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INTRODUCCIÓN

La hemostasia secundaria se da gracias a una serie de reacciones enzimáticas en forma de cascada


en donde intervienen los factores de la coagulación que son proteínas plasmáticas solubles y
tienen como fin convertir el fibrinógeno y fibrina.

INTERACCIONES Y CONTROLES DE LA HEMOSTASIA

El tapón hemostásico primario plaquetario se ve reforzado con una especie de malla que forma la
fibrina para evitar que se pierda más sangre, a esto se llama coágulo el mismo que es temporal y
estimula la reparación del endotelio lesionado.

Después que el vaso lesionado comienza a repararse la fibrina se degrada gracias a la plasmina
que se activa a plasminógeno.

FACTORES DE LA COAGULACIÓN

A los factores de la coagulación los identifica con un número romano de acuerdo al orden en que
se descubrieron del I-XIII, se coloca una letra “a” cuando el factor se activa y tiene actividad
enzimática, excepto el Factor II que se denomina trombina a su forma activada, al Factor I se le
denomina fibrina cuando se activa.

La fibrina no tiene características enzimáticas, la tromboplastina tisular (Factor III) y el calcio


(Factor IV) no tienes forma activada, además el Factor VI se eliminó porque era una variante
activada del Factor V.

Dichos factores, el plasminógeno y los inhibidores de proteasas son sintetizados en el hígado.

Se pueden dividir en tres grupos de acuerdo a sus propiedades físicas:

1. Grupo de la Protrombina: incluye a los factores II, VII, XI y X, también se los conoce como
Factores dependientes de la vitamina K.

2. Grupo del Fibrinógeno: incluye a los factores I, V, VIII y XIII, también se los conoce como
el grupo consumible porque se consumen durante la formación de la fibrina.

3. Grupo de Contacto: incluye a los factores XI, XII, también la precalicreína y el CAMP.

CASCADA DE LA COAGULACIÓN
Se divide en tres vías: 1. Vía Intrínseca, 2. Vía Extrínseca; y 3. Vía Común

Tanto la vía extrínseca como la intrínseca convergen en la vía común que inicia con la activación
del factor X y termina con la formación de la fibrina.

VÍA INTRÍNSECA

Los componentes de esta vía se encuentran todos en el torrente sanguíneo, los factores que
participan son: XII, XI, IX, VIII, cininógeno de alto peso molecular (CAMP) y precalicreína.

Termina con la activación del Factor X mediante el complejo IXa/ VIIIa, Calcio, FP.

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Se inicia con la exposición de los
factores de contacto (XI, XII,
precalicreína y el cofactor CAMP)
con las estructuras subendoteliales
(colágeno y membrana basal).

Los primeros factores que se


absorben en el vaso lesionado son
el factor XII y precalicreína. El
factor XII enlazado a la superficie
transforma la precalicreína en
calicreína y ésta con el CAMP
escinden proteolíticamente el
Factor XII que se encuentra en la
superficie en Factor XIIa.

El factor XIIa va actuar sobre el


factor XI para activarlo (Factor XIa)
en presencia del cofactor CAMP,
además activa el sistema
fibrinolítico porque actúa como un
proactivador del plasminógeno.

El factor XIa actúa sobre el factor IX en presencia del calcio para activarlo (Factor IXa) el cual
forma un complejo con el factor VIII y el calcio en la superficie fosfolípida de la plaqueta para
activar el factor X que converge en la vía común.

VÍA EXTRÍNSECA

Se denomina así porque para su activación


requiere de un compuesto que no se encuentra en
la sangre como lo es el Factor Tisular, que es una
proteína que forma parte de la membrana celular
del endotelio, se encuentra distribuido
especialmente en el encéfalo, pulmones y placenta
también se requiere el Factor VII.

Al momento en que toman contacto el


subendotelio con la sangre el factor VIIa (no se
conoce con certeza si debe volverse activo) forma
un complejo con el factor tisular que en presencia
del calcio actúan sobre el factor X, activándolo.

VÍA COMÚN
Incluyen tres reacciones principales:

1. La activación del factor X por los productos de las vías intrínseca y extrínseca.
2. Conversión de la protrombina a trombina gracias al factor Xa.

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3. Conversión del fibrinógeno a fibrina
por la trombina.

El factor X se activa mediante: -Vía


Intrínseca: el complejo formado por el
factor IXa, VIIIa, Calcio.
-Vía
Extrínseca: el complejo formado por el
factor VIIa, III y Calcio.

El factor Xa forma un complejo con el


cofactor factor V, fosfolípidos y calcio para
la activación de protrombina a trombina y
ésta a su vez actúa sobre el fibrinógeno
para formar fibrina.

FACTOR XIII: este factor sirve para estabilizar el polímero de fibrina, para su activación se requiere
de la interacciones con iones de calcio.

El factor XIII se encuentra distribuido comúnmente entre el plasma que se sintetiza en el hígado, y
también se encuentra en las plaquetas que se sintetiza en los megacariocitos.

CONTROL FISIOLÓGICO DE LA HEMOSTASIA

Los mecanismos fisiológicos que controlan la coagulación incluyen:

 Flujo Sanguíneo: no se forman coágulos al menos que suceda dos cosas:


1. Vasoconstricción; y 2. Activación de los factores de coagulación

 Depuración Hepática: los hepatocitos retiran los factores activados, plasmina y fibrina.

 Inhibición por retroalimentación: algunos factores activados destruyen otros factores.

 Inhibidores bioquímicos: son proteínas plasmáticas solubles que regulan las reacciones
enzimáticas como: antitrombina III, proteína C, cofactor II de la heparina, proteína S.

 Disolución fibrinolítica de la fibrina

SISTEMA FIBRINOLÍTICO

Se produce como respuesta a la cascada de coagulación, en donde se activa la plasmina a partir


del plasminógeno, la plasmina tiene la capacidad de digerir la fibrina, el fibrinógeno y otros
factores de la coagulación

De dicha digestión se forman fragmentos de proteína conocidos como productos de la


degradación de la fibrina (PDF), estos fragmentos se retiran de la circulación gracias al hígado,
caso contrario pueden ejercer un efecto anticoagulante.

Los componentes fundamentales del sistema fibrinolítico son:

1. Plasminógeno 2. Activadores del plasminógeno

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3. Plasmina 6. Inhibidores de los activadores del
4. Fibrina plasminógeno y de la plasmina
5. Productos de la degradación de la
fibrina y del fibrinógeno

El plasminógeno circula en la sangre como un zimógeno, se sintetiza en el hígado y durante la


formación del coágulo se absorben grandes cantidades dentro de la masa de fibrina.

Los activadores del plasminógeno pueden ser extrínsecos (en los tejidos) o intrínsecos (sangre).

Activadores Intrínsecos: están implicados en la fase de contacto de la cascada en la vía intrínseca.

Activadores Extrínsecos son: los activadores tisulares del plasminógeno (t- PA), que son derivados
del endotelio y los activadores del plasminógeno similares a la urosinasa (u- PA).

También se encuentran los inhibidores como son: el inhibidor del activador de plasminógeno-1
(IAP-1) y el inhibidor del activador de plasminógeno-2 (IAP-2).

Existe cierta interacción entre la cascada de coagulación con la fibrinólisis, ya que el proactivador
del plasminógeno se activa por el factor XIIa, a su vez la plasmina activa el factor XII, al mismo
tiempo degrada la plasmina los factores V, VIII y la fibrina.

CONTROL FISIOLÓGICO DE LA FIBRINÓLISIS


Los inhibidores principales son:

 α2-antiplasmina: bloquea el sitio de enlace de lisina del plasminógeno libre y evita su


absorción a la fibrina.
 α2- macroglobulina: neutraliza el exceso de plasmina cuando se satura la α2antiplasmina.
 IAP-1: inhibe el t-PA y tcu-PA en el plasma; el IAP-2: inhibe el t-PA y tcu-PA, pero es menos
eficiente que el anterior; y el IAP-3: inhibe la tcu- PA.

INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIA SECUNDARIA Y DE LA FIBRINÓLISIS

La muestra que se utiliza debe estar con citratado de sodio o con oxalato de sodio como
anticoagulante, los mismos que actúan mediante el quelato del calcio, sin embargo el que se
recomiendo usar es el citrato (3.8%) porque conserva mejor el factor V y El factor VIII.

Se debe analizar dentro de 30 a 120 minutos. Se centrifuga a 1000 rpm durante 10 a 15 minutos.

Las pruebas de laboratorio para la hemostasia secundaria pueden dividirse en dos grupos:
pruebas de detección y pruebas especiales.

PRUEBAS PARA LA HEMOSTASIA SECUNDARIA

Permite determinar el tiempo en que se forma el coágulo después de agregar el calcio,


tromboplastina o un activador al plasma citratado.

El punto final de la fibrina se determina por tres medios que son: visual, electromecánico
(semiautomático) y espectrofotométrico (automática).

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PRUEBAS DE DETECCIÓN

Están destinadas para comprobar la integridad general de las vías intrínseca, extrínseca y común,
éstas incluyen el TP, TTP y TT.

Tiempo de Protrombina (TP): analiza la vía extrínseca, mide la activación del factor X por el
complejo formado por el factor VIIa/Factor Tisular, además las reacciones de la vía común.

Mide los factores I, II, V ,VII y X, mediante la agregación de tromboplastina tisular que activa la vía
extrínseca, se incuba, se coloca el calcio y se observa el tiempo a la que se forma el coágulo.

El tiempo normal es de 11 a 15 segundos, sin embargo está prolongado en enfermedades


hepáticas o la administración de anticoagulantes, el TP es la prueba predilecta para vigilar el
tratamiento con anticoagulantes.

Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (TTPa): mide todos los factores con excepción del VII
y el XIII, para realizarla se incuba una sustancia activadora con el plasma para activar los factores
de contacto.

El tiempo normal en que se forma el coágulo es de 32 a 46 segundos.

Interpretación de resultados:

 TP anormal y TTP normal: el TP anormal se debe a una deficiencia del factor VII.

 TP normal y TTP anormal: se debe a una deficiencia de un factor de la vía intrínseca.

 TP anormal y TTP anormal: debe considerarse una contaminación con heparina osino
realizar estudios para determinar inhibidores circulantes.

TIEMPO DE TROMBINA

Con esta prueba se mide únicamente la conversión del fibrinógeno a fibrina, se realiza agregando
trombina al plasma citratado y se mide el tiempo que tarde en formarse el coágulo.

Un resultado prolongado demuestra la deficiencia de fibrinógeno o la presencia de inhibidores


circulantes como la heparina, la plasmina y PDF.

PRUEBA DEL DÍMERO D

Es un análisis que se emplea para la detección de los productos de la degradación de la fibrina, ya


que el dímero D solo se forma por la digestión de la fibrina gracias a la acción de la plasmina.

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PRUEBA DE HAM

Permite evaluar a los pacientes con sospecha de PNH (hemoglobinuria paroxística nocturna) o
sospecha de anemia diseritropoyética congénita (CDA); el examen verifica si los glóbulos rojos se
vuelven más frágiles cuando se colocan en un ácido suave.

La PNH es positiva cuando el 10% a 50% demuestra lisis en los sueros acidificados no inactivados.
El diagnóstico de PNH demuestra que las células rojas del paciente tienen una alta sensibilidad a
la hemólisis mediada por el complemento.

Sin embargo la prueba de Ham está siendo reemplazada cada vez más por un examen llamado
citometría de flujo.
MÉTODO     
Prueba de Ham con suero acidificado. La sospecha de PNH se da cuando los glóbulos rojos son
lisados con suero normal acidificado o suero del paciente no acidificado. El suero normal utilizado
debe ser fresco y debe ser compatible ABO con los glóbulos rojos del test.

INTERPRETACIÓN
Un examen negativo es normal, sin embargo el significado de los resultados anormales pueden
deberse a:

 Hemoglobinuria paroxística nocturna  Anemia diseritropoyética congénita

LIMITACIONES

Su eficacia es limitada, porque puede dar resultados falsos negativos por el efecto de
transfusiones previas, y falsos positivos en la anemia diseritropoyética congénita tipo II.

También pueden darse resultados falsos-positivos pueden ocurrir en otras enfermedades


hematológicas: como en la esferocitosis hereditaria o adquirida, anemia aplástica, leucemia y
síndromes mieloproliferativos. En esas condiciones la hemólisis podría también ocurrir en sueros
acidificados inactivados.

TEST DE AGUA AZUCARADA

Es un examen de sangre para detectar glóbulos rojos frágiles por medio de la evaluación de su
capacidad para resistir una hinchazón en una solución baja en sal.

Este examen se realiza si el paciente tiene signos o síntomas de hemoglobinuria paroxística


nocturna (HPN) o anemia hemolítica de origen desconocido. Es muy probable que los glóbulos
rojos en la HPN resulten dañados por parte del sistema de complemento del cuerpo.

MÉTODO
Identificación visual de la hemólisis. Los glóbulos rojos son incubados en una solución isotónica de
sacarosa con una fuerza iónica baja que aumenta la unión del complemento. Si los eritrocitos son
anormalmente sensibles al complemento, como en el caso de la PNH (hemoglobinuria paroxística
nocturna), ocurre lisis después de 30 minutos de incubación.

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INTERPRETACIÓN:

 Negativo: descomposición de glóbulos rojos (hemólisis) de menos del 5%


 Positivo: hemólisis de más del 10%

Un examen negativo no descarta una HPN. Se pueden presentar resultados falsos negativos si la
parte líquida de la sangre (suero) carece de complemento.

Significado de los resultados anormales

 Hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN)


 La anemia hemolítica autoinmunitaria y la leucemia pueden dar resultados falsos
positivos

LIMITACIONES
Resultados falsos-positivos pueden observarse en casos de anemia megaloblástica o anemias
hemolíticas autoinmunes. Resultados falsos-negativos pueden ocurrir con el uso de
anticoagulantes como el EDTA o la heparina.

CITOMETRÍA DE FLUJO

Se trata de un método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias y la


dispersión de luz de células o partículas microscópicas, alineadas secuencialmente mediante una
corriente líquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad (hasta miles
de células/segundo) frente a un haz de luz láser de longitud de onda adecuada.

PARÁMETROS 
Características Morfológicas  de la célula: tamaño y complejidad del citoplasma 

Características antigénicas  de la célula: Inmunofenotipo.

PARÁMETROS FÍSICOS

 Su tamaño relativo
 Su granularidad relativa o complejidad interna

COMPONENTES

SISTEMA HIDRAÚLICO: Controles neumático y fluidos para establecer un flujo laminar que permita
a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo. 

SISTEMA ÓPTICO: Láser (Argón con luz monocromática de 488nm) , filtros , lentes y detectores. 

SISTEMA ELECTROINFORMÁTICO: Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para


su análisis.

REALIZACIÓN DE CITOMETRIA DE FLUJO

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Se hace en 3 etapas independientes:

1. Fase pre-citometría: preparación de los reactivos, preparación de las células, diseño del
protocolo y coloración de las células con los reactivos fluorescentes.

2. Fase de citometría de flujo: involucra el procesamiento de las células marcadas y la


recolección de los datos para cada una de las medidas (parámetros) realizados en cada
célula individual.

3. Fase de análisis: análisis de los datos recolectados

La mezcla de células teñidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a través de una aguja
creando una delgada fila de líquido que contiene las células. A medida que cada célula pasa en
frente del láser, desvía el rayo incidente y las moléculas teñidas unidas a la célula van a ser
excitadas y emiten luz fluorescente. Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las
emisiones fluorescentes, la información es digitalizada y procesada por el computador. Los
resultados son presentados a manera de histogramas.

APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

 Hematología: tipificación y conteo de células, reticulocitos y análisis de medula ósea.


 Farmacología :estudios de cinética celular
 Inmunología :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular
 Oncología : diagnóstico y pronostico ,monitores de tratamientos
 Microbiología :diagnostico bacteriano y vírico ,estudios de sensibilidad a los antibióticos
 Genética: Cariotipo y diagnóstico de portador y diagnóstico prenatal.

BIBLIOGRAFÍA:

 http://www.lablasamericas.com.co/site/index.php/examen/prueba_de_ham/

 https://www.clinicadam.com/salud/5/003672.html

 http://www.lablasamericas.com.co/site/index.php/seccion/view/quimica_general/exame
nes/Q01/P900

 https://www.clinicadam.com/salud/5/003673.html

 http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/citome
tria.htm

 http://www.uv.es/cytomics/Intro-CMF.pdf