forma de fijarla en la cámara. Sin embargo, si se va a aplicar microscopía
de contraste de interferencia diferencial (DIC) en los experimentos, esta
forma no es adecuada ya que el papel de filtro bloqueará la trayectoria de
la luz.
10. Los tejidos de la retina suelen tener un pequeño desplazamiento después de
asentarse en la cámara, ya que el tejido necesita tiempo para adaptarse al nuevo
entorno y alcanzar una condición estable. Durante la inyección, incluso un poco de
desplazamiento y mala posición entre la punta del microelectrodo y la celda pueden
provocar la falla de la inyección.

11. Una micropipeta de punta afilada y de conicidad gradual es un factor clave para
tener éxito en la microinyección. El extractor de pipetas emplea una nueva
estrategia para la fabricación de micropipetas que permite lograr un control
independiente de sus diámetros de punta y conicidad. Antes de diseñar o
ajustar un programa con extractor de pipetas, se requiere una prueba de
rampa para decidir el ajuste de calor apropiado cuando se usa el extractor por
primera vez o se cambia el filamento del extractor o la caja de vidrio. Si el
ajuste de calor es mucho más alto que el valor de la rampa, existe el riesgo de
quemar el filamento. Para la microinyección, se aplica comúnmente un
programa de bucle (calor, tracción, velocidad y tiempo) y 500 unidades de
presión de aire [15].

12. La sal de potasio de LY puede formar partículas insolubles, por lo que los electrodos
deben rellenarse con LiCl durante la iontoforesis. Es posible que se detengan
algunas burbujas de aire en las puntas de las micropipetas durante el llenado
214 Hung-Ya Tu y Take Matsuyama

3.4 Procesamiento de datos 1. Mapeo de injertos.

y análisis (a) Mapee la ubicación del injerto de acuerdo con las dimensiones físicas
de la sonda. Por ejemplo, en las grabaciones que utilizan una sonda
MEA 8 8, la ubicación del injerto se mapea en una cuadrícula de 26
26: cada cuadrado tiene un tamaño de 50 50 μm2, igual que el
tamaño del electrodo o la mitad del intervalo entre electrodos
vecinos (verNota 6).
(b) Asigne cada cuadrado de la cuadrícula 26 26 para indicar si está
cubierto ("encendido") o no ("apagado") por el injerto (ver Nota
7).
(c) Asigne cada cuadrado de la cuadrícula 26 26 para indicar si
está ubicado en la región de "daño" (verhigos.2by3c, por
ejemplo).
2. Análisis de ondas a/b mERG (verNota 8).
(a) Establezca un filtro de paso de banda de 1 a 50 Hz para aislar las formas de
onda mERG de los picos de RGC de alta frecuencia y los ruidos de baja
frecuencia que aparecen en las retinas degeneradas.

(b) Identifique todos los máximos y mínimos locales dentro de 1 s después de

10 ms de estimulación con luz (verNota 9)suavizando ligeramente los
datos y detectando máximos o mínimos en los márgenes móviles de la
serie temporal (Fig.2a, b;verNota 10).

(c) Las ondas a candidatas son mínimos locales dentro de 55 ms y las

ondas b son máximos locales dentro de 120 ms. Asigne los picos
más grandes dentro de la ventana de tiempo como ondas a y b
tentativas.
(d) Utilice la grabación hasta el inicio de la estimulación de la luz como
referencia. El desplazamiento de la línea de base desde cero y su
desviación estándar se utilizan más tarde como referencia para
identificar y corregir la magnitud de los cambios significativos de las
fluctuaciones aleatorias (verNota 11).

(e) Trace el mapa de calor de la amplitud de la onda b en correlación con

la ubicación del injerto para cada condición de registro (Ames, L-
AP4, lavado; consulte también la Fig.2c, por ejemplo); esta voluntad

Figura 2 (continuación) recuperada después del lavado. (d)Los resultados de la inferencia bayesiana de la amplitud de la onda b
usando un modelo de obstáculos Gamma. θ representa la probabilidad de generar una onda b (en escala logit inversa); μ y σ2
representan la media y la varianza de la amplitud de la onda b, respectivamente (en escala exponencial). Los diagramas de violín
muestran la distribución de valores creíbles estimados por inferencia bayesiana. Los puntos representan el valor más probable, las
barras finas de color gris claro representan el intervalo del 89 % de los valores más probables y las barras gruesas de color gris
oscuro representan el intervalo del 50 % de los valores más probables. Para simplificar, los datos de los canales en la región de
"daño" se excluyeron de este análisis. Cuando se procesan varias muestras, también se puede agregar "daño" como predictor
separado del modelo que estima el efecto del daño. Tenga en cuenta que la onda b no se detectó en presencia de L-AP4 y, por lo
tanto, existe una gran incertidumbre en la estimación de la media y la varianza para esta condición.
226 Nange Jin et al.

a b
sistema operativo

ES

ONL

OPL

INL

IPL

GCL

C d mi
sistema operativo sistema operativo sistema operativo

ES ES ES

ONL ONL ONL

OPL OPL OPL

Figura 1Identificación de pares de fotorreceptores en el corte de retina de ratón vivo. (a)Descripción general de la cámara de
perfusión con secciones de retina en su lugar. Tenga en cuenta el gran tamaño de la cámara, que permite el flujo laminar de la
solución de perfusión y garantiza la estabilidad durante las grabaciones. (b–d)Vistas de un corte de retina de ratón fijado en
paraformaldehído, reaccionado con un anticuerpo contra la arrestina de cono (verde) y visualizado bajo un microscopio confocal.
Una vista ampliada de la parte exterior (cuadrado blanco en [b])se muestra en (discos compactos).La tinción DAPI (azul) de los
núcleos se muestra en (antes de Cristo)y omitido en (d)para mayor claridad. Obsérvese la posición de los conos somas en la parte
más externa de la ONL (flechas blancas) y la de los pedículos de los conos en la parte inferior de la ONL y en la OPL (puntas de flecha
blancas). (mi)Imagen DIC de la parte exterior de un corte de retina de ratón y de los electrodos de grabación colocados en somas de
varilla adyacentes bajo iluminación infrarroja en la configuración experimental. Las líneas discontinuas delimitan el área que incluye
solo bastones. Esta es el área objetivo para la grabación de bastones, en registros emparejados de bastón/barra o bastón/cono.
Para grabar desde conos, apuntamos a las terminales de cono o pedículos que son visibles como estructuras contrastadas en modo
DIC (círculos blancos).sistema operativosegmentos exteriores,ESsegmentos internos,ONLcapa nuclear externa,OPLcapa plexiforme
externa,INLcapa nuclear interna,IPLcapa plexiforme interna,GCLcapa de células ganglionares. Barras de escala: (a),2 centímetros, (
b),50 micras, (c)-(e),25 micras. Cifras (c–e)modificado de la Fig. 1 de [9], con permiso

3.3 Análisis de datos
Un valor de la corriente (YO)se toma de la media de los valores
registrados entre 20 y 30 ms después del inicio del paso (V). Valores
de la corriente registrada (YO)se representan en función de la tensión
de mantenimiento (V).La conductancia de la unión se estima a partir
de la pendiente de la curva de regresión lineal que se ajusta a los
datos experimentales (Fig.2). Los análisis de datos y estadísticos se
realizan con Clampfit (Molecular Devices) y OriginPro (OriginLab).