Guia 5 2021 - Laboratorio y Miscelaneas - Indd

Genética 5: LABORATORIO EN BIOLOGÍA molecular Y GENÉTICA
5
cto
GENÉTICA
Laboratorio En Biología Molecular Y Genética
- Identificación de proteínas: Fraccionamiento subcelular, Inmuno-
histoquímica, Inmunofluorescencia, Western Blot
- Extracción del ADN, Enzimas de Restricción, Electroforesis
- Técnicas de ADN recombinante: Vectores de ADN, El gen reporter,
Crispr-Cas9, animales transgénicos, ratones knock-in y knock-out
- Identificación de ADN: Southern, Microarray, Dot Blot
- Amplificación del ADN: PCR clásica, alelo específica, en tiempo
real (Q-PCR), RFLP-PCR, RT-PCR
- Identificación de ARN: Northern blot
2021
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Contenido
INTRODUCCIÓN
LAS TÉCNICAS PARA LAS PROTEÍNAS

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR ....................................................................................................................4
INMUNOHISTOQUÍMICA, INMUNOCITOQUÍMICA E INMUNOFLUORESCENCIA ..............................................5
LA ELECTROFORESIS ...........................................................................................................................................7
EL WESTERN BLOT ...............................................................................................................................................9
LAS TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE

LA EXTRACCIÓN DEL ADN ..................................................................................................................................10
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN .......................................................................................................................10
LOS VECTORES DE ADN ....................................................................................................................................12
EL GEN REPORTER .............................................................................................................................................14
LOS ANIMALES TRANSGÉNICOS .......................................................................................................................15
TÉCNICAS PARA AFECTAR LA EXPRESIÓN DE UN GEN .................................................................................15
LA TÉCNICA DE CRISPR–CAS9 ..........................................................................................................................15
SOUTHERN BLOT (LA TRANSFERENCIA SOUTHERN) ....................................................................................17
SECUENCIACIÓN DEL ADN.................................................................................................................................18
MICROARRAY O MICROMATRICES....................................................................................................................20
DOT BLOT .............................................................................................................................................................20
TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN DEL ADN

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)........................................................................................20
PCR CON RETROTRANSCRIPTASA (RT-PCR) ..................................................................................................22
PCR EN TIEMPO REAL (qPCR) ...........................................................................................................................23
PCR ALELO ESPECIFICA.....................................................................................................................................23
PCR RFLP .............................................................................................................................................................24
LA TÉCNICAS PARA ARN

NORTHERN BLOT ................................................................................................................................................24
BIBLIOGRAFÍA
PREGUNTAS DE REPASO
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establecidos por la legislación vigente, sin el consentimiento del autor, es ilegal. Esto se aplica en particular a la re-
producción, fotocopia, grabación o cualquier otro sistema de recuperación de almacenaje de información.
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Hecho el depósito que establece la Ley 11.732
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INTRODUCCIÓN
El laboratorio en biología celular y molecular comprende un conjunto de técnicas habituales usadas en el
laboratorio, cada una con un fin específico.
Actualmente no está permitido el estudio a cierto nivel molecular en humanos, por lo que se recurre frecuen-
temente a los llamados Modelos Experimentales, que son modelos de experimentación unicelulares (bacterias y
hongos) o multicelulares (invertebrados y vertebrados) que comparten propiedades que se conservaron a través de
la evolución, y permiten así estudiar procesos moleculares y celulares que se asemejan fuertemente a procesos que
se dan en humanos. En ellos es en quienes se practican las distintas técnicas de Laboratorio en Biología Celular y
Molecular.
El uso de modelos experimentales se basa en la existencia de un antepasado común celular para las célu-
las actuales, y que las propiedades fundamentales de las células se mantuvieron a lo largo de la evolución. Así, es
frecuente leer trabajos de investigación hechos en la bacteria Escherichia coli, el hongo Saccharomyces cerevisiae,
el gusano invertebrado Caenorhabditis elegans (o C. elegans), la mosca Drosophila melanogaster, la rana Xenopus
laevis, el pez cebra (Danio rerio), o el ratón Mus musculus.
En esta guía no vamos a hablar de los modelos experimentales, sino que vamos a desarrollar las distintas
técnicas de laboratorio en biología molecular y genética. Es fundamental conocer los pasos de cada una, y com-
prender cuáles son sus usos, porque nos permiten analizar datos de la biología molecular y la genética desde una
perspectiva más precisa.
A grandes rasgos, las técnicas pueden agruparse en dos grandes familias, dependiendo del contenido que
se quiere estudiar. De esta manera, pueden ser:
4 Técnicas en biología Molecular: son aquellas técnicas que nos permiten identificar segmentos parciales o
totales de ADN, ARN o proteínas
4 Técnicas en Citogenética: son aquellos estudios o técnicas que nos permiten estudiar cromosomas. Estas
técnicas incluyen el Cariotipo con bandeado y FISH. Y si bien existen otras técnicas, ya son más especí-
ficas, y exceden los contenidos de los programas de la materia. Debido a su uso específico en genética,
las técnicas en Citogenética se verán en la guía 4 de Genética, donde abordamos a los cromosomas y sus
métodos de estudio.
Listamos entonces todas las técnicas en Biología Molecular que vamos a desarrollar en detalle a continua-
ción, separándolas según lo que se quiere estudiar. De esta manera, vamos a ver:
1. Para Proteínas
a. Fraccionamiento Subcelular
b. Inmunohistoquímica, Inmunocitoquímica
c. Inmunofluorescencia
d. Western Blot
e. Técnica del Gen Reporter
2. Técnicas de ADN recombinante
a. Vectores de ADN
b. El gen reporter
c. Crispr-Cas9
d. Animales transgénicos
e. Ratones knock-in y knock-out
3. Para identificación de ADN
a. Southern Blot
b. Secuenciación del ADN
c. Sanger
d. Alto rendimiento
e. Dot Blot
f. Microarrays o Micromatrices
4. Para amplificación del ADN
a. PCR Clásica
b. PCR Alelo Específica
c. PCR RFLP
d. Q-PCR
5. Para ARN
a. Northern Blot
b. RT-PCR
c. Microarray o Micromatrices
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LAS TÉCNICAS PARA LAS PROTEÍNAS
FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
Se trata de un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enrique-
cidas de un determinado componente celular. Dicho de otra manera, es una técnica que permite separar distintos
compartimentos subcelulares, manteniendo su contenido. Por ejemplo, separar el núcleo del citoplasma, el Retículo
endoplásmico, mitocondrias, etc. Para hacerlo, se requiere de la implementación de la centrifugación diferencial, que
ya hablaremos más adelante.
RECORDÁ: el fraccionamiento subcelular permite separar los distintos compartimentos subcelulares, manteniendo
en su interior las enzimas y proteínas que le son propias, y que se encuentran en su interior
PASOS DEL FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

Esta técnica se debe practicar en dos etapas, lla-
madas etapa I y Etapa II. En la primer etapa buscaremos
romper la membrana plasmática sin daño de las organelas,
y en la segunda etapa iremos separando los distintos com-
ponentes subcelulares.
En la Etapa I se procede, como dijimos previamen-
te, a romper las distintas membranas plasmáticas celulares
de la muestra a separar. Esta ruptura mecánica puede ha-
cerse con diversas técnicas, pero la más frecuentemente
usada es la del uso del Homogeneizador, una suerte de
minipimer especial de pequeño tamaño que permite cum-
plir correctamente con este etapa. También puede usarse
la exposición a sonidos de alta frecuencia (llamado Sonica-
ción), o el tratamiento con una batidora de alta velocidad.
El producto final se llama Homogenato, Homogeneizado o
Lisado, y se trata de una suspensión que tiene libre el cito-
sol y mantiene indemne a las organelas subcelulares.
En la Etapa II Se procede a la Centrifugación Dife-
rencial. Se trata de una serie de 4 centrifugaciones secuen-
ciales a velocidad y tiempo creciente, es decir que vamos
aumentado la velocidad y el tiempo de duración de cada
centrifugación. En cada centrifugación se va a obtener un
sobrenadante (lo que queda precipitado en el fondo), que
es lo que se separa. De esta manera, vamos a obtener en
las distintas centrifugaciones:
4 Primera Centrifugación: Separamos núcleos del
resto de la célula
4 Segunda Centrifugación: separamos Mitocondrias,
lisosomas y Peroxisomas
4 Tercera Centrifugación: separamos Microsomas
(restos del retículo endoplásmico y Golgi, y restos
de membrana plasmática
4 Cuarta centrifugación: separamos ribosomas de ci-
tosol. En citosol están todos los ARNm maduros.
Lo que queda en el tubo de ensayo, luego de hacer

el homogenato primero y las centrifugaciones diferenciales
después, es el citosol y su contenido.
DATO MENOR: La centrifugación diferencial es una técnica que separa a los distintos componentes a partir del
peso y la densidad, haciendo que los elementos de mayor tamaño queden en el fondo, o sea precipiten y formen el
precipitado en el fondo del tubo de ensayo, y eso es lo que se separa u obtiene de cada precipitado.
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Para evaluar la efectividad de la técnica , se pueden hacer dos técnicas, muy distintas una de la otra, pero
con el mismo fin:
4 Búsqueda de enzimas específicas: Se busca por medio de e una reacción química ver si esta presente en el
sedimento obtenido una enzima que debería estar presente en esa fracción. Para hacerlo, se hace induce
una reacción química que requiera de su acción. Por ejemplo la Citocromo Oxidasa mitocondrial, gluco-
sa-6-fosfatasa microsomal (si vemos una biopsia de hígado), o la enzima Láctico Deshidrogenasa (LDH)
citosólica.
4 Microscopía electrónica de transferencia: para ver la morfología del sedimento obtenido, y si se condice con
la fracción obtenida.
DATO A RECORDAR: Si algún día entrás a un laboratorio, y vas a usar un centrifugador, tené presente este
consejo: siempre que pongas un tubo de ensayo en un slot, poné otro en el enfrentado. Siempre tienen que estar
simétricamente nivelados, sino el rotor no gira bien y se destruye el tubo de ensayo. Obvio, a mi ya me pasó...
INMUNOHISTOQUÍMICA, INMUNOCITOQUÍMICA E INMUNOFLUORESCENCIA

Estas técnicas altamente selectivas utilizan anticuerpos del tipo Inmunoglobulina G marcados con una enzi-
ma o con algún pigmento fluorescente para poder identificar estructuras de pequeño tamaño, como por ejemplo una
proteína de membrana. Estos anticuerpos son tan selectivos que pueden unirse a una proteína y no unirse a otra
que sea casi idéntica, pero que difiera en algunos aminoácidos solamente. De ahí su alta selectividad. La diferencia
de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica se basa en la ubicación de lo que se quiere buscar: si está dentro de la
célula se llama inmunocitoquímica, y si se busca una ubicación tisular, se usa la inmunohistoquímica.
RECORDÁ: La diferencia entre inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia, es la molécula pegada al anticuerpo,

y que permite su visualización.
Vayamos por partes. Los anticuerpos o inmunoglobulinas

son unas proteínas especiales, capaces de unirse a distintas molé-
culas con alta afinidad y selectividad, y son capaces de diferenciar
dos proteínas que son distintas tan solo en algunos aminoácidos.
Estos anticuerpos están “marcados”, o sea que tienen algo unido a
ellos que permite ponerlos en evidencia. El marcador puede ser mo-
léculas fluorescentes (como la Fluoresceína) o pueden tener unido
una enzima (la famosa peroxidasa de rábano). Por eso pueden ser
técnicas de Inmunofluorescencia (si usa una sustancia fluorescente
como marcador), o técnicas Inmunoenzimáticas.
A su vez, estas técnicas se usan cuando se quiere poner
en evidencia una sola molécula, como por ejemplo una proteína es-
pecífica, o un solo fosfolípido, o lo que se quiera identificar. Ahí esta
su selectividad. Por ejemplo, supongamos que queremos poner en
evidencia la presencia de la proteína Citoqueratina en el citoplasma
de una célula. La técnica de elección es la de inmunocitoquímica,
porque queremos identificar la presencia en citoplasma de una pro-
teína específica.
RECORDÁ: La Inmunohistoquímica es una técnica altamente selectiva que usa anticuerpos marcados con una
enzima, y se usa para identificar pequeñas moléculas como proteínas, o fosfolípidos, por ejemplo. Si se usa una
molécula fluorescente como la Fluoresceína se llama Inmunofluorescencia.
Hay dos tipos de anticuerpos que se usan en esta técnica, cada uno con características individuales especí-
ficas. Estos anticuerpos se llaman Anticuerpo Primario y Anticuerpo Secundario.
EL ANTICUERPO PRIMARIO
El Anticuerpo Primario es de tipo policlonal. Esto significa que está formado por distintos anticuerpos, y que
cada uno reconoce una parte específica de la proteína que se quiere identificar. Cada parte de esta proteína se llama
epitope. Cada uno de estos anticuerpos fue producido por un linfocito B distinto.
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Para obtener el anticuerpo primario, se inyecta la proteína que se quiere identificar en un animal, por ejemplo
conejo. Supongamos que queremos crear un anticuerpo primario para citoqueratina humana. Entonces, tomaremos
la citoqueratina humana y la inyectaremos en un animal como el conejo. Esta inoculación hará que muchos linfocitos
B reaccionen con distintas partes (epitopes) de la proteína a identificar, diferenciándose a plasmocitos y sintetizando
distintos anticuerpos, específicos cada uno de un epitope de la citoqueratina humana. Y esos anticuerpos producidos
son recolectados a posteriori para ser los Anticuerpos primarios.
RECORDÁ: El anticuerpo primario son policlonal, y se trata de distintos anticuerpos que reconocen cada uno, una
parte distinta de la proteína que se quiere identificar.
EL ANTICUERPO SECUNDARIO
El anticuerpo secundario es de tipo monoclonal, y es un anticuerpo que reconoce al Anticuerpo primario, o
sea que es un anticuerpo anti anticuerpo primario (trabalenguas mal!). Monoclonal significa que es un solo anticuer-
po y no un grupo de anticuerpos como el primario.
Para obtenerlo, se inyecta el anticuerpo primario en otro animal distinto. Por ejemplo, si el primario lo hicimos
en conejo, el secundario se produce en oveja, cabra, ratón. Pero fundamental que sea animal distinto al primario.
Una vez obtenida la respuesta inmunológica en el animal, en este caso se aísla un solo linfocito de memoria, es
decir el que tiene la memoria inmunológica para producir un anticuerpo contra el anticuerpo primario. A ese linfocito
aislado se lo cultiva primero (para obtener mayor número), y cada clon es fusionado con una célula tumoral dan-
do un Hibridoma, es decir una célula inmortal (característica tumoral) con la memoria para producir un anticuerpo
específico (característica del linfocito B de memoria). De esta manera se obtiene una célula inmortal que produce
constantemente un anticuerpo específico.
DATO HISTÓRICO: Esta técnica de los anticuerpos monoclonales fue desarrollada por el químico argentino Dr.
César Milstein, y le valió ganar en el año 1984 el Premio Nobel en Medicina “Por las teorías sobre la especificidad
en el desarrollo y control del sistema inmune y el descubrimiento del principio para la producción de anticuerpos
monoclonales”.
MÉTODO DIRECTO Y MÉTODO INDIRECTO

Dependiendo de la cantidad que hay de la molécula que se quiere identificar, se pueden hacer dos técnicas
distintas. Si hay mucha cantidad se hace el método directo, y si hay poca cantidad se hace el método indirecto:
4 Método directo: El anticuerpo primario contra lo que se quiere poner en evidencia es quien está marcado. NO
se usa anticuerpo secundario, sino anticuerpo primario solamente.
4 Método indirecto: usa dos anticuerpos, el anticuerpo A y el B. El anticuerpo A es anti lo que se quiere poner
en evidencia y no está marcado. El anticuerpo B es anti anticuerpo A, y está marcado. Esta técnica se usa
para amplificar la imagen, cuando lo que se quiere buscar está en baja cantidad.
Si, por ejemplo, queremos buscar una proteína que está en alta cantidad en una célula, como por ejemplo
receptores para Insulina en tejido muscular, se usa el método directo, porque hay mucho del “antígeno”. En cambio,
si buscamos un proteína rara, que se cree que está en baja cantidad, y queremos ponerla en evidencia, usando el
método directo no vamos a poder verla al microscopio, y vamos a necesitar usar el método indirecto, donde pode-
mos amplificar la respuesta del anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario.
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DATO CLAVE: De los dos, el método indirecto es el más usado, porque provee una mayor sensibilidad en la
identificación de la molécula específica.
LAS DISTINTAS VARIANTES

Existen distintas formas de poder marcar a los anticuerpos, con el fin de poder visualizar la unión específica
de los anticuerpos con la molécula a identificar. Entre ellos, podemos nombrar:
4 Método enzimático: usando una enzima llamada Peroxidasa de Rábano, que es una enzima capaz de re-
accionar con moléculas cromogénicas como el DAB (diaminobenzidina), haciendo que de esa reacción se
genere un color en la zona de la misma, marcando la presencia de la molécula a identificar. La muestra se
observa luego al microscopio óptico de luz
4 Método fluorescente: se agrega al anticuerpo un fluorocromo, y se observa luego con microscopio de fluo-
rescencia. Cuando se hace así se llama Inmunofluorescencia.
4 Microscopia electrónica: Se agrega una sustancia electrondensa y se observa luego a microscopio electró-
nico.
LA ELECTROFORESIS
Para poder entender la técnica de Western Blot
para proteínas, Southern Blot para ADN, o Northern Blot
para ARN, previamente debemos conocer a la electro-
foresis, porque las técnicas precitadas requieren en un
momento del uso de esta técnica.
La Electroforesis es una técnica que se basa en
la capacidad de las moléculas con carga de moverse,
cuando son sometidos a un campo eléctrico. Es ta
técnica se basa en dos principios básicos, que permiten
entender las bases de funcionamiento de la electrofore-
sis:
a) Toda molécula que presente carga se va a
mover, en un campo eléctrico, siempre hacia el
electrodo de carga opuesta a la que tiene ella
b) Cuando se mueven en medios porosos, la
velocidad del movimiento es menor cuanto más
grande es la molécula, es decir que en un tiempo definido, si yo tengo dos moléculas que tienen un tamaño
distinto (y la misma carga) la distancia que va a recorrer la de menor tamaño será mayor que la que recorre
la de mayor tamaño. Y de esta manera conseguimos separarlas.
RECORDÁ: La electroforesis permite separar moléculas con carga eléctrica usando su tamaño o peso molecular, y
en el movimiento las moléculas con carga se movilizan hacia el electrodo de carga opuesta a la de ella. La carga que
tiene el ADN es negativo, debido a que presenta grupos fosfato en cada nucleótido, y es lo que usa la hematoxilina
para unirse y colorear al núcleo.
En un campo eléctrico, las moléculas con carga se movilizan hacia el electrodo de carga opuesta a la de
ella. Así un molécula como el ADN (que presenta carga negativa por los grupos fosfato de los nucleótidos), se va a
movilizar hacia el ánodo, y las de carga positiva (como algunas proteínas) van hacia el cátodo.
Esta técnica es útil cuando uno tiene distintos fragmentos de ADN cortados con enzimas de restricción que
queremos separar. El gran problema es que el tamaño del ADN es tal que es imposible observarlo a ojo o por medio
de microscopios ópticos. Pero ya veremos que se usan medios específicos para poder observarlo.
Para poder separar al ADN según su tamaño, se lo hace pasar por un medio semisólido y muy poroso. La
porosidad interna hace que las moléculas de gran tamaño tarden más en pasar por los poros, mientras que las de
menor tamaño pasan más fácilmente por los poros. Los medios semisólidos usados son dos: gel de Agarosa (el
clásico más usado), y el gel de Poliacrilamida. Estos geles tienen como característica ser gel porosos, es decir que
tienen poros u orificios en su interior. En el caso particular del gel de agarosa, presenta poros de distintos tamaños,
pero a mayor concentración de la agarosa cuando se prepara el gel, más pequeños son los poros, y por ende se
pueden separa más fragmentos. La poliacrilamida, en cambio, presenta un poro de calibre único, preestablecido en
el kit que se compra.
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DATO MENOR: La agarosa es un polisacárido natural formado por galactosas alfa y beta, que se extrae de las algas
de los géneros Gellidium y Gracillaria. La agarosa es soluble en agua y solidifica a temperatura ambiente
Y para poder separarlos correctamente, los fragmentos de ADN son colocados en el gel semisólido (se lo
siembra). Para hacerlo, en los pasos vemos que el gel de agarosa se deja solidifcar con el peine, que es un ele-
mento que permite dejar huecos en la agarosa una vez que solidifique. Y en estos huecos o slots es donde se va a
sembrar el ADN a separar, para que luego se vaya moviendo por dentro de la agarosa, hacia el ánodo (electrodo de
polo positivo). Y como los poros del gel van a interferir con el movimiento del ADN, los fragmentos de ADN de mayor
tamaño sufrirán mayor interferencia que los de menor tamaño, y así finalmente se van a mover menos en el tiempo.
DATO CLAVE: La electroforesis es la técnica que permite separar moléculas con carga a través de medios
semisólidos. Solamente eso. Todo aquello que se haga después, es parte de otra técnica que usa a la electroforesis
como parte de ella.
RECORDÁ: El gel de agarosa o el de poliacrilamida es un gel poroso, o sea que presenta orificios microscópicos
o poros en su interior. Esos orificios hacen que las moléculas de mayor tamaño sufran un retraso al pasar por su
interior, mientras que las de menor tamaño pasen más rápido, porque o bien las frenan menos, o bien no las frenan.
De esta manera, permite separar a los fragmentos de ADN dependiendo de su tamaño molecular.
Esta técnica se puede hacer con una sola muestra, o con varias muestras distintas. De hecho, el peine, a
través de sus dientes, puede hacer varios huecos o slots. Y en cada uno podemos sembrar una muestra distinta de
ADN. Supongamos que queremos saber si los miembros de una familia presentan una mutación específica. Para
ello, a cada uno se le hará una extracción de ADN, y se sembrará cada muestra en un slot. Y luego se hará la corrida
electroforética. Ya veremos más adelante como se interpreta.
Una vez terminada la técnica, el ADN se colorea con Bromuro de Etidio, un colorante fluorescente que se
mete entre ambas hebras de ADN, y absorbe la luz ultravioleta a 300 nm emitiendo una luz anaranjada. Hoy día son
pocos los lugares que siguen usando Bromuro de Etidio, debido a su alto efecto carcinogénico. Una forma alternativa
es usar el GelRed (así como se escribe, todo junto). Así, en cada calle vamos a ver un patrón de bandas (un conjunto
de bandas dispuestas una debajo de la otra, lo que me está informando que en cada calle se separó el ADN en esos
fragmentos. Siempre, para la interpretación, se pone la corrida en forma vertical, de tal forma que los fragmentos
más grandes queden arriba, y van disminuyendo de tamaño hacia abajo.
DATO CURIOSO: El ADN, ya nos queda claro, presenta un tamaño invisible al ojo humano, porque no entra dentro
del límite de resolución del ojo. Entonces, ¿cómo saber por donde se encuentra el ADN moviéndose? Porque en
un momento se termina el gel de agarosa, y si uno deja mucho tiempo al ADN en el campo eléctrico, va a moverse
y va a terminar cayéndose del gel, Así que para evitar el terror de toda persona que esta haciendo una corrida
electroforética, se agrega en cada calle un poco de Azul de Bromofenol, que es un colorante de color azul, con
carga negativa, y de muy pequeño tamaño. Por lo que siempre es el que va a ir más adelante que el ADN durante
el movimiento en la corrida electroforética. Y como es visible, uno sabe que el bromofenol es el frente de avance, y
todos los fragmentos de distinto tamaño del ADN se encuentran por detrás. Así, cuando el azul de bromofenol llegó
al otro lado del gel de agarosa, se detiene la electroforesis.
¿PARA QUE SE USA LA ELECTROFORESIS?

Cuando queremos separar moléculas de ADN, ARN o proteínas de distinto tamaño, la técnica de electrofore-
sis es la indicada para poder hacerlo. Entendiendo esto, dos moléculas distintas (dos secuencias de ADN distintas,
dos proteínas distintas en la secuencia de aminoácidos) que pesan lo mismo, no van a poder ser separadas.
¿QUE SON LOS MARCADORES DE PESO MOLECULAR?

Siempre que uno quiere saber el tamaño de los fragmentos de ADN movidos, debe tener una suerte de
regla que permita saber a cuanto corresponde el tamaño de cada banda. Para eso, en una calle (generalmente la
más a la izquierda o la más a la derecha) se siembra con un MPM o Marcador de Peso Molecular. Se trata de un kit
que se compra y que tiene fragmentos de ADN distintos y de peso conocido. El peso ya figura en el kit, de tal forma
que si figura que son 10 fragmentos de ADN separados de a 5 kDa (kiloDaltons), comenzando en 10 kDa, veremos
entonces en la calle del MPM 10 bandas, la de más abajo en 10 kDa, luego le sigue hacia arriba una que sabemos
que es de 15 kDa, y así vamos a darle un valor específico a cada banda del MPM.
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EL WESTERN BLOT
Es una técnica que me permite identificar y
determinar la presencia o ausencia de una proteína
específica en una muestra, cantidad de la proteína
producida, peso molecular de la proteína, y si hice
previamente el fraccionamiento subcelular, ubicación
de esa proteína.
Para hacer la técnica, se obtiene la muestra
en donde se quiere averiguar la presencia de una
proteína específica. Una vez obtenida, a la muestra
se las disuelve previamente en SDS (duodecil sulfato
de sodio) que garantiza que todas las proteínas van
a ser de carga negativa. Como dijimos previamente,
las proteínas pueden tener carga positiva o negati-
va. Para homogeneizar la carga, con SDS-PAGE se
garantiza que todas tengan carga negativa, todas mi-
gren hacia el ánodo.
DATO MENOR: SDS - PAGE significa Sodium duodecilsulphate in poliacrylamide gel eletrophoresis, o sea SDS en
gel de poliacrilamida (en lugar de gel de agarosa).
Una vez hecha la separación de las proteínas en el gel específico, se procede a hacer la transferencia o
blotting del material que se encuentra en el gel hacia una membrana de NItrocelulosa, que se incuba con anticuerpos
marcados con fluorescencia o radioactividad, específicos de la proteína que se quiere identificar.
DATO MENOR: Transferir significa justamente eso: pasar las proteínas separadas en la posición que están a una
membrana en donde se pueda trabajar mejor. Para hacerlo, se apoya la membrana al gel, y se hace pasar electricidad
a través de ambos, para empujar o transferir las proteínas separadas hacia la membrana de nitrocelulosa.
Una vez hecha la transferencia, se procede a observar los resultados en forma de bandas. La presencia de
la banda informa que esa proteína se encuentra en la muestra estudiada. Asimismo, si la banda es fina y con poca
intensidad, significa que hay poca cantidad de proteína. Si por el contrario, la banda es gruesa e intensa, hay mayor
cantidad de proteínas.
RECORDÁ: La banda informa presencia, y la intensidad y grosor informa mayor o menor cantidad de la proteína.
Es por eso que Western Blot permite saber expresión o no de una proteína de interés, cantidad expresada, peso
molecular de la proteína, lugar de expresión de la proteína (si se hizo un fraccionamiento subcelular previo).
¿QUE SON EL CONTROL POSITIVO Y EL CONTROL NEGATIVO?

Cuando uno hace una técnica de electroforesis, a veces quiere saber si lo que está haciendo está bien o
si hay algún error en la muestra. Por ejemplo, queremos hacer un estudio de una muestra que valore la presencia
de una proteína específica en el citosol. Para ello, en una calle se agrega una muestra conocida que contenga la
proteína que se quiere evaluar, para saber la posición en la que debería posicionarse la proteína de interés. Algo así
como n marco de referencia (en esta posición se ubica la proteína de interés).
Por su lado, un control negativo es más simple. Es una muestra conocida que no tiene a la proteína de in-
terés, por lo que al hacer la electroforesis de proteínas, no habrá imagen en la zona, y muestra como se va a ver el
gel cuando no está presente la proteína de interés.
QUE ES LA PROTEÍNA NORMALIZADORA

A veces necesitamos un marco de referencia para saber si estamos trabajando correctamente en distintas
regiones de la célula. Supongamos que queremos medir una proteína, y queremos saber si se ubica en el citosol o
en el núcleo, o si en unos momentos está en citosol y otras veces en el núcleo. Se procede a hacer un fraccionamien-
to subcelular para núcleo y para citosol. Y a cada fracción se le va a buscar la presencia de una proteína que siempre
esté en núcleo o siempre esté en citosol, para garantizar que estamos trabajando correctamente con la fracción
correspondiente. Para ello, vamos a buscar en esas fracciones a proteínas que sin importar la célula del cuerpo que
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se obtenga, siempre está presente en un lugar específico, y no se modifica su concentración con el tratamiento (son
las proteínas housekeeping, recordás?).
Si queremos saber si la muestra es de núcleo, se busca una proteína que siempre esté en el núcleo celular,
sin importar la célula. Un ejemplo es la Laminina o Lámina, filamento intermedio que forma la lámina nuclear en to-
das las células del cuerpo. Para citosol se usa la beta actina, o GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa).
Entonces, cuando querramos ver si estamos en citosol, buscaremos la presencia de estas dos últimas proteínas, y
si queremos saber si estamos en núcleo buscamos a Lámina.
LAS TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE

Se trata de un conjunto de técnicas de laboratorio que se caracterizan por cortar al ADN en un lugar bien
determinado y específico, para luego poder manipular ese ADN. Ello implica el uso de enzimas que existen en ciertos
microorganismos llamadas Enzimas de Restricción.
LA EXTRACCIÓN DEL ADN

Si uno quiere manipular y trabajar con ADN, es necesario extraerlo de los núcleos, y separarlos de los ele-
mentos citoplasmáticos. Este proceso de extracción diferencial del ADN se llama Purificación del ADN
DATO CLAVE: El ADN a estudiar puede ser ADN genómico (ADN nuclear) o ADN mitocondrial. Cada uno requerirá
pasos específicos para obtenerlo.
Actualmente existen múltiples formas de extraer el ADN, en medios salinos, en geles, con más o menos pa-
sos pero todas ellas buscan exactamente lo mismo: obtener ADN libre de proteínas. Solamente el ADN fibrilar. Esto
se debe a que el ADN superenrollado (ADN genómico como está en el núcleo casi no migra cuando se lo somete a
un campo eléctrico, como veremos más tarde que haremos cunado expliquemos la electroforesis. En cambio, los li-
neales migran bastante bien. Y cuanto más corto el fragmento de ADN, más migra. Por eso, se lo suele cortar al ADN
en fragmentos definidos por medio de enzimas endonucleasas específicas, llamadas endonucleasas de restricción
RECORDÁ: la extracción o Purificación del ADN es una técnica que obtiene solamente el ADN, sin ninguna proteína
asociada.
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

También llamadas Endonucleasas de Restricción, son un conjunto de enzimas utilizadas muy frecuentemen-
te en el laboratorio de biología molecular. Todas estas enzimas tienen una serie de características comunes:
4 Son de origen Bacteriano: esto significa que no son creadas en laboratorio, sino que existen en la naturaleza
dentro de bacterias, por lo que para su obtención se requiere trabajar con bacterias. Obviamente, se com-
pran en laboratorios.
4 Tienen actividad Endonucleasa: Las nucleasas son enzimas que cortan las uniones fosfodiéster entre los
nucleótidos del ADN, y que sea endonucleasa significa que rompe estas uniones en sectores internos de la
molécula, es decir, lejos de los extremos (las enzimas que cortan desde los extremos se llaman exonuclea-
sas). Y estas endonucleasas son capaces de romper en ambas hebras de ADN, por lo que en este caso se
consigue cortar al ADN por completo.
4 Son específicas de una secuencia: Todas las enzimas de Restricción reconocen una secuencia bien definida
de entre 6 y 10nucleótidos, y solamente cortan en ese lugar. Es decir que cada enzima de restricción tiene
una secuencia específica a la cual reconoce. Por ejemplo, hay una enzima de restricción llamada EcoRI,
descubierta en la bacteria Escherichia Coli, que reconoce la secuencia GAATTC, cortando solamente al
ADN en donde esté esa secuencia.
4 La secuencia reconocida es una Secuencia Palindrómica: A ver, un palíndromo es una palabra, numero o
frase que se lee igual hacia delante o hacia atrás. En el caso del ADN, una secuencia palindrómica es una
secuencia que se lee igual en sentido 3´-5´ en ambas hebras enfrentadas. En este caso, la enzima EcoRI
reconoce la secuencia GAATTC/CTTAAG (o sea, lee en una hebra 3´GAATTC5´, y en su enfrentada 5ĆT-
TAAG). Si se fijan en el esquema, al enfrentar estas secuencias son complementarias, y si las leo hacia 5á
cada una , ¡es la misma secuencia!
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4 Producen extremos Pegajosos: o extremos cohesivos. Cuando cortan al ADN lo hacen de tal manera que
una de las dos hebras del ADN sobresale en 4 nucleótidos, llamado Extremo Colgante. Estos extremos son
llamados también Extremos Pegajosos porque tienen una afinidad muy grande de unión con extremos si-
milares. Existen endonucleasas de restricción que cortan el ADN en forma de extremos romos, es decir en
forma recta, pero no son de interés para este tipo de mecanismo buscado. Las enzimas de interés son las
que producen extremos pegajosos.
IMPORTANCIA DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Las enzimas de restricción se usan para insertar frag-
mentos de ADN en otras moléculas de ADN, produciendo ADN
Recombinante, esto es, ADN formado por la combinación de 2
tipos de ADN distintos.
Supongamos que queremos insertar un fragmento de
ADN humano que contiene un gen en un ADN bacteriano (que
ya veremos más adelante como se hace). Lo primero que se
hace es cortar al ADN que contiene el gen con una enzima de
restricción específica, de tal forma que me genere extremos
pegajosos en el segmento de ADN cortado. Lo siguiente es
cortar al ADN bacteriano con la misma enzima, para así poder
tener los extremos pegajosos complementarios, y conseguir
que el gen humano se inserte en el ADN bacteriano. Para po-
der conseguir que se termine de pegar correctamente, se debe
agregar una enzima ligasa que una cada una de las hebras.
DATO CURIOSO: Las enzimas de restricción funcionan como una suerte de sistema inmunológico en las bacterias
que las producen, ya que son capaces de Restringir (de ahí su nombre) el crecimiento de los virus llamados
Bacteriófagos, que son virus que infectan a bacterias. Su mecanismo de acción se basa en cortar el ADN del
Bacteriófago y así eliminarlos de su interior. Hay otros mecanismos inmunológicos de las bacterias que veremos más
adelante, cuando veamos el sistema CRISPR-Cas 9.
Gracias a estas enzimas, se ha podido estudiar más en detalle al ADN y avanzar en la tipificación del Geno-
ma, ya que estas enzimas son capaces de:
4 Cortar de manera regular y constante sitios específicos del ADN
4 Al cortar al ADN, dejan un extremo pegajoso monocatenario en cada extremo, capaces de adherirse perfecta-
mente a una secuencia complementaria.
RECORDÁ: Es conveniente remarcar que si uno quiere volver a pegar estos fragmentos de ADN producidos por
enzimas de restricción, debe agregarse al medio donde se va a trabajar ATP (como fuente de energía) y una Enzima
Ligasa, que una a los extremos pegajosos con su segmento complementario. Es lo lógico, porque los extremos
pegajosos solamente van a unirse de forma complementaria al extremo pegajoso enfrentado, pero no se van a unir
las hebras de ADN sin ATP ni una ligasa que lo haga.
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Las enzimas de restricción presentan como característica la de ser MUY TERMOSENSIBLES, por lo que
pierden su actividad a las pocas horas o días si se las deja a temperatura ambiente. Asimismo, se ha demostrado
que se inactivan por completo si se las somete a una temperatura constante de 68º C durante 10 minutos. Para
evitar ello, se las mantiene conservadas en una solución de Glicerina al 50% y a -20º C. Cuando se las quiere usar
se las lleva a temperatura ambiente y se las hace actuar con el ADN. Existen miles de enzimas de restricción en la
naturaleza.
El nombre de las enzimas surge de la combinación de ciertos datos, a saber:
4 Las primeras 3 letras corresponden a la bacteria que la produce;
4 La cuarta letra corresponde a la cepa específica de la bacteria que la produce
4 El número final corresponde al orden cronológico en el que fueron descubiertas las enzimas en la misma bac-
teria.
Así, la enzima de restricción EcoRI, corresponde a:

4 Eco por Escherichia Coli
4 R por cepa RY13
4 I porque fue la primer enzima descubierta en esta cepa bacteriana.
Si bien hemos descripto a las enzimas de restricción como un gran grupo de enzimas, en verdad las enzimas
de restricción se clasifican en tres grupos:
4 Grupo 1: Son endonucleasas que cortan el ADN y además pueden metilarlo, y requieren ATP;
4 Grupo 2: Endonucleasas que cortan en una secuencia específica y no requieren ATP. Son las usadas habitual-
mente en Genética Molecular, y de hecho son las que hemos descripto;
4 Grupo 3: Cortan el ADN en las cercanías del lugar reconocido por la enzima pero poseen acción metilante y
requieren ATP.
Finalmente, las enzimas de restricción tienen una característica llamativa. Si la secuencia que reconocen
en el ADN es rara, y se encuentra pocas veces en el ADN, se producirán pocos cortes, y por ende poco fragmentos
de mucha longitud. Si, por el contrario, reconocen una secuencia que se encuentra ampliamente dentro del ADN,
cortará en muchos lugares y producirá múltiples fragmentos cortos. A partir de ello, se puede clasificar como enzimas
de Frecuencia Alta, Moderada o Baja de corte del ADN.
LOS VECTORES DE ADN

Los fragmentos de ADN obtenidos a través de las enzimas de restricción deben ser multiplicados para su
estudio y reconocimiento de la secuencia, así como también es necesario ver como se replica y como se transcribe
ese segmento de ADN dentro de un organismo vivo. Previo a la aparición de la PCR, el ADN eucarionte se insertaba
en bacterias, y se hacia proliferar a éstas para obtener múltiples copias del ADN eucarionte.
Asimismo, si queremos insertar un fragmento definido de ADN en un lugar específico del ADN de un hués-
ped, ya sea una bacteria o una célula de cultivo eucariota, es necesario usar los llamados vectores de ADN. UN
vector es todo aquello que transporta ADN para poder ser incorporado en una célula huésped, sea una bacteria o
una célula eucarionte. Los vectores más usados en Biología Molecular son los Plásmidos, Bacteriófagos, Cósmidos,
Cromosomas Artificiales de Levadura (CAL) y Cromosomas Artificiales Bacterianos (CAB).
LOS PLÁSMIDOS
Son pequeñas moléculas de ADN circular que se encuentran en forma natural dentro de las bacterias, y que
le confieren la resistencia a los antibióticos a las bacterias en donde se encuentran. Esto lo consiguen porque en su
interior hay genes que transcriben enzimas que degradan a los antibióticos. Tienen un origen de replicación, que les
sirve para replicarse dentro de la bacteria. Existen plásmidos naturales y artificiales (creados en laboratorio).
DATO CLAVE: Los plásmidos son los responsables de la resistencia a los antibióticos por parte de las bacterias, ya
que contienen genes que producen enzimas que degradan al antibiótico.
Los plásmidos no están dentro del ADN bacteriano, sino que es ADN circular que se encuentra en el interior
de algunas bacterias, pero separado del ADN bacteriano. Asimismo, replican en forma autónoma, gracias al origen
de replicación que presentan en su interior.
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Los plásmidos producidos en laboratorio son molé-

culas muy simples de ADN circular y desnudo, y están for-
mados por 4 regiones bien definidas, una de ellas dentro de
otra:
4 ORI: Un origen de replicación;
4 Gen de resistencia a un antibiótico
4 Región donde se inserta el ADN a introducir en la bac-
teria
4 Polylinker: Es una región que tiene múltiples sitios de
restricción, dispuestos en tándem. Siempre hay que
cortar con una enzima sola, y con la misma enzima
al ADN a insertar.
Si se consigue en laboratorio introducir el ADN que obtuvimos con la enzima de restricción al ADN del plás-
mido, cuando éste se introduzca en una bacteria, llevará el ADN a estudiar. Y obtendremos así una bacteria que
tiene un plásmido en su interior con una secuencia de ADN inserta en laboratorio. Y al dividirse por fisión binaria, se
generarán también copias del plásmido con el inserto de ADN.
El ingreso del plásmido a una bacteria está bien estudiado y descripto y se lo define como Transformación.
Ahora bien, para saber que bacteria ha captado un plásmido, se hace una técnica relativamente simple. El plásmido
a insertar, aparte del gen de interés, contiene un gen de resistencia a un antibiótico específico al cual la bacteria a
manipular es sensible. Una vez hecha la técnica, habrán dos poblaciones de bacterias:
4 Las que captaron por Transformación al Plásmido
4 Las que no captaron al Plásmido.
Al cultivo bacteriano se le agrega entonces el antibiótico específico, es decir, aquel cuya resistencia está
en el plásmido. Aquella bacteria que no tenga plásmido, y por ende no tenga resistencia al antibiótico, terminará
muriendo. Aquella bacteria que tenga al plásmido, y por ende la resistencia, proliferará. Y es lo que queremos, que
proliferen las bacterias que tengan el plásmido.
RECORDÁ: Un plásmido es una molécula de ADN circular que no se incorpora al ADN bacteriano, y que generalmente
tiene información para la síntesis de enzimas que dan lugar a la resistencia a los antibióticos. El mecanismo por el
cual ingresa a una bacteria se llama Transformación.
LOS FAGOS O BACTERIÓFAGOS

Como dijimos previamente, los bacteriófagos
son virus que parasitan a bacterias. Se ha demostrado
que son mejores vectores que los plásmidos. Esto se
basa en que:
El ingreso del fago a la bacteria (proceso llamado Infec-
ción) es más eficiente que la captación del plásmido por
la bacteria (Transformación), y el ADN viral se incorpora
al ADN bacteriano. A su vez, el fago es capaz de aco-
modar e insertar mayor cantidad de ADN que los plás-
midos. De esta manera, uno puede manipular un fago y
agregar mayor cantidad de ADN.
Un clásico fago usado en laboratorio es el Fago
Lambda, que puede usarse como ADN circular o lineal,
ya que existen fagos cuyo ADN tiene extremos pegajo-
sos.
RECORDÁ: Un Fago o Bacteriófago es un virus que infecta bacterias. El bacteriófago puede transportar mayor
cantidad de ADN que los plásmidos. El proceso de ingreso a la bacteria se llama Infección, y el ADN del fago se
incorpora al ADN bacteriano.
LOS CÓSMIDOS
Los cósmidos son híbridos de un plásmido y un segmento del Fago Lambda
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CAL O YAC (CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURA)
Los CAL son plásmidos de gran tamaño que pueden funcionar como un cromosoma cuando están dentro
de una levadura. Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son
importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustan-
cias. Es decir, las levaduras son HONGOS, y por ende eucariontes. Los CAL tienen 3 secuencias menores de ADN
de la levadura, a saber: un Origen de Replicación, un Centrómero y los dos telómeros fusionados, más algún gen
marcador de levadura. Los CAL son introducidos al interior de las levaduras y se comportan como un cromosoma y
se multiplican con la célula.
CAB O BAC (CROMOSOMAS ARTIFICIALES BACTERIANOS)

Es una molécula de ADN circular de gran tamaño, que permite insertar grandes cantidades de ADN en el
interior de bacterias. Si bien se llama cromosoma, no está unido a histonas por lo que no compacta, y por ende no
es un cromosoma en sí mismo.
LETRA CHICA: Cada vector es capaz de vectorizar una cantidad máxima de ADN. Los fagos pueden llevar hasta
20kb, los plásmidos hasta 40 kb, los CAL hasta 30 kb, y los más grandes son los BAC, que pueden transportar entre
300 y 1000 kb de ADN.
IMPORTANCIA DE LOS VECTORES Y LA VECTORIZACIÓN

Ya comentamos previamente que al insertar un gen en un vector, buscamos que ese segmento de ADN se
introduzca en una bacteria para poder replicar esa secuencia, y tener así múltiples copias del gen.
Otro uso muy importante que se tiene con la vectorización en bacterias, es la posibilidad de producir la pro-
teína codificada por el gen insertado. Si el ADN insertado corresponde a un gen de proteínas y se le inserta junto a su
promotor, la bacteria sintetizará esa proteína en grandes cantidades. Es una forma muy común de producir proteínas
como la insulina (para tratamiento de diabetes), el factor VIII de la coagulación (para tratamiento de Hemofilia), etc.
VECTORIZACIÓN EN CÉLULAS EUCARIONTES

Es posible también insertar ADN en el genoma nuclear de células eucariontes en cultivo. A este fenómeno
se lo conoce como Transfección, y es muy usado en el laboratorio de Biología Molecular.
RECORDÁ: Se define como Transfección a la introducción en células eucariontes de un gen de interés a través de
un vector, con el objeto de expresar el gen de interés
EL GEN REPORTER
Si uno quiere saber en que célula, tejido o tejidos se está ex-
presando una proteína, y no se tienen buenos anticuerpos para hacer
una inmunohistoquímica, se puede aplicar la técnica del gen Reporter.
Se trata de la inserción en células eucariontes de un vector con un
promotor, el codificante del gen de interés (el que se quiere averiguar),
y a lado de éste el codificante de una proteína fluorescente. La célula,
al sintetizar la proteína de interés, lo hará con la proteína fluorescente
unida (unida a la proteína por un puente llamado linker), mostrando
una fluorescencia en el lugar donde se ubica la proteína de interés. Las
imágenes se obtienen por medio de un microscopio de fluorescencia.
DATO CURIOSO: La proteína fluorescente es una proteína natural presente en muchas medusas. La más usada se
llama GFP (Green Fluorescent Protein) o Proteína Fluorescente Verde obtenida de la medusa Aequorea victoria. Lo
interesante de GFP, como cualquier proteína fluorescente, es que es inocua en la célula que se inserta, por lo que es
muy útil para mostrar ubicaciones de proteínas, sin que interfiera o afecte el normal funcionamiento celular.
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LOS ANIMALES TRANSGÉNICOS

Los animales transgénicos son animales modificados genéticamente,es decir, presentan un gen modificado
o agregado, y que son capaces de reproducirse transfiriendo a la descendencia el gen manipulado.
Para hacer un animal transgénico, una de las técnicas más usadas es la de tomar células pluripotenciales de
blastocisto del animal (por ejemplo ratón), y le hago alguna técnica de ADN recombinante que permita insertar en 1
cromosoma al gen de interés, o modificar la expresión de un gen en esa célula. Ya te voy a contar como hacer esto.
Por lo pronto, veamos donde estamos parados:
4 Tenemos una célula pluripotente (célula de blastocisto) obtenida y modificada en su ADN;
4 Estas células son diploides, por lo que tienen 2 juegos de cromosomas;
4 En esta técnica, vamos a modificar solamente uno, para que la célula sea heterocigota, es decir, que va a tener
uno solo de los dos cromosomas del par modificado.
Una vez manipulada la célula pluripotencial en laboratorio, se vuelve a introducirla en el blastocisto, y se

implanta el embrión para su desarrollo intrauterino. Y acá viene la parte importante. Si la célula insertada dará lugar a
una población de células germinativas en el ratón desarrollado, va a transmitir el gen manipulado a su descendencia,
y a este animal se lo llama Animal Transgénico.
DATO CLAVE: Recordá que cuando se manipula la célula pluripotencial, está en estadio de blastocisto, y todavía no
hay diferenciación en células somáticas y germinativas.
TÉCNICAS PARA AFECTAR LA EXPRESIÓN DE UN GEN

Una vez comprendidas las técnicas de ADN Recombinante (que vimos las clásicas, pero hay un pool mucho
mayor de técnicas), es posible afectar la expresión de un gen, y estudiar los resultados a partir de lo efectuado ini-
cialmente. Podemos entonces aumentar la expresión de un gen, disminuir la expresión de un gen, e incluso se puede
anular por completo la expresión génica.
Si se quiere aumentar la expresión de un gen de interés, se procede a insertar un Promotor de Alta Expre-
sión con el gen inserto de interés. De esta manera, la expresión será mayor.
Los promotores pueden ser de alta, media o baja expresión. Se tratan de promotores presentes en nuestros
genes, y que al estudiarlos, se ve que tienen alta, moderada o baja afinidad por los factores de Transcripción Basales
y a la ARN Polimerasa. Dependiendo de la afinidad, la expresión. Obviamente, a mayor afinidad por los factores de
transcripción basales y por la enzima, mayor la expresión de ese gen.
Si por el contrario queremos disminuir la expresión de un gen, se procede a insertar un promotor con un ARN
de interferencia que afecte la expresión de un gen que se quiere estudiar. A este proceso se lo llamada knockdown
génico, y no debe confundirse con el knockout génico que veremos más adelante.
DATO CLAVE: El knockdown génico es la manipulación de la expresión génica donde se disminuye la producción del
producto génico (pudiendo llegar a niveles muy bajos) por medio de la inserción en una célula de un promotor con un
ARN de Interferencia. El knockout génico es la anulación completa de un gen por medio de la manipulación del ADN.
LA TÉCNICA DE CRISPR–CAS9
QUE ES LA TÉCNICA DE CRISPR-CAS 9?
Esta técnica revolucionaria de CRISPR-CAS9, también llamada Técnica de Edición Génica (y muchas veces
son sinónimos), es una técnica que permite corregir una secuencia corta de ADN (17 a 20 nucleótidos), ya sea por
medio del agregado o remoción de un fragmento. Y este corte del ADN es muy preciso.
Dicho de otra manera: es una técnica que permite cortar con altísima precisión al ADN, remover un fragmen-
to muy preciso, y agregar una secuencia correcta de ADN. O sea, editar la secuencia de nucleótidos para corregir
una secuencia errónea.
Tanto CRISPR como CAS son siglas. CRISPR significa Clustered Regularly Interspaced Palindromic Re-
peats (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente interespaciadas), y CAS significa CRISPR
Associated System (Sistema Asociado a CRISPR).
Vayamos por partes. Realmente es muy simple, pero debemos entender de donde viene todo para poder en-
tender. La realidad es que la parte de funcionamiento normal bacteriano no debés saberlo, pero sirve para entender
el proceso.
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La técnica CRISPR está basada en un sistema natural usado por las bacterias para protegerse de infec-
ciones por bacteriófagos. Las bacterias tienen un sistema inmunológico muy particular para las infecciones virales,
porque existen virus que infectan bacterias (son los llamados Bacteriófagos o Fagos). Estos virus son muy simples,
tienen una molécula de ADN rodeada por una cubierta proteica llamada cápside (o sea que están formados solo por
proteínas específicas y ADN, nada más). Las bacterias, como cualquier ser biótico, busca defenderse frente a una
infección. Y acá comienza CRISPR-CAS 9.
DATO CLAVE: La técnica del CRISPR CAS-9 se basa en la imitación del sistema inmunológico bacteriano.
Todo esto permitió en el año 2015 crear un sistema por medio del cual se pueda cortar el ADN en lugares
específicos por medio de un sistema que contenga un fragmento de ARN creado en laboratorio y capaz de unirse
complementariamente a una secuencia de ADN (fijate, es ARN que se va a unir a una secuencia de ADN), y una
enzima que reconozca al ARN hibridado (unido) y que pueda cortar en la zona de unión, y el corte lo va a hacer en
la doble hebra. Y eso es el principio de la técnica de CRISPR - CAS9.
Esta técnica usa una serie de elementos que van a permitir cortar al ADN en la doble hebra, o sea que corta
a la molécula de ADN por completo. Para ello usa:
4 ARN Guía o sgRNA: Es un ARN específico, crea-
do en laboratorio, de secuencia conocida, y que
es complementaria a la secuencia de ADN que
queremos “editar”. Su largo es de 18 a 20 nu-
cleótidos
4 Enzima CAS 9: esta enzima se encuentra inac-
tiva, y solamente se activa al unirse a un ARN
específico llamado ARN Guía o sgRNA
4 Protospacer o Espaciador: Segmento de ADN
que se quiere agregar al ADN a editar. Esto se
puede agregar o no, dependiendo de lo que se
quiera obtener.
DATO CLAVE: NO puede cortar en cualquier lado, sino que lo debe hacer previo a una secuencia llamada Secuencia
PAM, que es la secuencia NGG o NAG, o sea, una secuencia de: Cualquier nucleótido (N), Guanina (G), Guanina
(G), o Cualquier nucleótido (N), Adenina (A), Guanina (G). La secuencia PAM debe estar fuera de la secuencia
complementaria al ARN Guía. O sea, debe estar primero la secuencia complementaria y a continuación la secuencia
PAM.
El funcionamiento es simple. El complejo CAS 9 – ARN Guía va a reconocer la secuencia PAM. CAS-9 se-
para las hebras de ADN a editar, y se procede a hibridar el ARN Guía con una de las hebras separadas (la hebra a la
que es complementaria), y si hay hibridación entre el ARN Guía y el ADN a editar, la enzima produce un corte en el
ADN en ambas hebras en un sitio específico, dando lugar a un corte en ambas hebras que genera extremos romos.
Y cuando se produce un corte en el ADN de ambas hebras, la célula busca arreglar el ADN lesionado por medio de
la Reparación de Extremos No Homólogos, o por medio de la recombinación homóloga. Ya veremos que la elección
de uno u otro mecanismo no es al azar.
Ahora bien, fíjense que lo que se hizo fue marcar al ADN en un punto específico, hacer un corte preciso en
el ADN marcado, y ver como responden los mecanismos de arreglo de la doble hebra. Y acá el investigador puede
decidir hacer dos cosas:
4 Agregar solamente el ARN guía y la enzima CAS9: En este caso, el corte del ADN será reparado por el
sistema de reparación de extremos no homólogos: Recordemos que este mecanismo arregla la doble hebra
cortada, pero pierde siempre fragmentos del ADN, conocidos como “indels”. Esta pérdida del ADN puede
afectar, si se busca donde cortar, la expresión de un gen, y silenciarlo.
4 Agregar ARN guía, la enzima CAS9 y el Protospacer de ADN: En este caso, la célula va a usar el protospa-
cer como fragmento de ADN homólogo a lo que se cortó, y va a reparar por Recombinación Homóloga. La
clave acá está en ver qué es lo que se le quiere agregar como Protospacer. Se puede agregar un fragmento
de ADN sano para reemplazar un ADN dañado, o se puede insertar un gen nuevo para que sea expresado
por la célula.
Como vemos, la consecuencia, dependiendo de lo que se quiera conseguir, es la generación de dos pobla-
ciones de células:
4 Una célula con ADN editado: se removió un fragmento y se insertó uno nuevo cuando se repara por recom-
binación homóloga
4 Una célula que perdió ADN: cuando se repara por unión de extremos no homólogos. Y si se produce dentro
de un gen, apagando a ese gen porque la el cambio o mutación no produce ninguna proteína. Se puede
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hacer tanto en el promotor (se lo cambia para que no se una la ARN polimerasa) o en el codificante (creando
una mutación que produzca una proteína ausente, ya sea porque no se produce directamente, o se produce
tan mal que es eliminada constantemente en proteasomas).
DATO MENOR: Debido a las restricciones internacionales que existen para el uso de la técnica de CRISPR-Cas9
como modelo de edición genética, se ha desarrollado la técnica del CRISPR-Cas13, que es un sistema que actúa
directamente en el ARNm. Así, el ADN no se toca (y se mantiene dañado), el ARNm se transcribe y se procesa
dañado, pero previo a la traducción se edita al ARNm, dejándolo sano.
¿QUE SON LOS RATONES KNOCK OUT Y RATONES KNOCK IN?

Un ratón knock out es un ratón creado en laboratorio al que selectivamente se le eliminó uno o varios ge-
nes, para conocer, por ejemplo, como funciona ese ratón en ausencia de esa o esas proteínas de forma selectiva.
Para crearlo, se trabaja con un vector de ADN (aquel que va a introducir el ADN nuevo que contenga un promotor
defectuoso o no funcional), y luego se lo introduce en células madre embrionarias. Como vimos previamente, se
pueden crear con la técnica de CRISPR CAS-9 que busque arreglar al ADN por medio de la reparación de extremos
no homólogos.
Por su lado, un ratón knock in es lo opuesto al ratón knock out. En este caso, se agrega un gen de interés
modificado. Para ello, se agrega a la técnica de CRISPR - CAS9 el Protospacer de ADN y que se repare por recombi-
nación homóloga. Para ver si fue insertado correctamente se le puede agregar GFP (Green Fluorescent Protein), que
se va a sintetizar a la par de la proteína agregada. Así que toda vez que se sintetice la proteína de interés, también
se sintetizará la proteína fluorescente, y podrá verse al microscopio óptico. Esto es útil para saber en que tejidos se
sintetiza una proteína específica, y si la modificación por agregado de ADN fue correcta.
SOUTHERN BLOT (LA TRANSFERENCIA SOUTHERN)

La técnica de Southern Blot, creada por E. Southern, permite establecer rápidamente la presencia o la au-
sencia de una secuencia determinada en un organismo. Es la técnica standard para analizar la estructura del ADN
partido por enzimas de restricción. Esta técnica usa unas moléculas especiales llamadas Sondas de ADN, que des-
cribimos a continuación.
LAS SONDAS DE ADN

El ADN, en condiciones fisiológicas, tiende a aparearse con la hebra complementaria para formar la doble
hélice. Asimismo, tanto el ADN como el ARN muestran la propiedad de HIBRIDAR, es decir, la capacidad de una
hebra de unirse a una hebra perfectamente opuesta y complementaria.
Gracias a esta propiedad de hibridar, se pudo trabajar con sondas de ADN, que son hebras de ADN conocido
y que corresponde a una secuencia complementaria de lo que se quiere estudiar. A las sondas de ADN se las llama
también ADNc, y debe cumplir con los siguientes criterios:
4 Debe ser una cadena simple conocida, es decir, que se conozca toda la secuencia de nucleótidos;
4 Debe ser complementaria a una secuencia de ADN que se quiere estudiar;
4 Debe estar marcada, ya sea con sustancias radioactivas o sustancias fluorescentes que permita, por medio del
uso de un traductor específico, conocer la ubicación en donde se hibridó el ADNc.
RECORDÁ: Una sonda es una secuencia de ADN marcada, conocida y complementaria a la secuencia de ADN que
se quiere identificar. También se la llama ADNc
Esto es muy importante porque esta sonda de ADN solamente se unirá a una secuencia bien conocida de
ADN, a la cual es complementaria. Hoy en día, el ADN se marca con sustancias fluorescentes por los beneficios que
tiene respecto de la radioactividad.
Las sondas son muy útiles para el diagnóstico, ya sea para ver si tiene una secuencia específica en el gen
(es decir, se puede tener una sonda de ADN de una secuencia sana o de una secuencia “enferma”), o para ver el
parentesco.
Para reconocer a la hibridación de la sonda de ADNc con su complementario a estudiar, es necesario hacer
la Técnica de Southern Blot.
DATO CLAVE: Se puede hacer una sonda con ARNm conocido y que también ha sido marcado o trazado con
sustancias radioactivas o fluorescentes.
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PASOS DE LA TÉCNICA DE SOUTHERN BLOT
La técnica de Southern usa a la electroforesis para separar los fragmentos de ADN cortados por enzimas de
restricción, y señala el fragmento buscado con el uso de sondas. Los pasos son:
1. Los fragmentos de ADN cortados por medio de enzimas de restricción se corren electroforéticamente en un
gel de agarosa. Ya hemos visto que en este medio, los fragmentos tienen una velocidad inversamente
proporcional a su peso molecular o tamaño. De esta manera, hay una mayor separación de los fragmentos
de ADN.
2. Sobre esta corrida electroforética que tiene los
fragmentos bien separados dentro del gel
de agarosa, se coloca una membrana de
Nitrocelulosa que cubre el gel. Y por medio de
un electricidad (se hace correr la electricidad de
tal forma que atraviese el gel y la membrana),
una gran cantidad de fragmentos de ADN se
transfieren a la membrana y quedan pegados
a ella (dejan una impronta o BLOTTING en la
membrana de nitrocelulosa). De acá viene el
nombre de Blot de la técnica
3. Se somete a la membrana de nitrocelulosa
a temperatura, calentando suavemente la
membrana. De esta manera, se separan la
doble cadenas de ADN de cada fragmento.
Recordemos que el calor desnaturaliza al ADN, y de eta manera podemos separar las hebras
4. Se agrega la a sonda de ADN. Si existe complementariedad entre la sonda y su cadena complementaria, va a
haber hibridación.
5. Se lava la membrana para retirar los restos de ADN que no se han hibridado.
6. Se lee con traductores la existencia o no de señal (radioactividad o fluorescencia).
DATO MENOR: Las sondas suelen estar marcadas con P32 (fósforo radioactivo) en 5´ El traductor de señal es en
este caso la radioautografía
Asimismo, y luego de haber visto el comportamiento del ADN con esta técnica de Southern Blot, es posible
hacerlo en el ARN (el ARNm se hibrida con el ADNc). Esta técnica se llama Northern Blot. Por último, es posible
también hacerlo con proteínas, y se llama Western Blot.
DATO CLAVE: El Southern Blot permite identificar por medio de ADNc una secuencia específica de ADN; El Northern
Blot lo permite hacer al ARNm; el Western Blot permite identificar proteínas. Los pasos son los mismos, pero veremos
que en cada caso, la molécula que se usa para evidenciar lo que se movió, cambia en cada técnica.
SECUENCIACIÓN DEL ADN

Secuenciar al ADN significa saber cuál es la secuencia
exacta de nucleótidos del mismo. Esto se puede hacer por métodos
manuales o dispositivos automáticos. Estas secuencias se envían a
bancos de datos de secuencias de ADN, para poder ser compartidas
entre los distintos profesionales e investigadores del mundo.
El método más utilizado es el método de didesoxinucleóti-
dos (ddNTP) de secuenciación del ADN o también llamado método
de Sanger.
Los didesoxinucleótidos de ADN son parecidos química-
mente a los desoxinucleótidos normales, pero fueron modificados
en laboratorio: han perdido el grupo hidroxilo del carbono 3. La falta
de dicho grupo hidroxilo hace que sea imposible la formación de un
enlace fosfodiéster con el siguiente desoxinucleótido.
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DATO CLAVE: Los Didesoxinucleótidos o ddNTP son nucleótidos modificados sin el hidroxilo del carbono 3, por lo
que no pueden unirse a otro nucleótido.
De esta manera, si se incluye un ddNTP durante la replicación del ADN, una vez insertado no se podrán
agregar los siguientes desoxinucleótidos a la cadena. En esta técnica se usan los 4 ddNTP diferentes, uno por cada
base, es decir de Adenina, de Guanina, de Citosina y de Timina.
PASOS DE LA TÉCNICA
Supongamos que queremos conocer la secuencia de ADN de una mutación nueva de un gen. Los primero
es cortar el ADN con enzimas de restricción para tener el fragmento de ADN a tipificar. Luego vamos a desnaturalizar
el ADN a secuenciar, para quedarnos con una hebra (ADN monocatenario) Y vamos a tomar 4 muestras de esos
fragmentos, es decir, vamos a poner el ADN monocatenario a tipificar en 4 tubos distintos. Entonces, los pasos desde
el principio son:
1. Obtención del ADN a estudiar
2. Corte por medio de enzimas de restricción
3. Desnaturalización y separado de las hebras
para obtener ADN monocatenario
4. Separación del ADN monocatenario en 4 tubos
con tapa distintos
Ya tenemos múltiples copias del ADN monoca-

tenario a secuenciar en los 4 tubos. Ahora lo que vamos
a querer hacer es sintetizar ADN in vitro. Es decir, vamos
a buscar sintetizar la hebra complementaria al ADN mo-
nocatenario que tenemos en los tubos.
Para ello, vamos a agregar a cada tubo:
4 Primers o cebadores de ADN marcados: son los
primers los que tienen la marca que nos va a permitir después ver los resultados de la secuenciación
4 Enzima ADN polimerasa
4 Los 4 desoxinucleótidos en grandes cantidades en cada tubo
4 1 didesoxinucleótido distinto en cada frasco en bajas cantidades: Acá está la clave de todo. A cada tubo le
agregamos los 4 desoxinucleótidos, pero en cada tubo vamos a agregar 1 didesoxinucleótido distinto.
Ahora, finalmente, vamos a tener 4 tubos distintos, porque cada uno va a tener un didesoxinucleótido dis-
tinto. Y entonces se deja que actúe la ADN polimerasa. Y como pusimos altas cantidades de desoxinucleótidos y
baja cantidad de un didesoxinucleótido, la ADN polimerasa va a ir sintetizando en cada tubo. Y en la síntesis, de vez
en cuando va a agregar un didesoxinucleótido en la secuencia. Recordemos que estos nucleótidos modificados no
pueden polimerizar, así que cuando se agrega, se termina de sintetizar esa hebra. Al final de todo, vamos a tener en
cada frasco, segmentos de ADN de distinto tamaño, y en cada frasco siempre terminado en el mismo didesoxinu-
cleótido.
Antes de continuar, vamos a explicarlo con un ejemplo de una secuencia simple, a fin de poder entender que
es lo que tenemos en cada tubo. Supongamos que queremos secuenciar un ADN que tiene esta secuencia desco-
nocida:
3´-ATTCAGGATCCATG-5´
Escribo la secuencia de una hebra solamente, porque recordemos que debemos meter en cada tubo, ADN
monocatenario. Entonces, voy a tener en 4 tubos distintos, múltiples copias de esa secuencia en cada uno. Le agre-
gamos a cada tubo el primer o cebador marcado, la ADN polimerasa, grandes cantidades de desoxinucleótidos, y
luego a cada tubo le agrego un solo didesoxinucleótido en bajas cantidades. Y dejo que actúe la ADN polimerasa.
Recordemos que cada vez que se agregue el ddNTP a la secuencia, no se puede seguir polimerizando. Y créanme,
como hay poca cantidad de ddNTP en cada frasco, se generan en cada uno fragmentos de ADN de distinta longitud,
todos terminados en el mismo ddNTP. Analicemos los fragmentos que se formaron en el tubo que contiene el ddNTP
de Adenina. Este nucleótido, recordemos, se hibrida con Timina. De esta manera, van a crearse fragmentos de ADN
tal cual se muestran en el gráfico. Y fíjense que los fragmentos tienen longitudes distintas. Bueno, esto va a darse en
cada uno de los tubos con el ddNTP correspondiente.
Finalmente, los fragmentos de ADN creados en cada tubo se separan por electroforesis de poliacrilamida. Es
decir, se crean 4 calles en un gel de poliacrilamida, y cada tubo va a ser agregado a una calle distinta. Y finalmente
19
se separan los fragmentos de ADN por medio de electroforesis. Y luego se va leyendo la secuencia, de abajo hacia
arriba (recordemos que abajo están los fragmentos más pequeños de ADN en una electroforesis), buscando la se-
cuencia en las 4 calles, tal cual lo muestra el gráfico.
DATO MENOR: Una vez escrita la secuencia, debemos escribir la complementaria, porque la secuencia creada en la
electroforesis corresponde a la complementaria sintetizada in vitro, y nosotros queremos saber la secuencia original.
Existen varias formas hoy en día de poder leer los resultados. Se pueden usar cebadores marcados con
radioactividad, o bien ddNTP marcados con fluorescencia. Y cada ddNTP con un color fluorescente distinto. Un sof-
tware va leyendo la secuencia de colores, y “escribe la secuencia”. Este último es más rápido que el convencional.
MICROARRAY O MICROMATRICES
También llamado CHIP de ADN. Se trata de otra técnica que
también permite identificar secuencias específicas de ADN. Para
ello, se van a usar múltiples oligonucleótidos monocatenarios de
secuencia conocida, marcados con fluorescencia. O sea, pequeños
fragmentos de 8 a 20 nucleótidos de secuencia conocida de ADN
monocatenario, y marcados con colorantes fluorescentes distintos.
Estos oligonucleótidos son “sembrados” o colocados en una placa
de vidrio o silicio en forma puntual, o sea se coloca en un punto, y
cada punto está formado por un único oligonucleótido, identificado
según el color fluorescente y la secuencia que tiene. Y luego se
agrega el ADN del individuo a estudiar.
Son usados para identificar mutaciones del tipos SNP (po-
limorfismo de un solo nucleótido) y para la expresión diferencial de
genes. En este caso, lo que se hace es obtener los ARNm del tejido
a estudiar, se hace retrotranscripción para obtener ADN a partir de
ellos, y luego se siembran en micromatrices que contengan oligonu-
cleótidos marcados para identificar ADN provenientes de todos los
ARNm descriptos al día de hoy. Donde de positiva la hibridación,
significará que ese gen está activo en el tejido estudiado.
DOT BLOT
Se trata de una técnica que seria la versión simplificada del Southern Blot. En este caso, es una forma de
identificar secuencias específicas de ADN, sin la necesidad de tener que cortar al ADN con enzimas de restricción.
Es ideal para la identificación de genes.
La técnica, como les dije, es simple. Se procede a amplificar el ADN que se quiere estudiar. Luego se lo
coloca en una membrana específica de nitrocelulosa, y se le agregan oligonucleótidos marcados y específicos del
alelo que quiere identificarse. El resultado será positivo o negativo
DATO MENOR: Si bien no hace al fundamento de la técnica en si, es necesario saber que toda vez que usemos
oligonucleótidos monocatenarios para identificar secuencias específicas de ADN, al ADN a estudiar se lo debe
desnaturalizar, es decir, se le debe separar las dos hebras. Se puede hacer por medio de métodos físicos como el
calor a 95ºC (método más frecuente) o por medios químicos.
TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN DEL ADN

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
A mediados de los ´80, Kary Mullis describe una técnica que permite copiar millones de veces una secuen-
cia específica de ADN en un tubo de ensayo por medio de una técnica extraordinariamente simple a la cual llamó
Polymerase Chain Reaction (PCR). Esta técnica permite inclusive repetir millones de veces secuencias que están
en muy pocas moléculas e incluso en una sola. Obviamente, ganó el Nobel de Química por su invento (1993).
20
DATO CLAVE: La PCR es una reacción enzimática de síntesis de ADN in vitro, es decir en laboratorio, y que permite
multiplicar un segmento de ADN, aún si se tratase de una sola molécula.
La simpleza de la técnica se basa en tres pilares: el mecanismo usual de la replicación del ADN, en sus
propiedades de hibridación y en la presencia de enzimas de la síntesis de ADN, las polimerasas. La PCR (o RCP en
español) requiere de varios componentes:
1. Termociclador: Aparato que permite generar los cambios abruptos de temperatura
2. Dos Cebadores o Primers distintos (llamados forward o sentido, y reverse o reward o antisentido), formados
por 15 a 25 nucleótidos de ADN, sintetizados en laboratorio. O sea que son de una secuencia específica y
conocida. Y son llamados Oligonucleótidos, justamente porque son segmentos cortos de nucleótidos. Estos
cebadores corresponden a las secuencias adyacentes a la secuencia que se quiere multiplicar. Cada uno
corresponde al extremo de una de las dos hebras de ADN. Es fundamental conocer la secuencia que está
adyacente al segmento a clonar y que es complementario al primer, pues sino no se puede hacer la PCR. Y
la cantidad de GC no debe ser mayor al 55% del oligonucleótido.
3. ADN Polimerasa termorresistente
4. Desoxinucleótidos en gran cantidad
5. ADN genómico de un individuo (el que se quiere multiplicar)
6. Ion magnesio (Mg+)
7. Solución amortiguadora
8. Agua
DATO CLAVE: la especificidad de la técnica lo hacen los cebadores sintéticos de secuencia conocida. Porque se
va a multiplicar el segmento de ADN que esté comprendido entre los dos. Y si por algún motivo no pueden unirse a
una secuencia complementaria, no se producirá la amplificación del ADN que se quiere multiplicar. Estos cebadores
deben ser de 15 a 25 nucleótidos de longitud, y la cantidad de GC no debe ser mayor al 55% del oligonucleótido.
Con esta técnica podemos hacer múltiples copias de un segmento definido de ADN, y el conjunto de copias
hechas se la llama Amplicón. El amplicón es el conjunto de copias idénticas de ADN producidas por medio de la
Reacción en Cadena de la Polimerasa.
DATO CURIOSO: La ADN Polimerasa termorresistente es una enzima que actúa (a diferencia del resto de las enzimas)
a muy altas temperaturas. Lo normal es que a altas temperaturas, las enzimas convencionales se desnaturalizan,
pero en este caso funcionan mejor. Estas enzimas se obtienen de bacterias extremófilas, llamadas así porque viven
en lugares extremos, como por ejemplo en los géiseres. Tal el caso de la bacteria Thermus aquaticus, cuya enzima
se llama Taq polimerasa.
PASOS DE LA TÉCNICA
Esta técnica permite duplicar el contenido de las molécu-
las de ADN que hay en el interior. Para hacerlo se repiten ciclos
de duplicación. Cada ciclo consta de 3 pasos:
4 Desnaturalización o Melting: Se calienta el ADN del in-
dividuo a altas temperaturas, 95º C. De esta manera se
desnaturaliza el ADN y se separan las hebras, quedando
así las dos cadenas simples.
4 Hibridación o Annealing: Se agregan los primers y se
produce un descenso de la temperatura a 40 – 68º C. A
esta temperatura, se hibridan los primers con la cadena
complementaria.
4 Elongación: Ascenso de la temperatura a 70-75º C. A esta
temperatura, y en presencia de una gran cantidad de
desoxinucleótidos, la ADN polimerasa sintetiza una nue-
va cadena de ADN que se extiende a partir del cebador
Una vez formado las nuevas cadenas dobles de ADN, la probeta se vuelve a calentar a 95º C, produciéndose
una nueva desnaturalización, comenzando así un nuevo ciclo de calentamiento (95º C), enfriamiento (35-65º C) y ex-
tensión de la cadena por calentamiento a temperatura intermedia (70-75º C). Así en cada ciclo, el número de copias
se duplica en forma exponencial en cada ciclo (si arrancamos con 1 molécula de ADN tendremos 2, al duplicar las 2
tendremos 4, luego 8, luego 16, luego 32, etc.). Cada ciclo se repite entre 20 a 30 veces.
21
DATO CHICO: A los 25 ciclos de amplificación, se considera que hay 10⁵ moléculas de ADN amplificadas.
CARACTERÍSTICAS DE LA PCR
4 Es una técnica muy simple
4 Permite hacer millones de copias de un segmento específico de ADN
4 El ciclo consta de tres pasos: Desnaturalización del ADN a altas temperaturas (95º C), hibridación de los ce-
badores a bajas temperaturas (35-65º C) y extensión de los cebadores a temperatura intermedia (75º C)
4 El número de moléculas de ADN se duplica en proporciones geométricas.
DATO MENOR: Hay distintos tipos de enzimas ADN polimerasas termorresistentes. La diferencia se basa en la
fidelidad con la que copian a la hebra complementaria. La Taq Polimerasa es la más frecuentemente usada, pero
su fidelidad no es alta, por no tener actividad lectura de prueba o doble lectura (proofreading). Obviamente, cuanto
menor la cantidad de errores en la secuencia, más cara la enzima.
USOS DE LA PCR
La PCR se puede usar para amplificar pequeñas cantidades de ADN que se quiere estudiar, por ejemplo el
ADN viral. Trabajar con virus ADN no siempre es fácil, y muchas veces las cantidad de ADN viral es insuficiente como
para investigar, por lo que se requiere el uso de esta técnica.
También es un excelente método de diagnóstico de infecciones por microorganismos que poseen ADN en
su genoma (ya veremos como actuar cuando los microorganismos tienen ARN en su genoma). En este caso, si se
conoce el ADN a estudiar, se crean cebadores sintéticos que flanqueen regiones de ADN bacteriano o viral, y si hay
amplificación en los ciclos, significa que hay ADN viral o bacteriano.
RECORDÁ: La especificidad de la amplificación lo dan los cebadores, porque son los que flanquean el segmento de
ADN a amplificar. Si queremos investigar si hay ADN bacteriano en una muestra, se crean cebadores sintéticos para
amplificar ese ADN cuestionado. Si hay amplificación, significa que está ese ADN.
PCR CON RETROTRANSCRIPTASA (RT-PCR)

La RT-PCR es una técnica que permite amplificar un seg-
mento de ADN que provino de la retrotranscripción de ARN. Para
poder entender esta técnica tenemos que tener en claro la retrotrans-
cripción.
La retrotranscripción es la producción de ADN usando como
molde al ARN. Este pasaje se hace por medio de una enzima llamada
retrotranscriptasa o transcriptasa reversa (o antiguamente transcrip-
tasa inversa). Esta enzima es capaz de leer un ARN, y crear la hebra
complementaria en ADN, llamada ADNc o ADN complementario. A
partir de esta hebra monocatenaria de ADN (llamado, repito, ADNc),
al crearse su complementaria, se obtiene la molécula bicatenaria de
ADN que provino de un ARN. Y luego, ya con el ADN sintetizado, se
puede amplificar vía PCR.
RECORDÁ: La RT-PCR permite amplificar ADN que proviene de un

ARN luego de una retrotranscripción vía transcriptasa reversa.
Esta técnica es muy usada cuando se quiere averiguar si un

paciente presenta una infección viral con virus ARN, es decir virus que
presentan ARN en su genoma, como es el caso del virus COVID-19,
ya que se trata de un virus que tiene en su genoma un ARNm. Lo
primero que se hace es una obtención de muestra y obtención de
ARN viral, y luego una retrotranscripción del ARN VIRAL para pa-
sarlo a ADN. Ya obtenido el ADN, se procede a hacer una PCR para
amplificar el ADN proveniente del ARN viral por retrotranscripción. Si
amplifica, significa que estaba infectado el paciente cuestionado.
22
PCR EN TIEMPO REAL (qPCR)

Este tipo de PCR permite cuantificar en tiempo real
la cantidad de ADN amplificado por ciclo durante la técnica, y
por ende la cantidad inicial con la que se arrancó. La q provie-
ne de quantitative, justamente porque es un método cuanti-
tativo. La forma de cuantificar es a través de fluorescencia y
la intensidad para cuantificar, basándose en la premisa que a
mayor cantidad de moléculas fluorescentes, mayor la inten-
sidad, y esa cantidad puede calcularse por medio de equipos
especiales. La forma de detección más habitualmente usada
es el uso de fluoróforos, como el SYBR Green, que se une
al surco menor del ADN bicatenario. Antiguamente se usaba
bromuro de etidio, pero cada vez es menor su uso, por sus
propiedades carcinogénicas descubiertas.
La qPCR es muy usada en conjunción con la RT
PCR. Y a esta técnica se la llama RT-qPCR. Esta técnica
permite calcular la concentración inicial de un ARN específi-
co (generalmente se usa para valorar concentraciones inicia-
les de ARNm).
Durante la fase inicial, entre los primeros 10-15 ciclos, la fluorescencia es insuficiente y no genera una res-
puesta visible. Sin embargo, como se muestra en la Figura 4, esta fase sirve para delimitar la línea base (ver más
adelante). En la fase geométrica, los reactivos de la reacción se encuentran de forma abundante por lo que la ampli-
ficación por la PCR tiene una eficiencia cercana al 100%. En esta fase de la cinética de amplificación, a partir de cada
molécula del ADN se generan dos, por lo que el producto de la PCR se duplica después de cada uno de los ciclos.
La fase lineal comprende el momento en que los reactivos empiezan a ser limitantes en la reacción y se presenta un
decaimiento de la actividad enzimática. La eficiencia de la amplificación es inconstante durante esta fase. Por último,
la fase estacionaria muestra una señal saturada. La amplificación se detiene debido a que los componentes de la
reacción se agotaron.
CICLO UMBRAL, CYCLE THRESHOLD O CT VALUE

Un valor que se mide en la PCR en tiempo real es el ciclo Umbral, Cycle Threshold o CT value. Se define
como el número de ciclos necesarios para que la señal fluorescente cruce el umbral (es decir, excede el nivel de
fondo). Dicho de otra manera, es el número de ciclos necesarios para obtener una fluorescencia significativa equi-
valente al numero de copias amplificadas. Los niveles de CT son inversamente proporcionales a la cantidad de ADN
amplificado en la muestra (es decir, cuanto menor es el nivel de CT, mayor es la cantidad de ADN amplificado en
la muestra). Los ensayos en tiempo real se someten a 40 ciclos de amplificación. Los resultados a obtener son los
siguientes:
4 Una CT <29: son reacciones positivas fuertes indicativas de abundante ADN en la muestra;
4 CT entre 30-37: son reacciones positivas indicativas de cantidades moderadas de ADN en la muestra
4 CT de 38-40: son reacciones débiles indicativas de cantidades mínimas de ADN en la muestra, que podrían
representar un estado de infección o contaminación ambiental
PCR ALELO ESPECIFICA

Como vimos previamente, la especificidad en la amplificación de un segmento definido de ADN se basa en
la especificidad de los primers o cebadores sintéticos que flanquean al segmento a multiplicar. Estos primers son los
que señalan exactamente el segmento a amplificar.
Cuando se quiere estudiar una mutación en una familia, es posible diseñar cebadores alelo-específicos (con
un cambio de una base, correspondiente a la mutación), para que únicamente se unan, y consecuentemente sean
amplificados aquellos alelos que presenten una determinada mutación en su secuencia. Es decir, la mutación estaría
en el segmento del ADN donde se une el cebador. De esta manera, solamente se va a amplificar el ADN mutado, y
no va a amplificar el ADN sano, por lo que constituye un excelente método de diagnóstico de una mutación especí-
fica del ADN. Asimismo, puede identificar si la persona estudiada es heterocigota u homocigota para la mutación,
porque arrancaría la amplificación con solo un alelo mutado (si es heterocigota) o con ambos alelos mutados (si es
homocigota).
23
PCR RFLP
Es u tipo de PCR que reconoce mutaciones en sitios de restricción o RFLP. Recordemos que un sitio de
restricción es una secuencia palindrómica reconocida por una enzima de restricción.
Primero se amplifica el ADN a estudiar por medio de una PCR, y luego se somete el ADN amplificado a una
digestión enzimática con la enzima de restricción que reconoce el sitio de restricción. Si no hay daño en la secuencia,
la enzima cortará en el sitio y se generarán dos fragmentos. Si, en cambio, hubo una mutación en el sitio, se va a
alterar la secuencia original, y de esta manera la enzima de restricción no va a reconocer el sitio de corte, producien-
do que haya solamente un fragmento de gran tamaño en lugar de dos fragmentos cortos. Con una electroforesis
posterior podremos observar este problema.
LA TÉCNICAS PARA ARN

NORTHERN BLOT
Así como vimos que el Western Blot sirve para identificar proteínas y el Southern Blot sirve para identificar
secuencias específicas de ADN, el Northern Blot es una técnica muy similar al Southern, y que permite identificar
ARNm específicos, presentes en muy baja cantidad en el genoma.
Los pasos son muy parecidos al Southern, y primero obtenemos los ARN, luego los separamos por electrofo-
resis, transferimos a una membrana de nitrocelulosa, y se usan sondas de ARN marcadas para identificar un ARNm
específico.
Esta técnica es muy útil para identificar ARNm específicos en tejidos del cuerpo, así como también para
averiguar el peso molecular del ARNm estudiado.
BIBLIOGRAFÍA
4 Alberts B y col: Introducción a la Biología Celular” 3ª edición. 2011. Editorial Médica Panamericana
4 Alberts B y col: Biología Molecular de la Célula. 6ª edición. 2015. Omega.
4 Cooper & Hausman: La Célula. 7a Edición. 2017. Marbán Libros.
4 Lodish H y col: Biología Celular y Molecular. 8ª edición. 2016. Editorial Médica Panamericana
24
PREGUNTAS DE REPASO
1) Respecto del fraccionamiento subcelular: 7) En la técnica de CRISPR-Cas9
a) Permite separar ADN de ARN en el núcleo a) Se basa en la forma en que las células eucariontes
b) Es específica para proteínas se defienden de infecciones bacterianas
c) Permite obtener una fracción mitocondrial específicas
separado del núcleo b) La enzima Cas9 es capaz de cortar una o ambas
d) Los ARNm citosólicos no pueden ser obtenidos hebras de ADN
c) Si se arregla por unión de extremos no homólogos,
2) Respecto de la Inmunohistoquímica se puede obtener el knockout génico
a) El anticuerpo secundario es de tipo monoclonal, d) Se puede insertar ARN específico y por
anti anticuerpo primario retrotranscripción generar ADN inserto.
b) El anticuerpo primario es de monoclonal y
marcado 8) En el Southern blot
c) Se puede observar una proteína marcada con a) La separación del ADN no requiere del uso de
florescencia enzimas de restricción
d) Cuando observamos proteínas de la MEC se b) Se pueden separar los cromosomas, gracias a
hace inmunocitoquímica que su tamaño es distinto
c) Los fragmentos de ADN son visualizados por medio
3) Con respecto a la electroforesis del uso de sondas de ADN (monocatenario
a) Se basa en la interacción de moléculas con carga marcado)
al someterlas a un campo eléctrico d) Las moléculas de ADN de carga (+) migran en
b) Es una técnica que permite separar proteínas del sentido opuesto
ADN por medio de su peso molecular
c) Se usa solamente para ADN y proteínas, porque 9) Con respecto a la PCR clásica:
los ARNm son monocatenarios a) Permite amplificar ADN partiendo de una cantidad
d) Las moléculas migran desde ánodo hacia cátodo. mínima de ARN al que se retrotranscribe
b) Los cebadores son oligonucleótidos de ADN
4) Respecto del Western Blot sintéticos creados en laboratorio, responsables
a) Es una técnica que permite separar proteínas de la especificidad de la técnica
según la carga que presenten, durante un c) NO es útil para el diagnóstico de infecciones de
tiempo definido virus ADN.
b) Permite identificar solamente tamaño y carga de d) En cada ciclo se aumenta la cantidad de a dos
una proteína cuestionada moléculas nuevas al contenido original
c) Se utilizan anticuerpos marcados para la
identificación de la proteína cuestionada. 10) Respecto de las distintas PCR:
d) La intensidad y grosor de la banda es un artefactos a) La RT PCR permite amplificar ARN específicos,
de la técnica que no deben valorarse. obteniendo múltiples copias de ese ARN
b) La qPCR permite amplificar ARNm por
5) Las enzimas de restricción retrotranscripción
a) Son enzimas codificadas en ADN nuclear, capaces c) La PCR alelo especifica permite amplificar ADN
de cortar extremos pegajosos viral presente en muy bajas concentraciones
b) Su actividad exonucleasa les permite eliminar d) La PCR RFLP permite identificar mutaciones en
nucleótidos de una hebra para dar los extremos sitios de restricción
pegajosos.
c) Se obtienen de bacterias extremófilas, por lo que
soportan altas temperaturas
d) Reconocen secuencias de nucleótidos que al RESPUESTAS
estar enfrentadas son la misma secuencia,
1. C
llamada secuencia palindrómica
2. A
3. A
6) Respecto de los vectores de ADN 4. C
a) Son capaces de insertar ARN específicos y 5. D
manipulados en el citoplasma de una célula. 6. B
b) Los plásmidos son ADN extrabacteriano de 7. C
replicación autónoma que contienen genes de 8. C
resistencia a antibióticos. 9. B
c) Los fagos son bacterias que infectan a 10. D
otras bacterias por un procesos llamado
transformación
d) El CAL son cromosomas artificiales bacterianos
25
5
CTO GEMA surge como respuesta a la demanda por par-
te de los alumnos de contar con una guía única que nu-
clee la información de los libros clásicos de Histología.
A diferencia del resto de las materias, Histología no tie-
ne grandes cambios en términos de contenidos a lo lar-
go de los últimos 20 años. Sin embargo, muchas ve-
ces los textos donde se plasman esos contenidos son
muy extensos y no se sabe hasta dónde llega exacta-
mente la materia. Y ahí es donde nosotros aparecemos,
para categorizar y explicar de manera clara y simple un
tema que podría obstaculizar la comprensión global.
Las guías están organizadas según el or-
den que sigue el programa de la materia y se basa
en la bibliografía oficial de las 3 cátedras de la UBA
A todo lo anterior se suman mis 25 años inin-
terrumpidos trabajando en el aula como docen-
te, aprendiendo con ustedes a buscarle la vuel-
ta para que cada vez resulte más claro el contenido.
Entender esta materia es un desafío que tomamos
cada año y espero ser de gran ayuda para que puedan
aprobar la materia, habiendo comprendido los contenidos.
@gloriaschannel
www.gemavirtual.com
YouTube: Gloria´s channel
26

Guia 5 2021 - Laboratorio y Miscelaneas - Indd

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