Que es HPLC?

Principios básicos
Unidad de inyección de muestra (inyector)
● Requisitos de desempeño
❖ Que no quede ninguna muestra restante en la unidad
❖ Ampliación mínima de la banda de muestra
❖ Ajuste libre del volumen de inyección
❖ Pérdida mínima de muestra
❖ Mayor durabilidad y resistencia a la presión
 Inyector manual
De la bomba

A la columna
Posición de carga

De la bomba

A la columna
Posición de inyección
 Inyector manual
Principio de funcionamiento de la inyección de muestra
 Inyector automático
(Método de inyección a presión)
 Inyector automático
(Método de inyección de volumen total)
 Horno de columna
● Tipo de calefacción de circulación de aire
● Tipo de calefacción de bloque
● Calentador de bloque de aluminio
● Tipo de chaqueta de columna aislada
● Baño de agua
Tubos y preparación para la entrega de disolventes

Antes del Análisis

Tubería
❖ Material O.D. (diámetro externo)
● 1.6 mm
● Acero inoxidable I.D. (diámetro interno)
(SUS)
● 0.1 mm
● PEEK (poliéter éter
cetona) ● 0.3 mm
● Fluororresina ● 0.5 mm
● 0.8 mm etc.
Conectores
Número de plato teórico, N
Evaluación de la Eficiencia de la Columna Basada en el
Número de la Plato Teórico

grande pequeño
grande

pequeño
Factor de separación, a
Resolución, RS
Resolución necesaria para la separación completa
Relación entre la resolución y otros parámetros
Contribución del Factor de Capacidad a la Resolución
Contribución del Número de Platos Teóricos en la Resolución
Para mejorar la separación ...
Solución tampón de pH usada para eluyente

Selección y preparación de la solución

tampón
Equilibrio de disociación ácida
Constante de disociación ácida y razón de abundancia basado en el pH

es definido como sigue:

Preparación pH de la solución de Buffer
Soluciones tampón usadas para eluyente de HPLC
Características de la solución Buffer de fosfato
Cromatografía de fase inversa, Parte 2

Consideración de las condiciones analíticas

Directrices para establecer las condiciones de fase móvil :
(1) - Sustancias neutras (no iónicas)
pH del eluyente y Retención de solutos iónicos
Directrices para establecer las condiciones de fase móvil :
(2)-Sustancias Ácidas (Aniónicas)
Análisis de Sustancias Básicas (1) Problemas encontrados con eluyentes
alcalinos
Análisis de Sustancias Básicas (2) Influencia de grupos residuales de
silanol
Análisis de Sustancias Básicas (3) Adición de Perclorato de Sodio
Directrices para establecer las condiciones de la fase móvil (3)
Sustancias básicas (sustancias catiónicas)
Cromatografía de pares de iones en fase inversa
Reactivos representativos de pares de iones
Puntos a tener en cuenta sobre el uso de pares de iones
 Modos de Separación en HPLC

Otros modos de separación en la cromatografía de fase inversa

Modos de Separación en HPLC
Cromatografía de Adsorción
Cromatografía de partición

● Un líquido (o una sustancia considerada como un líquido)

se utiliza como la fase estacionaria, y el soluto se separa
de acuerdo a si se disuelve más fácilmente en la fase
estacionaria o móvil.
● La cromatografía líquida-líquida
Fase normal y fase inversa
Fase sólida Fase móvil

Fase normal Alta polaridad Baja polaridad

(Hidrófilo) (hidrofóbico)

Fase inversa Baja polaridad Alta polaridad

(hidrofóbico) (Hidrófilo)
Cromatografía de Fase Normal (Partición)
● La cromatografía de partición en la que la fase
estacionaria tiene una alta polaridad (hidrófila) y la fase
móvil tiene una baja polaridad (hidrófoba)
● Basado esencialmente en el mismo mecanismo de
separación que la cromatografía de adsorción en la que la
fase estacionaria tiene una base hidrófila, tal como gel de
sílice
Invención de la Cromatografía por M. Tswett
Fase estacionaria y fase móvil utilizada en el modo de fase
normal
● Fase estacionaria
❖ Gel de sílice: -Si-OH
❖ Tipo Cyano:-Si-CH2CH2CH2CN
❖ Tipo de aminoácido: -Si-CH2CH2CH2NH2
❖ Tipo diol: -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2OH
● Fase móvil
❖ Disolventes básicos: Hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos
aromáticos, etc.
❖ Disolventes adicionales: Alcoholes, éteres, etc.
Relación entre el enlace de hidrógeno y el tiempo de
retención en el modo de fase normal
Relación entre la polaridad del eluyente y el tiempo de
retención en el modo de fase normal
Comparación de la fase normal y la fase inversa
● Fase Normal
❖ Eficaz para la separación de
isómeros estructurales
❖ Ofrece selectividad de
separación no disponible con
fase inversa
❖ Se estabiliza lentamente y es
propenso a las fluctuaciones
en el tiempo de retención
❖ Los eluyentes son caros
● Fase invertida
❖ Amplia gama de aplicaciones
❖ Eficaz para la separación de
homólogos
❖ La fase estacionaria tiene
una larga vida útil
❖ Se estabiliza rápidamente
❖ Los eluyentes son baratos y
fáciles de usar
Cromatografía de intercambio de iones
Fase estacionaria utilizada en el modo de intercambio de
iones
● Material de base
❖ La resina se utiliza a menudo.
❖ También se utiliza gel de sílice.
● Columna de intercambio de cationes
❖ El intercambio catiónico fuerte (SCX) - SO3-
❖ Semana de intercambio catiónico (WCX) - COO-
● Columna de intercambio de aniones
❖ Intercambio fuerte de aniones (SAX) -NR3 +
❖ Intercambio semanal de aniones (WAX) -NHR2 +
Dependencia de la capacidad de intercambio del
intercambiador de iones a pH del eluyente
Relación entre el tiempo de retención y la concentración de sal del
eluyente en el modo de intercambio iónico
Cromatografía de exclusión de iones
Cromatografía de exclusión de tamaño

● La separación se basa en el tamaño (voluminosidad) de las

moléculas.
● ¡El nombre varía según el campo de aplicación!
❖ Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC)
❖ La cromatografía de permeación en gel (GPC)
★ Campos de la industria química, polímeros sintéticos, sistemas no acuosos
❖ Cromatografía de filtración en gel (GFC)
★ Campos bioquímicos, macromoléculas biológicas, sistemas acuosos
Principio del modo de exclusión de tamaño
Relación entre el peso molecular y el tiempo de retención en
el modo de exclusión de tamaño
Creación de una curva de calibración de peso molecular
Cálculo de pesos moleculares
Directrices para seleccionar el modo de
separación (1) Información requerida
Directrices para seleccionar el modo de separación (2)
Política básica
 Hardware HPLC: Parte 2
Detectores y sus rangos de aplicación
Requisitos de condición de detección
Detectores de HPLC representativos
Detector de Absorbancia UV-VIS
Sistema Óptico de Detector de Absorbancia UV-VIS
Espectro y selección de la longitud de onda de detección
Sistema óptico del detector de la matriz del fotodiodo
Datos obtenidos con un detector de matrices de fotodiodos
Ventajas de los detectores de fotodiodos
● Identificación de picos utilizando espectros
○ Complementación de la identificación basada en el tiempo de retención
○ Búsquedas en la biblioteca
● Evaluación de la pureza máxima
○ Evaluación de pureza realizada por comparación de la forma de los
espectros desde el punto de inicio de detección de pico hasta el punto
final de detección de pico
Detector de Fluorescencia

Longitud de onda de
excitación Estado excitado
Estado cuasi excitado

FLUORESCENCIA

Longitud de onda de
fluorescencia Estado Basal
Sistema óptico de detector de fluorescencia

Lampara de Xenon Rejilla de

fluorescencia

Tubo fotomultiplicador

Fluorescencia

Rejilla de Luz de
excitación Celda de la muestra
excitación
Reactivos de Derivatización de Fluorescencia
Reactivo OPA (Reacciona con las aminas primarias)

O - ftalaldehído
(OPA)

Reactivo ADAM (Reacciona con ácidos grasos)

9-antrildiazometano
(ADÁN)
Detector de índice de refracción diferencial (tipo de deflexión)
Unidad receptora de luz

Celda de
referencia

Luz

Celda de
muestra
Sistema óptico de detector de índice de refracción diferencial (tipo de
deflexión)

Hendidura Lámpara de
Tungsteno W

celda de
referencia
celda de la
muestra La imagen de hendidura se
mueve si cambia el índice
de refracción dentro de la
célula de flujo.

Fotodiodo
Sustancias que no deben ser inyectadas en la
columna

● Sustancias Insolubles (por ejemplo,

partículas microscópicas y precipitación)
● Sustancias que precipitan en el eluyente.
● Sustancias que se adsorben
irreversiblemente al material de embalaje.
● Sustancias que se disuelven o reaccionan
químicamente con el material de embalaje
 Filtración y separación centrífuga
● Filtrar cada muestra antes de
la inyección.
● Es conveniente utilizar un
filtro desechable con un
diámetro de poro de aprox.
0,45 μm.
● La separación centrífuga es Filtro Jeringa
aplicable para muestras que
son difíciles de filtrar.
Desproteinización

● Precipitación
- La adición de disolvente orgánico (por
ejemplo, acetonitrilo)
- La adición de ácido (por ejemplo, ácido
tricloroacético, ácido perclórico)
- Adición de metal pesado o sal neutra
● Ultrafiltración
Extracción en fase sólida

Acondicionamiento Adición de Muestra Enjuague Elución

Disolvente
con baja
fuerza de
elución

Disolvente
con alta
fuerza de
elución

Componente
objetivo

Componentes
no deseados
Derivación de la precolumna
- Reactivo OPA (Reacciona con aminas primarias)

orto-ftalaldehído
(OPA)

- Reactivo OPA (Reacciona con aldehídos y cetonas)

2, 4-Dinitrofenilhidrazina
(2, 4 - DNPH)
Evaluación de la Fiabilidad
del Análisis

Validación de métodos analíticos

 ¿Qué es "validación de métodos analíticos"?

● Demostración científica de ● Características de

que los métodos analíticos Validación
coinciden con el propósito ○ Exactitud / fidelidad
previsto (es decir, que los ○ Precisión
errores están dentro de un ○ Especificidad
○ Límite de detección
intervalo permisible) ○ Límite de cuantificación
● Evaluación de los ○ Linealidad
elementos requeridos de ○ Distancia
las características de ○ (Robustez)
validación.
Exactitud
● Definición ● Método de Evaluación
○ Grado de sesgo en las mediciones
○ Comparación con valores
obtenidas con procedimientos
analíticos.
teóricos (o valores
○ Diferencia entre el valor verdadero y autenticados)
el gran promedio de mediciones ○ Comparación con los
resultados obtenidos
Valor Verdadero utilizando otros
procedimientos analíticos
para los cuales se conoce la
exactitud (veracidad)
○ Prueba de recuperación
medición

Promedio Intervalo de confianza

 Precisión

● Definición ● Repetibilidad/ Precisión

○ Grado de coincidencia de series
de mediciones obtenidas
analizando repetidamente
múltiples muestras tomadas de
una sustancia de ensayo
homogénea.
○ Variación, desviación estándar o
desviación estándar relativa de
las mediciones.
intra-ensayo
○ Precisión de las mediciones
realizadas en un corto período de
tiempo en las mismas condiciones.
● Precisión intermedia
● Reproducibilidad
 Especificidad

● Definición ● Método de Evaluación

○ La capacidad de analizar con ○ Confirmación de que la
precisión la sustancia objetivo sustancia objetivo puede ser
en presencia de otras discriminada (separada) de los
sustancias esperadas componentes existentes,
○ La capacidad de discriminación sustancias relacionadas,
productos de descomposición,
de los métodos analíticos.
etc.
○ Pueden combinarse ○ Si no se pueden obtener
procedimientos analíticos patrones de referencia para las
múltiples para alcanzar el nivel impurezas, se comparan los
requerido de discriminación. resultados de la medición de
las muestras que se cree que
contienen las impurezas.
 Límite de Detección
● Definición
○ La cantidad mínima de una
sustancia objetivo que puede
ser detectada.
○ La cuantificación no es
absolutamente necesaria.
● Método de Evaluación
○ Calculado a partir de la
desviación estándar de las
mediciones y la pendiente de la
curva de calibración.
■ QL=3.3 σ/pendiente
(σ: Desviación estándar de las
muestras)
(pendiente: de la curva de
calibración)
○ Calculado a partir de la relación
señal-ruido.
■ Concentración para la
cual S/N = 3 o 2
 Límite de Cuantificación
● Definición
○ La cantidad mínima de una
sustancia objetivo que puede
cuantificarse.
○ La cuantificación con un nivel
apropiado de exactitud y ■ QL=10 σ/pendiente
precisión debe ser posible. (En
general, la desviación estándar
relativa no debe superar el
10%.)
● Método de Evaluación
○ Calculado a partir de la
desviación estándar de las
mediciones y la pendiente de la
curva de calibración.
(σ: Desviación estándar de las
muestras)
(pendiente: de la curva de
calibración)
○ Calculado a partir de la relación
señal-ruido.
■ Concentración para la
cual S/N = 10
 Linealidad
● Definición
○ Capacidad del método analítico
para producir mediciones para la
cantidad de una sustancia diana
que satisface una relación lineal.
○ Pueden utilizarse los valores
producidos mediante la
conversión de cantidades o
mediciones de la sustancia
objetivo utilizando una fórmula
definida con precisión.
● Método de Evaluación
○ Se analizan repetidamente
muestras que contienen diferentes
cantidades de la sustancia diana
(usualmente 5 concentraciones), y
se obtienen ecuaciones de
regresión y coeficientes de
correlación.
○ Se representan los residuos
obtenidos de las ecuaciones de
regresión de las mediciones y se
confirma que no existe una
pendiente específica.
Rango
● Definición
○ La región entre los límites
inferior y superior de la
cantidad de una sustancia
objetivo que proporciona los
niveles adecuados de
exactitud y precisión.
● Método de Evaluación
○ La precisión, la precisión y la
linealidad se investigan en
muestras que contienen
cantidades de una sustancia
objetivo que corresponden al
límite inferior, al límite superior
y al centro aproximado del
rango.
Robustez
● Definición ● Método de Evaluación
○ La capacidad de un ○ Se cambian algunos o
procedimiento analítico todos los factores variables
para permanecer no (es decir, las condiciones
afectada por pequeños analíticas) y se evalúan los
cambios en las condiciones efectos.
analíticas.
Mantenimiento de la columna de separación

Ampliación de la vida útil de la columna

Materiales de Embalaje Basados en Sílice y
Materiales de Embalaje Basados en Resina

Base de Sílice Base de Resina

Rango de pH 2 - 7.5 Generalmente un gran rango

Solvente Orgánico Sin Restricciones Restricciones Significativas

Resistencia a la 25 MPa máx. Baja resistencia a la presión

Presión

Temperatura 60°C máx Depende del material de

embalaje
Manejo General de las Columnas
● Observe las restricciones
relacionadas con los disolventes
y el rango de pH.
● Nunca permita que el material
de embalaje se seque.
● No permita que partículas
sólidas o microscópicas entren
en la columna.
○ Filtrar las muestras
● Utilice la presión de carga más
baja posible.
○ No exceda el límite superior de
presión.
○ No someta la columna a cambios
bruscos de presión.
● No someta la columna a golpes
intensos.
Problemas típicos
(1) Colocación de la columna
● Mediciones Preventivas
○ Filtrar las muestras.
○ Verificar que las muestras
se disuelven en el eluyente.
○ Adquiera el hábito de
observar los valores de
presión.
● Acciones Correctivas
○ Compruebe si hay
obstrucciones en otras partes
distintas de la columna.
○ Enjuagar con un disolvente
apropiado.
○ Conecte la columna a la inversa
y limpie las sustancias
insolubles a un caudal bajo.
○ Abra el extremo de la columna
y realice la limpieza ultrasónica
del filtro.
Problemas típicos
(2) Deformación del Pico

Causa Acción Correctiva

Sobrecarga de Muestra Reducir el volumen o la concentración de

inyección de la muestra.

Solvente de muestra inapropiado Sustituir el disolvente de la muestra por

uno de una baja capacidad de elución.

Suciedad Enjuagar la columna

Espacio en la entrada de la columna Repare la columna añadiéndola con

material de embalaje.

Influencia de los efectos de retención Enjuagar la columna

secundarios Sustituya la columna por una que esté
influenciada mínimamente.
Problemas típicos
(3) Disminución en el tiempo de retención

● Compruebe si la causa del ● Si la columna se identifica

problema no es la columna. como la causa …
○ Composición del Eluyente. ○ Enjuague
○ Caudal del Eluyente. ○ Reemplace
○ Temperatura de la
columna.
Problemas típicos
(4) Desvío de la línea base

● Compruebe si la causa del ● Si la columna se identifica

problema no es la columna. como la causa …
○ Si el problema persiste ○ Enjuague
cuando se retira la ○ Revisión del control de
columna, es causada por temperatura
el eluyente, el sistema de ○ Reemplace
suministro de disolvente
(bomba o desgasificador) o
el detector.
Columna de protección y pre-columna

Columna de Protección

Pre-columna
Enjuague de la columna
● Utilizar un eluyente con una alta capacidad de elución
○ Modo de fase inversa: Solución con una alta proporción de disolvente
orgánico
○ Modo de intercambio de iones: Solución con una alta concentración
de sal
● Considere los efectos secundarios de retención
○ Para eliminar sustancias básicas de una columna de fase inversa ￫
Utilice una solución ácida y añade un reactivo de pares de iones.
○ Para eliminar sustancias hidrófobas de una columna de intercambio
iónico ￫ Agregar un disolvente orgánico.
Comprobación del rendimiento de la columna
Manejo General de las Columnas
● Almacenamiento de columnas
○ En general, es seguro utilizar la
misma solución de
almacenamiento que se utiliza
en el envío.
○ Para evitar la putrefacción, se
puede añadir alcohol o alguna
otra sustancia conservadora.
● Condiciones de almacenamiento
○ Insertar un tapón hermético en el
extremo de la columna. Nunca permita
que el material de embalaje se seque.
○ Registre la solución de
almacenamiento y las condiciones de
uso finales y guárdalas junto con la
columna.
○ Guarde la columna en un lugar que no
esté sujeto a golpes o cambios bruscos
de temperatura.