Práctica Nº 10

Coagulación sanguínea
OBJETIVO
Al finalizar la práctica, el estudiante podrá describir algunos aspectos
bioquímicos de la coagulación sanguínea y conocer experimentalmente la
importancia de algunos de sus factores (factor I fibrinógeno, III tromboplatina
y IV Ca++).

MARCO TEÓRICO
La coagulación sanguínea es la etapa de la hemostasia en la cual la sangre
pasa del estado líquido al de un gel resistente, constituido por una malla de
fibrina insoluble que engloba a los elementos formes de la sangre.

Es esencialmente, la conversión de una proteína soluble del plasma, el

fibrinógeno (factor I) en una proteína insoluble, la fibrina; por acción
catalítica de una enzima denominada trombina.

Trombina

Fibrinógeno Fibrina

Figura 10-1. Conversión del fibrinógeno en fibrina

En condiciones normales, la sangre circulante no coagula, porque no

contiene trombina y la poca que se puede formar es rápidamente inactivada
por acción de la antitrombina III (inhibidor de las formas activas de los
factores IX, X, XI y XII), también por la presencia de heparina, etc. Por ser un
tejido conjuntivo fluido, debe estar contenida en un “recipiente”, los vasos
sanguíneos, los cuales deben reunir una serie de condiciones:

123
- La capa interna de la pared del vaso sanguíneo, el endotelio, debe ser
liso, no adherente, no activante de zimógenos, de flujo laminar, con
carga eléctrica negativa, etc. (Figura 10-2).

En lo referente a su contenido, necesitamos conocer su composición:

- Fase líquida (55%):

∗ Agua.
∗ Proteínas (albúmina, globulinas, factores de la coagulación en
forma de zimógenos, enzimas, etc.).
∗ Carbohidratos (glucosa).
∗ Lípidos (triacilglicéridos).
∗ Iones (Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, HCO3-, etc.).
∗ Hormonas (adrenalina, insulina, estrógenos, etc.).
∗ Vitaminas.
∗ Productos de deshecho (urea, ácido úrico, bilirrubina, etc.).

- Fase sólida (45%):

∗ Representada por glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas.

Para algunos autores los glóbulos rojos representan
aproximadamente el 45%; los glóbulos blancos y plaquetas, 1%;
mientras que la fase líquida representaría el 54%.

- Fase gaseosa:

∗ Representada por oxígeno, dióxido de carbono y pequeñas

cantidades de nitrógeno transportados por los glóbulos rojos y
disueltos en menor cantidad en la fase líquida.

Es conveniente diferenciar plasma sanguíneo de suero sanguíneo, el

suero sanguíneo no contiene fibrinógeno.

Entre los factores de la coagulación contenidos en la sangre en

condiciones normales, podemos encontrar:

FACTORES PLASMÁTICOS: I, II, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, PK, K,
K.APM, los cuales se describirán en la tabla 10-1.

124
Los números romanos, señalan los factores plasmáticos, los cuales son en
su mayoría precursores inactivos; las formas activadas, se indican con una
letra “a” que sigue al número romano, por ejemplo: Xa. Los factores
plaquetarios, se designan con números arábicos, por ejemplo: fp3.

Figura 10.2: Representación de un vaso sanguíneo sano.

Tabla 10-1. Factores plasmáticos de la coagulación sanguínea

FACTOR NOMBRE COMÚN PROPIEDADES

Proteína fibrosa formada por tres pares
de cadenas polipeptídicas designadas
por (Aα)2, (Bβ)2 y (γ)2 unidas por puentes
disulfuro (-S-S-). Es una estructura
trinodular con dos dominios globulares
terminales grandes y un dominio globular
central pequeño. Los extremos N –
terminales de las cadenas Aα, Bβ, que
sobresalen del dominio globular central,
son escindidos por la trombina durante la
I Fibrinógeno
conversión del fibrinógeno en fibrina y
constituyen los fibrinopéptidos A y B.
(Figura 10-7).
Es una molécula altamente soluble en el
plasma sanguíneo. Después de sufrir
una proteólisis por la trombina, se
polimeriza y forma la red insoluble de
fibrina (coágulo).
Se sintetiza en el hígado. (Figura 10-8 y
10-9).

125
 Constituida por una sola cadena
polipeptídica que contiene restos de γ-
carboxiglutámico (dependiente de la
II Protrombina vitamina K). Por acción de la
protrombinasa se convierte en trombina.
(Figura 10-6)
Se sintetiza en el hígado.
Es un complejo lipoproteico, asociado a
la fracción microsómica de las células. El
cerebro, pulmón y placenta son ricos en
tromboplastina.
No activa directamente a la protrombina.
Tromboplastina Inicia una serie de reacciones, llamada
III
(factor tisular) vía extrínseca, que comprende un factor
plasmático, el VII (proconvertina).
La tromboplastina reacciona con el factor
VII para formar un complejo que requiere
la presencia de calcio; este complejo
activa al factor X.
Son requeridos en todo el proceso de la
coagulación, excepto en la fase inicial de
Iones de calcio,
IV contacto y en la conversión de
Ca++
fibrinógeno en fibrina por acción de la
trombina.
Es una glucoproteína plasmática que
interviene en la vía común de la
coagulación en la formación de un
complejo enzimático (Va – Xa), que va a
Proacelerina
V convertir la protrombina en trombina. El
Factor labil
complejo Va – Xa en presencia de Ca++
y FL (fosfolípido), es lo que algunos
autores denominan protrombinasa.
(Figura 10-6).
Es una glucoproteína plasmática
dependiente de la vitamina K. Es un
componente de la vía extrínseca de la
coagulación. Se activa por acción del
factor XIIa, la trombina y por un
Proconvertina
VII fenómeno de retroalimentación, en
Factor estable
presencia de Ca++ y FL. (Figura 10-5).
Forma un complejo con el factor III
(factor tisular), para escindir el enlace
arginina-isoleucina del factor X y formar
el Xa.

126
 Proteína que participa en la coagulación
por vía intrínseca. Por sí sola no tiene
Factor actividad enzimática; pero al unirse al
antihemofílico “A” factor IXa forma un nuevo complejo
VIII
Globulina (VIIIa - IXa) que se encarga de la
antihemofílica activación del factor X.
Su deficiencia genética causa la
hemofilia clásica A.
Es una glucoproteína dependiente de
vitamina K; constituida por una sola
cadena polipeptídica con alto contenido
Factor en glúcidos.
IX antihemofílico “B” El factor IX inactivo se trasforma en IXa
Factor Chirstmas por acción del factor XIa, en presencia
de Ca2+.
Su deficiencia genética causa la
hemofilia B.
Es una gluproteína dependiente de
vitamina K. Es el factor clave en el
mecanismo de la coagulación. Su
activación corre a cargo del complejo
(VIIIa – IXa) del mecanismo intrínseco y
del complejo (III – VIIa) del mecanismo
Factor Stuart -
X extrínseco. Estos complejos requieren de
Prower
la presencia del Ca++ y FL (fosfolípido)
para que se transforme el factor X en Xa.
Este factor Xa al unirse al Va, en
presencia de Ca++ y FL favorece la
transformación de la protrombina en
trombina.
Proteína formada por dos cadenas
Factor polipeptídicas iguales unidas por puentes
XI
antihemofílico “C” disulfuros (-S-S-).
Se activa por el factor XIIa.
Es otra de las proteínas plasmáticas
difíciles de caracterizar. Interviene junto
con otros factores en la fase de contacto,
que inicia el proceso de la coagulación
Factor Hageman por vía intrínseca y vía extrínseca.
XII
Factor contacto El colágeno al ser expuesto por daño al
endotelio vascular, se considera el
principal agente de su activación. (Figura
10-3).

127
 Es una proteína plasmática. Una vez
activado por la trombina el factor XIIIa,
Factor
actúa en la fase final de la coagulación,
estabilizante de la
XIII convirtiendo los monómeros de fibrina
fibrina
(coágulo inestable y blando) en
Transglutaminasa
polímeros de fibrina (coágulo estable y
duro), en presencia de Ca++.
Pre-Ka Precalicreína
Ka Calicreína
Cininógeno de
K.APM alto peso
molecular
Es un fosfolípido proveniente de las
Factor plaquetario
plaquetas. Se libera durante la fase de
3
fp3 secreción plaquetaria y participa en
(tromboplastina
diversos pasos de la coagulación
plaquetaria)
sanguínea.

En casos de superficie de contacto y daño tisular se deben considerar

específicamente el factor plaquetario 3 (fp3) y el factor tisular (factor III,
tromboplastina).

FACTORES QUE ACTÚAN COMO PROENZIMAS O ZIMÓGENOS

- Factor II (Protrombina).
- Factor VII (Proconvertina) actúan.
- Factor IX (Factor antihemofílico B).
- Factor X (Factor Stuart – Prower).

Los factores II, VII, IX y X que actúan como proenzimas, son dependientes
de la vitamina K, la cual se requiere para la conversión de los residuos de
ácido glutámico presentes en cada uno de ellos en residuos de γ-
carboxiglutámico, facilitando la unión a las plaquetas en una reacción
dependiente de calcio.

carboxilasa
Ácido glutámico ácido γ-carboxiglutámico
Vit K

128
FACTORES QUE ACTÚAN COMO COENZIMA

- Factor V (Proacelerina).
- Factor VIII (Factor antihemofílico A).

FACTORES DE CONTACTO

- Factor XII (Hageman).

- Factor XI (Factor antihemofílico C).

Cuando se lesiona un vaso sanguíneo pequeño, ya sea por trauma

físico o debido a una respuesta inflamatoria, el organismo dispone de
tres mecanismos fundamentales:

1. La vasoconstricción del vaso dañado: lo cual contribuye a disminuir el

área sangrante y a reducir la velocidad del flujo sanguíneo; para que los
siguientes pasos, especialmente los plaquetarios puedan tener lugar.
(Figura 10-3).

La vasoconstricción depende de la inervación simpática, pH, temperatura,

ADP, adrenalina, serotonina, histamina, etc. Esta reacción fisiológica no
detiene completamente el sangrado.

Figura 10-3. Representación de un vaso sanguíneo lesionado

2. La formación de un tapón hemostático plaquetario: cuando la célula

endotelial es lesionada, se pierde la superficie de separación protectora y
se ponen en contacto agentes reaccionantes del mecanismo de la
hemostasia: El colágeno por una parte, las plaquetas y factores

129
plasmáticos; de ésta forma, el endotelio ha perdido sus condiciones
normales (liso, no adherente ni activante). Además, la lesión a la célula
endotelial hace que se liberen extractos tisulares, tromboplastina o factor
tisular (factor III). La formación del tapón plaquetario comienza con la
adhesión de las plaquetas sanguíneas (fragmentos de células gigantes de
la médula ósea denominada megacariocito) a los vasos lesionados y
continúa con la activación y agregación de las mismas para formar una
barrera física, con el objeto de sellar la abertura temporalmente,
iniciándose así la coagulación sanguínea. (Figura 10-4)

Factores agregantes: ADP, trombina, tromboplastina plaquetaria (fp3),

trombospondina, tromboxano A2.

130
Figura 10-4. Papel de las plaquetas en la hemostasis. 1) Unión de las plaquetas a las fibras
de colágeno. 2) Adhesión plaquetaria. 3) Agragación plaquetaria

3. La coagulación sanguínea: implica la formación de una red

tridimensional de fibrina estable y fuerte para cerrar el vaso dañado
mientras se está reparando la herida.

La formación de coágulos para taponar defectos en vasos sanguíneos es

un mecanismo de defensa que protege al organismo e interviene en la
homeóstasis impidiendo la pérdida de sangre. Cuando hay alteraciones
en la coagulación, una herida accidental o un traumatismo, y aún la

131
 extracción de una pieza dentaria o intervenciones quirúrgicas, pueden
sangrar durante horas y días y llegar a comprometer la existencia.

Si bien la coagulación normal es un mecanismo de autodefensa, en

algunos casos como por ejemplo en la ateroesclerosis, cristales de ácido
úrico, pueden producirse coagulaciones dentro de los vasos (trombosis) y
ocluirlos, con la consiguiente falta de irrigación y muerte de los tejidos
(infarto); o bien, el coágulo puede emigrar a distancia y tapar los vasos
(embolia), produciendo accidentes peligrosos e incluso mortales.

Los coágulos de fibrina formados, son disueltos una vez que la integridad
estructural de las áreas dañadas se restaura. La lisis del coágulo la
realiza otra serín proteasa denominada plasmína, que se forma por la
activación proteolítica del plasminógeno, su precursor inactivo. Esta
conversión se produce por la acción de un activador tisular del
plaminógeno. Otras proteínas pueden también activar el plasminógeno,
entre ellas podemos citar la urocinasa y la estreptocinasa, que presentan
interés por su acción terapéutica sobre la disolución de trombos.

De los tres mecanismos de la hemostasia, lo que nos interesa es la

descripción bioquímica del último acontecimiento, objetivo de nuestra
práctica.

132
 CASCADA DE LA COAGULACIÓN SANGUÍNEA

Figura 10-5. Cascada de la coagulación sanguínea

133
La coagulación sanguínea se forma a través de la acción de una cascada
bifurcada de reacciones proteolíticas que implican la participación de casi 20
sustancias diferentes, la mayoría de ellas, glucoproteínas plasmáticas
sintetizadas en el hígado. La explicación práctica se iniciará con la formación
de un coágulo (conocido como trombo) y se retrocederá por los pasos de la
cascada.

ANTICOAGULANTES

Son agentes químicos de origen biológico o sintético que actúan impidiendo

que se realice el proceso de la coagulación sanguínea.

Acción de los anticoagulantes

La sangre circulante permanece fluida debido a mecanismos altamente

efectivos y además, por carecer de trombina no coagula, la poca cantidad de
trombina que puede formarse es inmediatamente neutralizada. La
antitrombina III, una α2 globulina sintetizada en el hígado, aunque tiene una
acción inhibitoria preferencial sobre la trombina, es mucho más efectiva como
neutralizadora del factor Xa (factor Stuar - Prower). La reactividad de la
antitrobina III, resulta notablemente aumentada cuando se une a la heparina;
por tanto, la heparina es un inhibidor de la coagulación. Es posible observar,
que la sangre cuando se derrama por los tejidos si es extraída o recogida en
un vaso u otro recipiente de vidrio ordinario, coagula en un lapso
relativamente corto. Para mantener fluida la sangre recién extraída se utilizan
los anticoagulantes.

Clasificación de los anticoagulantes

A. Anticoagulantes que actúan “in vitro”:

• Oxalato de potasio
• Citrato de sodio
• EDTA (etilendiamino tetra acético)

Los cuales forman con el factor IV (Ca++) un complejo tipo “quelato”

B. Anticoagulante que actúan “in vivo”:

• Cumarinas
• Indandionas

134
Estos anticoagulantes por sus semejanzas estructurales con la vitamina K,
actúan a nivel del hígado antagonizando su acción, es decir, inhiben los
mecanismos de coagulación bloqueando la síntesis de los factores II, VII, IX
y X. Estos factores se carboxilan y forman el ácido γ-carboxiglutámico
después de que se sintetizan y antes de ser secretadas por el hígado. Esta
reacción de carboxilación es vitamina K dependiente y es bloqueada por
anticoagulantes.

Los residuos ácido γ-carboxi glutámico, son los responsables de la unión al

calcio y juegan un papel importante en la interacción del grupo de factores
que forman parte de las protrobinas. Un derivado de la cumarinas (la
warfarina) se utiliza en clínica y también como raticida.
C. Anticoagulante que actúan “in vivo” e “in vitro”:

• Heparina: Es un polímero de ácido glucurónico y glucosalina, con

numerosos grupos sulfato en su estructura que proporcionan a la
molécula una fuerte carga negativa, lo cual le confiere su actividad
anticoagulante, porque:

∗ Impide la conversión de protrombina en trombina.

∗ Impide la conversión del fibrinógeno en fibrina.
∗ Inhibe la agregación plaquetaria.

135
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO Nº 1: obtención del plasma oxalatado

a) Fundamento químico:

La sangre, a la que se ha añadido oxalato de potasio (K2C2O4), se torna

incoagulable, puesto que el ión oxalato (C2O4=) se combina con el calcio
iónico, formándose un precipitado insoluble de oxalato de calcio (CaC2O4),
de esta manera no se dispone del calcio (factor IV) para que se realice el
proceso de la coagulación.

Ecuación molecular:

K2C2O4 + CaCl2 CaC2O4 + 2KCl

Ecuación iónica:

C2O4=(ac) + Ca++(ac) CaC2O4(s)

¿Por qué cuando se priva a la sangre del calcio, se hace incoagulable?

(Véase figura 10-5)

b) Procedimiento:

Se emplearán ratas machos adultas Sprague Dawley, criadas en el Bioterio

de la Universidad de Los Andes. Para el efecto experimental, serán
escogidas al azar.

1. Seleccione 2 tubos de centrífuga, hemólisis o baquelita (dependerá de la

centrifuga a utilizar). Añada 0.4 ml de oxalato de potasio al 10% a cada
uno.
2. Previa anestesia del animal y utilizando un tubo capilar que se introduce
en el ojo en la región retroorbital (ángulo superoexterno), extraiga
aproximadamente 5 ml de sangre y colóquelos en cada tubo de
centrífuga. Mezcle cada tubo por inversión lenta y no sacudiendo, se debe
evitar la brusquedad para no producir hemólisis.
3. Centrifugue los tubos a 3.000 rpm durante 10 min.
4. Extraiga el sobrenadante (plasma oxalatado) cuidadosamente con un
gotero y colóquelo en un tubo de ensayo limpio y seco. Conserve para
experimentos posteriores.

136
EXPERIMENTO Nº 2: recalcificación del plasma oxalatado

a) Fundamento:

Al añadir al plasma oxalatado un exceso de cloruro de calcio (CaCl2) se

dispone nuevamente de una cantidad suficiente de calcio iónico, Ca++ (factor
IV), para que tenga lugar la coagulación.
b) Procedimiento:

1. Coloque 1 ml de plasma oxalatado en un tubo de vidrio graduado con

capacidad adecuada (25 ml o 50 ml).
2. Añada 10 ml de solución salina al 0.9% p/v (solución fisiológica).
3. Agregue 2 ml de cloruro de calcio (CaCl2) al 1% p/v.
4. Deje reposar durante 15 min o más, o coloque en baño de agua a 37 ºC.
5. Observe la formación del coágulo de aspecto blanquecino.

¿Por qué al restituir el calcio (factor IV) se forma un coágulo?

(Véase esquema resumido de las vías de la coagulación sanguínea)

EXPERIMENTO Nº 3: obtención de una solución que contiene trombina

a) Fundamento:

El filtrado del coágulo obtenido en el experimento anterior, corresponde a una

solución que contiene trombina, la cual es una enzima proteolítica que se
origina a partir de la protrombina (factor II) al desencadenarse dos hidrólisis,
ambas catalizadas por el factor Va y Xa; la primera hidrólisis, retira un
segmento amino terminal rompiendo un enlace Arg – Tre y la segunda,
escinde el enlace Ile – Arg; de esta forma se abre el ciclo formado por un
disulfuro. (Figura 10-6).

En forma general:

Va - Xa
(Protrombinasa)

Protrombina Trombina

137
 Va - Xa

Figura 10-6. Acción del complejo de la protrombinasa

b) Procedimiento:

1. Filtre el coágulo obtenido en el experimento anterior. Recolecte el filtrado

en varios tubos de ensayo (3) y prefiera utilizar el último para el
experimento posterior.
2. Observe en el papel de filtro los filamentos de fibrina propios del coágulo.

EXPERIMENTO Nº 4: preparación de una solución de fibrinógeno

a) Fundamento:

El fibrinógeno (factor I), es precipitado del plasma sanguíneo mediante una

solución de sulfato de amonio, (NH4)2SO4 al 21.6% p/v, luego el fibrinógeno
precipitado se redisuelve con una solución de cloruro de sodio, NaCl al 2%
p/v.

Figura 10-7. Estructura del fibrinógeno

138
b) Procedimiento:

1. Coloque 2ml de plasma oxalatado en un tubo de centrífuga, hemólisis o

baquelita (dependerá de la centrífuga a utilizar) y añada 4 ml de solución
de sulfato de amonio al 21.6% p/v. Mezcle bien.
2. Centrifugue el tubo a 2.000 – 2.500 rpm durante 10 min. Recuerde
equilibrar la centrífuga.
3. Extraiga cuidadosamente los filamentos de fibrinógeno con una varilla fina
de vidrio, ó utilice un gotero para extraer el líquido que lo rodea. Si el
fibrinógeno está sedimentado decante el sobrenadante.
4. Disuelva el fibrinógeno precipitado añadiendo 5 ml de solución de cloruro
de sodio al 2% p/v. Mezcle bien hasta disolver, de ser necesario utilice un
agitador mecánico (vibraciones) o una varilla de vidrio.
5. Añada a la solución anterior, V gotas de cloruro de calcio al 1% p/v y se
deja para el próximo experimento.

EXPERIMENTO Nº 5: acción de la trombina sobre el fibrinógeno para

formar fibrina

a) Fundamento:

Al añadir solución de trombina del experimento Nº 3, a la solución de

fibrinógeno del experimento Nº 4, éste se transforma en fibrina insoluble,
observándose un coágulo blanco en el tubo de hemólisis.

En la reacción catalizada por la trombina, se liberan dos pares de pequeños

péptidos polares, son los fibrinopéptidos A y B que se encuentran en los
extremos amino terminales de las cadenas α y β respectivamente, al
romperse los enlaces peptídicos Arg - Gli. La molécula de fibrinógeno al
perder estos fibrinopétidos, se transforma en monómero de fibrina, (figura 10-
8). Posteriormente los monómeros de fibrina se alinean por sus extremos de
lado a lado, formando una red o malla de fibrina (coágulo inestable blando).
La polimerización inicial se debe a la formación de puentes de hidrógeno,
interacciones hidrofóbicas u otras fuerzas similares entre los monómeros.

139
En forma general:

(Aα)2 (Bβ)2 (γ)2

Fibrinógeno
(soluble)

2 fibrinopéptidos A
Trombina
2 fibrinopéptidos B

Monómero de (αβγ)2
Fibrina

Figura 10-8. Acción de la trombina sobre el fibrinógeno

Los monómeros que forman la malla de fibrina, se refuerzan por la creación

de enlaces covalentes cruzados entre las cadenas laterales de diferentes
moléculas en la malla de fibrina, se forman enlaces peptídicos entre las
cadenas laterales específicas de lisina y glutamina donde participa el factor
XIIIa.

Estos enlaces cruzados dan más rigidez al coágulo, formando una malla que
contiene una cantidad variable de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

Figura 10-9. Izquierda: formación del monómero de fibrina. Derecha: formación del polímero
de fibrina.

140
La etapa final de este proceso es la retracción del coágulo que forma una
masa endurecida.

b) Procedimiento:

1. Mida en un tubo de hemólisis 2 ml de la solución de fibrinógeno obtenida

en el experimento anterior. Hágalo por duplicado.
2. En uno de los tubos, agregue 2 ml de la solución que contiene trombina
obtenida en el experimento Nº 3; y en el otro tubo, agregue 3 ml de la
solución que contiene trombina.
3. Coloque los tubos de hemólisis en baño de María a 37 ºC por 10 min o
más.
4. Observe la formación de un coagulo blanco de fibrina.

141