PRÁCTICA NÚMERO 4

PRUEBAS DE COAGULACIÓN

DETERMINACIONES INCLUÍDAS:
1. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP).
2. TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPa).

INTRODUCCIÓN:
La vida del hombre depende del sistema circulatorio, en forma que una lesión de
los vasos sanguíneos puede ser grave y potencialmente mortal. Como respuesta a
la lesión vascular se ha desarrollado un mecanismo muy elaborado cuyo fin es la
reparación de tal daño. Los trastornos genéticos que causan la pérdida de las
funciones de proteínas plasmáticas y, por lo tanto, una hemorragia excesiva (p. ej.,
hemofilia), han desempeñado un papel importante en la identificación de muchos
mecanismos bioquímicos de la hemostasia. También es esencial que estos
mecanismos hemostáticos estén controlados de modo apropiado por mecanismos
inhibidores, ya que de no ser así un tapón de plaquetas-fibrina de tamaño
desproporcionado puede producir la oclusión local de un vaso sanguíneo mayor
(trombosis), o bien fragmentarse y causar un bloqueo de un vaso periférico
(embolismo). La trombosis arterial es la principal causa de ataques cardíacos,
accidentes vasculares cerebrales o accidentes vasculares periféricos (necesidad
de amputación de extremidades), pero la trombosis y el embolismo venosos
también son causas significativas de muerte e incapacidad. Está generalizado el
uso clínico de los fármacos antitrombóticos (antiplaquetarios, anticoagulantes y
trombolíticos), por lo que debe entenderse bien cómo interfieren estos fármacos
con los mecanismos hemostáticos normales para ejercer sus efectos
antitrombóticos. Después de una lesión en los tejidos asociada a ruptura de
pequeños vasos sanguíneos (traumatismos cotidianos, inyecciones, incisiones
quirúrgicas y extracciones dentales), normalmente ocurre una serie de
interacciones entre la pared del vaso sanguíneo y la sangre circulante, que
provocan una interrupción de la pérdida de sangre en pocos minutos (hemostasia).
La hemostasia se debe al sellado efectivo de los vasos sanguíneos rotos por un
tapón hemostático.

HEMOSTASIA. Es el cese del sangrado de un vaso lesionado, en tanto la trombosis

tiene lugar cuando el endotelio que recubre los vasos sanguíneos se daña o elimina
(p. ej., en el momento de ruptura de una placa esclerótica). Estos procesos incluyen
la formación del coágulo sanguíneo (coagulación) e implican a los vasos
sanguíneos, la agregación plaquetaria y las proteínas plasmáticas que causan
tanto la formación como la disolución de los agregados plaquetarios. En la
hemostasia, existe la constricción del vaso dañado con el objeto de disminuir el flujo
distal de sangre a nivel de la herida. La hemostasia y la trombosis comparten tres
fases:
1. Formación de un agregado plaquetario, laxo y temporal, en el sitio de la
lesión. El colágeno expuesto en el sitio de lesión actúa como base para la
fijación de las plaquetas, las cuales en respuesta a la unión con el colágeno

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 experimentan una desorganización de su estructura interna y liberan
tromboxano A2 y ADP, que activan a otras plaquetas que fluyen al lugar de
la lesión para adherirse a las ya unidas al colágeno, formando el tapón laxo
y temporal de plaquetas. En el momento de la activación, las plaquetas
cambian de forma y, en especial el fibrinógeno, se agrega para formar el
tapón hemostático (en la hemostasia) o un trombo (en la trombosis).
2. Formación de una red de fibrina que se une al agregado plaquetario y
forma un tapón hemostático más estable o trombo.
3. Disolución parcial o completa del tapón hemostático o trombo por la
plasmina.

El comienzo de la formación del coágulo de fibrina en respuesta a la lesión tisular

es realizado por la vía extrínseca de la coagulación. La iniciación del trombo rojo
puro en un área de circulación sanguínea restringida o en respuesta a una pared
vascular anormal se realiza por la vía intrínseca. Las vías intrínseca y extrínseca
convergen en una ruta final común. La coagulación sanguínea es parte importante
de este mecanismo de defensa, en la cual está involucrada la participación de
proteínas conocidas como factores de la coagulación. Los factores de la
coagulación se identifican por un número romano y, también por un nombre
específico. La forma activa de un factor de la coagulación se indica por el número
romano correspondiente seguido del subíndice a. Por ejemplo, el factor X es
inactivo, mientras el factor Xa es activo.

FACTORES DE LA COAGULACIÓN.
Factor Nombre
I. Fibrinógeno.
II. Protrombina.
III. Factor tisular, factor hístico.
IV. Ca2+.
V. Proacelerina, factor lábil, globulina aceleradora.
VII. Proconvertina, acelerador de la conversión de protrombina sérica, cotromboplastina.
VIII. Factor A antihemofílico, globulina antihemofílica (AHG).
IX. Factor B antihemofílico, factor de Christmas, componente de tromboplastina plasmática.
X. Factor de Stuart-Prower.
XI. Antecedente de tromboplastina plasmática (PTA).
XII. Factor de Hageman.
XIII. Factor de Laki-Lorand (FLL), factor estabilizante de fibrina (FSF), fibrinoligasa.

La coagulación sanguínea puede desencadenarse a través de dos vías:

1. Una de ellas se denomina vía intrínseca, debido a que todos los factores
necesarios se encuentran siempre circulando en el plasma; esta vía se activa
cuando la sangre entra en contacto con una superficie extraña y se

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 caracteriza por ser una vía relativamente lenta, ya que requiere varios
minutos.
2. La segunda vía, la vía extrínseca, se desencadena por un traumatismo tisular
y permite la formación de un coágulo en cuestión de segundos.

Las vías intrínseca y extrínseca convergen en una ruta final común, en donde la
protrombina es activada a trombina y se produce el desdoblamiento catalítico de
fibrinógeno por la trombina para formar el coágulo de fibrina. La vía intrínseca, la
vía extrínseca y la vía final común son complejas y comprenden muchas proteínas
diferentes. Estas proteínas pueden clasificarse como:

CIMÓGENOS DE SERINA PROTEASAS:

Factor II, factor VII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII.
Factor XII. Se une a la colágena expuesta en sitios de lesion de la pared vascular; activado por
cininógeno de PM elevado y por calicreína.
Factor XI. Activado por el factor XIIa.
Factor IX. Activado por el factor XIa en presencia de Ca 2+.
Factor VII. Activado por la trombina (factor IIa) en presencia de Ca 2+.
Factor X. Activado en la superficie de las plaquetas activadas por el complejo tenasa (Ca 2+,

factores VIIIa y IXa) y por el factor VIIa en presencia del factor tisular y Ca 2+.
Factor II. Activado en la superficie de las plaquetas activadas por el complejo protrombinasa
(Ca 2+, factores Va y Xa).
Los factores II, VII, IX y X son cimógenos que contienen Gla
(Gla = -carboxiglutamato).

COFACTORES: Factor III, factor V, factor VIII.

Factor VIII. Activado por la trombina; el factor VIIIa es un cofactor en la activación del factor X
por el factor IXa.
Factor V. Activado por la trombina; el factor Va es un cofactor en la activación de
protrombina (factor II) por el factor Xa.
Factor III. Proteína expuesta en la superficie de las células endoteliales dañadas o estimuladas,
para actuar como un cofactor del factor VIIa.

FIBRINÓGENO.
Factor I. Desdoblado por trombina para formar el coágulo de fibrina.

TRANSGLUTAMINASA.
Factor XIII. Activado por la trombina en presencia de Ca 2+; estabiliza el coágulo de fibrina con
enlaces cruzados covalentes.

PROTEÍNAS REGULATORIAS.
Proteína C. Activada hasta proteína Ca (Cactiva) mediante trombina unida a trobomodulina;
después degrada los factores VIIIa y Va.

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Proteína S. Actúa como cofactor de la proteína C; ambas proteínas contienen residuos Gla (-
carboxiglutamato).
Trombomo- Proteína en la superficie de las células endoteliales; enlazado a trombina, la cual
dulina. entonces activa a la proteína C.

VÍA INTRÍNSECA. La vía intrínseca implica los factores XII, XI, IX, VIII y X, así como
precalicreína, cininógeno de peso molecular elevado (cininógeno de HMW), Ca2+
y fosfolípidos plaquetarios. El resultado es la producción del factor Xa. Esta vía
comienza con la fase de contacto, donde la precalicreína, el cininógeno de HMW,
factor XII y factor XI, se exponen a una superficie activadora con carga negativa.
Cuando los componentes de la fase de contacto se ensamblan en la superficie
activadora, el factor XII se activa a factor XIIa, por proteólisis debido la acción de
la calicreína. Este factor XIIa, generado por la calicreína, ataca a la precalicreína
para formar más calicreína, estableciéndose una activación recíproca. El factor
XIIa, una vez formado, activa al factor XI a factor XIa y además libera bradicinina
(nonapéptido con potente acción vasodilatadora) a partir del cininógeno de
HMW. El factor XIa en presencia de Ca2+ activa al factor IX a factor IXa. El factor IXa
a su vez rompe un enlace Arg-Ile para producir la serina proteasa de dos cadenas,
el factor Xa. La activación del factor X requiere el ensamblaje del componente
llamado, el complejo tenasa en la superficie de las plaquetas activadas,
constituido por: fosfolípidos plaquetarios aniónicos, Ca2+, el cofactor VIIIa, así como
los factores IXa y X.

VÍA EXTRÍNSECA. La vía extrínseca utiliza el factor tisular (factor hístico), factor VII,
factor X, Ca2+ y conduce a la formación del factor Xa. La vía extrínseca comienza
en el sitio de la lesión con la expresión del factor tisular (factor hístico) en las células
endoteliales y sobre monocitos activados. El factor tisular (factor hístico) activa, al
factor VII. El factor tisular (factor hístico), actúa como un cofactor en la activación
del factor X catalizada por el factor VIIa. El factor VII, es una glucoproteína (serina
proteasa, contiene Gla y es sintetizada en el hígado) activado por cantidades
mínimas de trombina y Ca2+ a factor VIIa. La asociación del factor hístico (factor
tisular o factor III) y el factor VIIa se llama complejo de factor hístico. La reacción
mediante la cual el factor Xa se activa requiere el montaje de componentes,
denominados el complejo tenasa extrínseco, sobre una superficie de membrana
que expone al fosfolípido procoagulante fosfatidilserina; estos componentes son:
Ca2+, el complejo de factor hístico (factor hístico y factor VIIa), y el factor X. El factor
VIIa rompe el enlace Arg-Ile en el factor X en presencia de Ca2+ para producir el
factor Xa.

VÍA FINAL COMÚN. El factor Xa, producido tanto por la vía intrínseca como por la
vía extrínseca, activa a la protrombina (II) a trombina (IIa), esta última convierte el
fibrinógeno (I) en fibrina (Ia). La activación de la protrombina tiene lugar en la
superficie de las plaquetas activadas y requiere el ensamblaje del complejo
protrombinasa, constituido por: fosfolípidos plaquetarios aniónicos, Ca2+, factor Va,
factor Xa y protrombina (II). Funciona como cofactor de manera análoga al

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cofactor VIII en el complejo tenasa. Cuando el cofactor V se activa a cofactor Va
por acción de oligocantidades de trombina, se une a receptores específicos sobre
la membrana plaquetaria y forma un complejo con el factor Xa y protrombina (II).
Al momento de unirse al complejo formado por los factores Va y Xa en la
membrana plaquetaria, la protrombina (II) es dividida por el factor Xa en dos sitios,
para generar la molécula de dos cadenas, la trombina (IIa), que luego se
desprende de la superficie plaquetaria.

CONVERSIÓN DE FIBRINÓGENO A FIBRINA. La trombina (IIa) hidroliza los cuatro

enlaces Arg-Gli entre los fibrinopétidos y las porciones  y  de las cadenas A y B
del fibrinógeno. El desprendimiento de los fibrinopéptidos expone los sitios de
fijación, permitiendo que las moléculas de los monómeros de fibrina se agreguen
de manera espontánea en un ordenamiento regular, formándose así un coágulo
de fibrina insoluble. Es precisamente la formación de este polímero de fibrina, lo
que atrapa plaquetas, eritrocitos y otros componentes, que llegan a formar
trombos blancos y rojos. El coágulo inicial de fibrina es muy débil y se conserva
unido sólo por enlaces no covalentes de los monómeros de fibrina. La trombina
además de convertir el fibrinógeno en fibrina, también transforma el factor XIII en
factor XIIIa. El factor XIIIa es una transglutaminasa que une de forma covalente y
mediante puentes cruzados las moléculas de fibrina, esto da como resultado un
coágulo de fibrina más estable con una mayor resistencia a la proteólisis.

PLAQUETAS. Son pequeñas células discoidales anucleadas, procedentes de la

fragmentación del citoplasma de los megacariocitos medulares. Circulan por la
sangre y su función es tapar rápidamente cualquier lesión producida en el
endotelio vascular y la activación del sistema de la coagulación. En la membrana
plaquetaria existen receptores tanto glucoproteicos como no glucoproteicos. Las
glucoproteínas de membrana actúan como receptores mediando, entre otras, dos
funciones importantes: la adhesión de las plaquetas a la superficie vascular
dañada y la interacción plaqueta-plaqueta o agregación plaquetaria. Los
receptores no glucoproteicos actúan regulando la activación y agregación
plaquetaria. Las plaquetas circulan normalmente en forma no activada. Durante
la hemostasia o trombosis, las plaquetas se activan y ayudan a formar tapones
hemostáticos o trombos. Para esto realizan tres pasos fundamentales: 1) adhesión
a la colágena expuesta de la pared vascular lesionada, 2) liberación del contenido
de sus gránulos y 3) agregación plaquetaria. Las plaquetas se adhieren a la
colágena mediante receptores específicos localizados en la superficie plaquetaria,
e incluyen el complejo glucoproteico, a través de una reacción donde participa el
factor de von Willebrand. El factor de von Willebrand es una glucoproteína
secretada por las células endoteliales hacia el plasma, el cual estabiliza al factor
VIII y además se fija a la colágena y al subentotelio. Esta interacción es de
importancia especial en la adhesión plaquetaria al subendotelio bajo condiciones
de estrés traumático, que se presenta en los pequeños vasos y en las arterias
estenosadas. Las plaquetas se adhieren a la colágena, cambiando de forma y

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extendiéndose sobre el subentotelio, donde liberan el contenido de sus gránulos
de almacenamiento (los gránulos densos y los gránulos alfa); tal secreción también
es estimulada por la trombina.

VÍA INTRÍNSECA VÍA EXTRÍNSECA

LUZ DEL VASO SANGUÍNEO Y PLAQUETAS ACTIVADAS SUBENDOTELIO Y MONOCITOS
ACTIVADOS

calicreína precalicreína daño tisular

fase de contacto HWM

factor tisular (cofactor III)
superficie activadora factor VIIa

factor XII factor XIIa

factor tisular (cofactor III)
factor VIIa
Ca2+
factor XI factor XIa
Ca2+
Ca2+
factor IX factor IXa

cofactor VIII cofactor VIIIa

Ca2+
plaquetas

factor X factor Xa

cofactor Va cofactor V
plaquetas
Ca2+

protrombina (II) trombina (IIa)

factor XIII

factor XIIIa
fibrinógeno monómero fibrina producto
fibrina fragmentación
fibrina
fibrinólisis

activador del plasminógeno

plasminógeno plasmina
(profibrinolisina) (fibrinolisina)

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OBJETIVOS:
1. Conocer la utilidad clínica de algunas pruebas de coagulación en el
diagnóstico de coagulopatías y en el período preoperatorio.
2. Explicar su importancia en el diagnóstico clínico.

MATERIAL:
Tubo Vacutainer (tapón azul con citrato de sodio 0.109 M).
Tubos de ensaye 12 x 75 mm.
Pipetas de 1 mL.
Pipeta de transferencia.

MATERIAL BIOLÓGICO:
Plasma (citratado).

REACTIVOS:
Equipo para la determinación Tiempo de Protrombina.
Equipo para la determinación Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada.

APARATOS:
Centrífuga clínica.
Baño serológico.
Cronómetro.

TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)

OBJETIVOS:
1. Valorar la vía extrínseca, es decir que depende de los factores V, VII, X,
protrombina (II) y fibrinógeno (I).
2. Detectar deficiencias del sistema de coagulación, indicativas de trastornos
congénitos o adquiridos, enfermedades hepáticas o déficit de vitamina K.
3. Controlar de la terapia con anticoagulantes orales.

FUNDAMENTO:
Para determinar las anormalidades de la coagulación en la vía extrínseca se utiliza
tromboplastina de cerebro de conejo con calcio.

MÉTODO:
1. En condiciones antisépticas extraer la muestra de sangre con el tubo
vacutainer (tapón azul con citrato de sodio 0.109 M) y homogeneice por
inversión de 3 a 4 veces. Posteriormente centrifugar a 2500 r.p.m. durante 10
minutos y separar el plasma cuidadosamente con una pipeta de
transferencia en un tubo de ensaye limpio y seco.
2. Preincubar la tromboplastina activada y el plasma a 37 ºC por 2 minutos.

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 3. En un tubo de ensaye limpio y seco adicionar hasta el fondo 0.1 mL de
plasma. Posteriormente adicionar 0.2 mL de tromboplastina activada de la
misma forma y simultáneamente active el cronómetro.
4. Agitar el tubo incubado a 37 ºC por 2 o 3 segundos, dejándolo reposar unos
segundos (no más de 10 segundos).
5. En seguida sacar el tubo manteniéndolo cerca de una fuente de luz,
inclinándolo suavemente una o dos veces para detectar la aparición del
primer filamento de fibrina (coágulo). Es ese momento parar el cronómetro
y anotar los segundos que marco.

RESULTADO: TP _________ segundos.

VALORES DE REFERENCIA: 11-14 segundos.

NOTA: En el laboratorio clínico, las pruebas de coagulación se efectúan por
duplicado.

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPa)

OBJETIVOS:
1. Evaluar las anormalidades de la coagulación en la vía intrínseca
2. Detectar deficiencias en los factores V, VIII, IX, XI XII, protrombina (II) y
fibrinógeno (I).
3. Controlar la efectividad de la terapia con heparina y en el control
terapéutico de las enfermedades tanto hemorrágicas como trombóticas.

FUNDAMENTO:
Para determinar las anormalidades de la coagulación en la vía intrínseca se utiliza
un reactivo de tromboplastina parcial activada que contiene fosfátidos líquidos
purificados de soja y un activador del plasma como sustituto plaquetario y agentes
sensibilizantes.

MÉTODO:
1. En condiciones antisépticas extraer la muestra de sangre con el tubo
vacutainer (tapón azul con citrato de sodio 0.109 M) y homogeneice por
inversión de 3 a 4 veces. Posteriormente centrifugar a 2500 r.p.m. durante 10
minutos y separar el plasma cuidadosamente con una pipeta de
transferencia en un tubo de ensaye limpio y seco.
2. Preincubar el cloruro de calcio 0.02 M, el reactivo de TTPa y el plasma a 37
ºC por 2 minutos.
3. En un tubo de ensaye limpio y seco adicionar hasta el fondo 0.1 mL del
reactivo TTPa y 0.1 mL de plasma, mezclar bien e incubar a 37 ºC por 5
minutos. Los tiempos de incubación superiores a 5 minutos pueden ocasionar
pérdida de los factores V y VIII.
4. Posteriormente adicionar 0.1 mL de cloruro de calcio 0.02 M y
simultáneamente active el cronómetro. Mezclar bien y después de 20

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 segundos, sacar el tubo manteniéndolo cerca de una fuente de luz,
inclinándolo suavemente una o dos veces para detectar la aparición del
primer filamento de fibrina (coágulo). Es ese momento parar el cronómetro
y anotar los segundos que marco.

RESULTADO: TTPa __________ segundos.

VALORES DE REFERENCIA: 28 a 34 segundos.

NOTA: En el laboratorio clínico, las pruebas de coagulación se efectúan por
duplicado.

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE MEDICINA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRUEBAS DE COAGULACIÓN

FECHA: NÚMERO DE MATRÍCULA:

PRUEBAS DE COAGULACIÓN RESULTADO VALORES DE REFERENCIA

TIEMPO DE PROTROMBINA, 11 – 14
(segundos):

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA 28 – 34
PARCIAL ACTIVADA,
(segundos):

ANÁLISIS DE RESULTADOS:

RESPONSABLE:

9
CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué se requiere vitamina K para la generación de factores de la

coagulación con actividad biológica óptima?

2. ¿Por qué el ácido acetilsalicílico (aspirina) modifica el comportamiento de las

plaquetas?

3. ¿Cuál es la utilidad clínica de los fármacos antitrombóticos (antiplaquetarios,

anticoagulantes y trombolíticos)?

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11