PRACTICA 15.

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
AISLADOS DURANTE EL SEMESTRE.

Jesús Duarte Espinoza

OBJETIVOS:

Aplicar los conocimientos adquiridos durante el semestre, para la identificación de cepas

bacterianas que se han aislado a lo largo del curso.

FUNDAMENTO. La gran diversidad metabólica que existe entre los microorganismos, incluso entre
algunos muy cercanos filogenéticamente, permite la realización de los ciclos bioquímicos. Sin la
intervención de los microorganismos no podrían llevarse a cabo los ciclos del carbono, nitrógeno,
azufre y oxígeno y la atmósfera de la tierra tendría una composición gaseosa muy diferente a la actual.
La composición y cantidad “anormal” (en cuanto a que están alejados del equilibrio termodinámico) de
los gases O2, N2, CO2, H2 y CH4 de la atmósfera actual solo se puede explicar por la actividad constante
de los seres vivos y en particular de los microorganismos procarióticos, entre los que se encuentra la
mayor diversidad de actividades metabólicas, incluyendo varias reacciones únicas entre los seres
vivos.
Para que una célula crezca debe satisfacer todos sus requerimientos nutricionales a partir del
medio que los rodea. Las fuentes a partir de las cuales las células satisfacen algunos de estos
requerimientos nos permite clasificarlas fisiológicamente

Cada tipo de microorganismos tiene características muy peculiares, y esto ha ayudado a

identificarlos y a clasificarlos, lo cual no ha sido una tarea sencilla, pues la lista de identificación
de estos es increíblemente extensa y cada día se encuentran más microorganismos en el
planeta, incluso no se descarta la posibilidad de encontrar estas pequeñas formas de vida en
otros planetas.

MATERIAL:
• Cultivos bacterianos aislados durante el semestre, los cuales han sido conservados en agar nutritivo inclinado.
• Resultados previos de morfología, características de cultivo y pruebas bioquímicas obtenidos en las Prácticas 4,
9 y 10 de este curso.

METODOS:
1. En las tablas o formatos adjuntos indique las características microbianas que se solicitan.
2. Con estas características, consulte la bibliografía indicada y determine el género y la especie del
microorganismo aislado.
RESULTADOS:
En las siguientes tablas indique las características del microorganismo que se piden y la identificación a la
que llegó:

Jesús Duarte Espinoza No identificado

Equipo 1 Baños de Hombre/M200

Cocos
Racimos Irregulares
+
1.2 micrómetros
+
No +
Positiva
+
No
No
N/A
-
-
Bacteriana /////////////
4.5mm ////////////
Amarillo crema
-
Redonda -
Suaves -
Convexa
-Mucoide
-Translucida/brillante -
--- (+)

1:20 minutos.
Resultado:
En esta prueba problema, el resultado fue inconcluso por falta de pruebas realizadas a la muestra problema,
pero llegamos a la conclusión de que es una bacteria del género staphilococcus, sin identificar la especie.
 .
Microorganismo Crecimiento1 Hidrólisis2
48 h 72 h 48 h 72 h
+ + - -
Muestra problema
1 relativo, medido en cruces; 2 positiva = +, negativa = -.
Hidrólisis de gelatina en placa.
Crecimiento1 Hidrólisis2
Microorganismo 48 h 72 h 48 h 72 h
+ + - -
Muestra problema
1 relativo, medido en cruces; 2 positiva = +, negativa = -.
Hidrólisis de almidón y caseína en placa.
Hidrólisis2
Microorganismo Crecimiento 1
Almidón Caseína
+ - +
Muestra problema
1 relativo, medido en cruces; 2 positiva = +, negativa = -.

Hidrólisis de fosfolípidos.
Microorganismo Crecimiento1 Hidrólisis2
A. yema de huevo Agar sangre A. yema de huevo Agar sangre
Muestra problema + + - -
1 relativo, medido en cruces; 2 positiva = +, negativa = -.
 Fermentación de lactosa.
Microorganismo Crecimiento1 Fermentación2
Muestra problema - -
1 relativo, medido en cruces; 2 positiva = +, negativa = -.

Acción sobre leche tornasolada.

Microorganismo acidificación coagulación reducción licuefacción alcalinización
- + - - +
Muestra
problema
positiva = +, negativa = -.

1. Haga esquemas a color de los diferentes medios con resultados de pruebas positivas y
negativas.

Imagen 1. Hidrólisis (-) de gelatina en tubo. Imagen 2. Hidrólisis (-) de gelatina en placa.

Imagen 3. Hidrólisis (+) de caseína en placa. Imagen 4. Hidrólisis (-) de almidón en placa.
 Imagen 4. Hidrólisis (-) de fosfolípidos, agar yema de huevo
Imagen 5. Hidrólisis (-) de fosfolípidos, agar sangre

Imagen 6. Fermentación (-) de lactosa Imagen 7. Digestión de proteínas y fermentación sobre leche tornasolada
 CUESTIONARIO I
Investigue las respuestas para las preguntas siguientes y con ellas redacte un párrafo a manera
de discusión. No olvide escribir la bibliografía consultada.

Los microorganismos requieren medios y condiciones específicas para poder sobrevivir. Tales cómo el
requerimiento nutricional, que están dados por la composición química de las células que los constituyen,
reflejan el ambiente natural en que viven y son las características que se necesitan para que el
microorganismo pueda crecer en un ambiente determinado. Luego tenemos al factor de crecimiento, que
consiste en un compuesto orgánico que debe tener una célula para poder crecer, pero que es incapaz de
sintetizar. Estos pueden ser vitaminas, aminoácidos, bases púricas, bases pirimidinas, ácidos grasos y
carbohidratos, estas sustancias que ayudaran a enriquecer el medio. El término hidrolítico o hidrólisis se
refiere al rompimiento de las moléculas de agua o la separación mediante ella.

Otra característica que tomar en cuenta es su manera de respirar. Están los microorganismos autótrofos, que
usan CO2 y carbonatos. Por otra parte, están los microorganismos auxótrofo, que son aquellos que requieren,
de uno o más nutrientes orgánicos, además de la principal fuente de carbono. Y también están los
heterótrofos, que son aquellos que utilizan compuestos orgánicos para vivir.

Hay algunas enzimas que son capaces de degradar proteínas tales cómo las proteasas, las que se encargan de
romper polisacáridos se conocen cómo glicosilasas y las que se encargan de degradar los lípidos se conocen
cómo lipasas. Un polisacárido estructural lo constituye la celulosa, un ejemplo de un polisacárido nutricional
es el almidón. En el caso de la caseína, es una proteína de origen animal (es decir, una fosfoproteína) y la
gelatina de origen animal. Cuando se lleva a cabo la descomposición de los alimentos por degradación de
triglicéridos provoca en estos la hipertrigliceridemia.

Es falso que muchas enzimas extracelulares son hidrolíticas, pero no todas las enzimas hidrolíticas son
extracelulares. Otro dato falso es que las glicosidasas hidrolizan enlaces éster en los polisacáridos. En
cambio, es verdadero que las peptidasas son enzimas extracelulares que hidrolizan proteínas de alto peso
molecular exclusivamente. También, las membranas biológicas son sensibles a las lipasas.
 PRACTICA 10
METABOLISMO BACTERIANO
Parte II
Utilización de carbohidratos y ácidos orgánicos

OBJETIVO II
El alumno realizará pruebas bioquímicas para determinar la habilidad de los microorganismos para
degradar y fermentar carbohidratos con la producción de un ácido o un ácido y gas.

FUNDAMENTO. El metabolismo es la suma de todos los procesos químicos que ocurren dentro de
un individuo y para su estudio se divide en anabolismo y catabolismo. En el primero se analizan las
reacciones bioquímicas que suceden en la célula para formar macromoléculas y el segundo representa
las reacciones que están involucradas en la conversión de sustratos a formas más simples y,
generalmente, más oxidadas con lo que se obtiene la energía requerida por el anabolismo.

Los tres principales procesos que conducen a la obtención de energía y su conversión en ATP
son: la fermentación, en la cual se obtiene ATP por fosforilación a nivel de sustrato, la respiración,
donde el ATP se obtiene por fosforilación oxidativa y la fotosíntesis, donde se forma ATP por
fotofosforilación.

La fermentación es un proceso anaeróbico en el cual tanto los donadores como los aceptores
de electrones son compuestos orgánicos, aminoácidos y otros más. Existen varios tipos de
fermentaciones efectuadas por microorganismos. Los productos de la fermentación de carbohidratos
son principalmente ácidos orgánicos, alcoholes, cetonas y CO2.

Tipos de fermentaciones y microorganismos que las realizan

Tipo de fermentación Productos principales Microorganismos
Alcohólica Etanol y CO2 Algunas levaduras y Zymomonas
Homoláctica Ácido láctico Lactobacillus y Streptococcus
Heteroláctica Ácido láctico, etanol y CO2 Lactobacillus, Leuconostoc
Ácido mixta 2,3-butanodiol, butanol, succinato, Shigella, Salmonella, Klebsiella,
lactato, acetato, formiato, H2 y CO2 Escherichia coli
Butírica Butirato, acetato, H 2 y CO2
Clostridium butyricum
Propiónica Propionato, acetato, CO2 Propionibacterium, Clostridium
propionicum
Acética Acetato Clostridium aceticum,
Acetobacterium.
DESARROLLO

MATERIAL II
 2 Tubos de 13 mm X 100 mm con 3 ml de caldo glucosado;
 1 Tubo de 13 mm X 100 mm con 3 ml de caldo malonato;
 1 Tubo de 13 mm X 100 mm con campana de Durham, con 3 ml de caldo base, rojo de fenol
y glucosa, otro con sacarosa y otro con manitol;
 1 Tubo de 13 mm X 100 mm con medio inclinado de Kligler;
 1 Tubo de 13 mm X 100 mm con medio inclinado de citrato de Simmons;
 Reactivo indicador rojo de metilo;
 Reactivo de KOH-creatina;
 Reactivo de -naftol;
 Cepas problema.

Notas importantes
Vires de los indicadores de pH de los medios usados en esta práctica:

Rojo de fenol:
pH 6.8 ácido, color amarillo
pH 7.4 ligeramente alcalino, color anaranjado
pH 8.4 alcalino, color rojo

Rojo de metilo:
pH 4.4 ácido, color rojo
pH 6 ácido color amarillo

Azul de bromotimol:
pH 6.0, color amarillo
pH 6.9, color verde
pH 7.6 color azul.

No todas las pruebas bioquímicas se incuban durante 24 h (para conocer los fundamentos, detalles
bioquímicos, de incubación, formas de interpretación, etc., deben consultarse las referencias de
la bibliografía) es necesario considerar que hay microorganismos de crecimiento lento que
requieren incubaciones más prolongadas y que hay algunos incapaces de crecer en los medios de
cultivo de las pruebas.

METODOS II
Fermentación de carbohidratos en tubos de Durham
1. Inocule con una asada de cada microorganismo los tubos de Durham con el caldo rojo de
fenol diferentes (glucosa, sacarosa y manitol). Tenga cuidado de no agitar el tubo de
fermentación.
 2. Incube a 37º C por 24 h. Es importante no
sobreincubar los tubos debido a que se
puede provocar una confusión al momento de
hacer la lectura debido a fenómenos de
alcalinización del medio por acumulación de
amonio.
3. Observe el resultado indicando para cada una
de las cepas utilizadas con los diferentes
carbohidratos lo siguiente:
Producción de ácido: la prueba es positiva
si el indicador vira a amarillo y negativa si no
hay viraje.
Producción de gas: la prueba es positiva si se Figura 11. Resultados (glucosa) de izquierda a derecha: producción de ácid
forma una burbuja que desplaza el líquido
dentro de la campana y negativa si el tubo o
campana continúa lleno de líquido.
4. Registre los resultados.

Fermentación de carbohidratos en medio de Kligler

1. Inocula por picadura y en la superficie de los tubos de
Kligler cada una de las cepas indicadas.
2. Incuba los tubos a 37º C por 24 h
3. Observa y registra el resultado, interpreta como sigue:
Fermentación de glucosa: viraje del indicador a
amarillo en la superficie del tubo.
Producción de gas: formación de burbujas en el medio
de cultivo
Producción de H2S: formación de un precipitado negro
en el tubo de cultivo
Alcalinización: el indicador toma un color de rojo hacia Figura 12. Resultados KIA inclinado de izquierda a derecha:
superficie alcalina/ fondo del tubo ácido (K/A); superficie
púrpura. alcalina/sin cambio en el fondo del tubo (K/NC); control sin
inocular; superficie del tubo alcalina/ ácido en el fondo del
tubo con presencia de ácido sulfhídrico (K/A, H2S); superficie
ácida/ fondo del tubo gas (A/A, G). (1)

Fermentación de carbohidratos. Pruebas de rojo de metilo y de Voges Proskauer

1. Inocule la cepa en dos tubos de caldo glucosado. Marque cada tubo como MR y VP
respectivamente.
2. Incube los tubos a 37º C por 24 h.
3. Añada al tubo marcado como MR, 5 gotas de reactivo de rojo de metilo sin agitar. La
presencia de un anillo rojo estable en la parte superior del tubo es una prueba positiva de
rojo de metilo. La prueba es negativa si no se forma el anillo rojo.
 4. Añada al tubo marcado como VP, 6 gotas de reactivo de -naftol y 2 gotas de KOH-creatina
y agita suavemente. Déjelo reposar de 20 min a 30 min. La prueba positiva de Voges
Proskauer se da por la aparición de un color rojo en el tubo (indica la producción de acetil-
metilcarbinol).

Figura 13. Prueba de rojo de metilo. El tubo de la izquierda es

MR-positivo. El tubo de la derecha es MR- negativo. (1)
Figura 14. Prueba Voges-Proskauer. El tubo de la izquierda es VP-negativo

Utilización de ácidos orgánicos

1. Siembra un tubo con agar-citrato de Simmons por estría abierta en la superficie y uno
de caldo malonato con una asada.
2. Incuba los tubos a 37º C por 24 h
3. Observa el resultado. La prueba es positiva cuando hay crecimiento y el color del indicador
vira a azul y negativa si no hay ninguna de estas señales.
4. Registra los resultados.

Figura 15. Prueba de citrato.

El tubo de la izquierda fue
inoculado con
un
microrganismo citrato positivo
(+) y el tubo del centro con un
microorganismo citrato
negativo (-). El tubo de la
derecha medio sin inocular.
(1)

Figura 16. Crecimiento en caldo malonato: malonato positivo (+) en

la izquierda, control sin inocular en el centro, y malonato negativo
(-) en la derecha. (1)
 RESULTADOS II
1. Anote en la siguiente tabla los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas en la
práctica.
Prueba Muestra problema
Glucosa Ácido +
Gas -
Durham Sacarosa Ácido -
Gas -
Manitol Ácido +
gas +
Glucosa +
Kligler Lactosa +
Gas -
H2 S -
RM -
Otras VP -
Citrato -
Malonato -
Prueba positiva = +, prueba negativa = -.

CUESTIONARIO II
Investigue las respuestas para las preguntas siguientes y con ellas redacte un párrafo a manera
de discusión. No olvide escribir la bibliografía consultada.

Las pruebas bioquímicas son una serie de pruebas para caracterizar bacterias desconocidas
según su metabolismo, sabiendo qué moléculas pueden degradar y cuales son los productos
resultantes de dichas vías, las pruebas de Durham, prueban la capacidad de las bacterias de
utilizar diferentes azúcares para fermentación , esto es detectable con un indicador de pH que
detecta la acidificación del medio como producto de la fermentación del azúcar dónde puede , o
no, haber producción de gas, esta acidificación es detectable por el viraje del color de tubo hacía
el color amarillo, estas pruebas son específicas al sólo utilizar un azúcar, de la misma forma
existen 2 pruebas que utilizan una sola fuente de carbono siendo la prueba de Citrato y Malonato,
estos utilizan un indicador de pH donde el pH alcalino indica una utilización del sustrato utilizado, el
Citrato es hidrolizado hasta ácido pirúvico y CO 2 éste último reacciona en el medio produciendo
agentes básicos como Na2CO3 , mientras que el malonato libera cationes que al combinarse con
agua alcalinizan el medio, ambas pruebas son positivas si el azul-bromotimol reaccciona
tornándose azúl . El mismo principio de observar si una bacteria puede fermentar una molécula
o no con un indicador del pH es replicado con diversas otras pruebas, la prueba de Kligler, es una
prueba que utiliza un mismo medio para probar diferentes interacciones a la vez, en este medio,
se encuentra glucosa a una baja cantidad, este azúcar es rápidamente consumida por bacterias lo
que hace que el medio se torne amarillo, al acabarse este azúcar la bactera buscara otro nutriente,
esta prueba contiene a su vez lactosa, en caso de que la bacteria también pueda fermentar esta
azúcar el medio permanecerá amarillo, en caso de que no pueda haber fermentación de lactosa
posterior la bacteria utilizará aminoácidos del medio cuya desaminación ocasionará la
alcalinización del medio , tornando la parte superior del tubo rojo, en caso de que no pueda
utilizar ni glucosa ni lactosa, utilizará de primera mano los aminoácidos manteniendo el medio
alcalino, asimismo también puede detectar la reducción de azufre produciendo H 2S que se
visualiza como un color negro en el tubo, cualquiera de estos procesos pueden producir gas que
se manifiesta como rupturas en el medio. Sabiendo que la bacteria puede utilizar ciertos azúcares
también se puede conocer la ruta utilizada para la utilización de estos azúcares la prueba MR-VP,
en este caldo con glucosa y buffer de fosfatos que debe realizarse en 2 tubos separados nos
indican si la glucosa fue fermentada, si se libera ácidos orgánicos como productos de la ruta el
Rojo de metilo agregado formará un anillo de color rojo en la superficie, en caso de que esto no
pase, se agregan 2 reactivos, a-naftol y KOH, a otro cultivo dónde la formación de un anillo café-
rojizo indica la presencia de acetoina un precursor del 2,3 butaendiol que representa la otra ruta
fermentativa de la glucosa a parte de la de los ácidos orgánicos.
 PRACTICA 10
METABOLISMO BACTERIANO
Parte III
Metabolismo de aminoácidos

OBJETIVO III
El alumno determinará la habilidad de los microorganismos para metabolizar aminoácidos mediante
pruebas bioquímicas.

FUNDAMENTO. Los microorganismos además de requerir una fuente de carbono y una

de energía, necesitan una fuente de nitrógeno para construir su propio material celular. Esta fuente
de nitrógeno puede ser orgánica (proteínas, aminoácidos, bases nitrogenadas), o bien inorgánica
(nitrógeno molecular, amonio, nitritos o nitratos). Dentro del metabolismo de los aminoácidos existen
algunas enzimas capaces de descarboxilar, desaminar y desulfurar aminoácidos o degradarlos
completamente. La presencia o ausencia de dichas enzimas son criterios de identificación.

La descarboxilación la sufren aminoácidos básicos como la lisina, ornitina y arginina y las

enzimas responsables se denominan descarboxilasas. El proceso es anaeróbico, irreversible y
requiere de un cofactor denominado fosfato de piridoxal.

Existen también las reacciones denominadas de desaminación. En el caso de la arginina, la

desaminación produce citrulina y amonio.

La degradación de aminoácidos tales como cisteína o metionina lleva a la producción de ácido

sulfhídrico. La enzima que libera el grupo sulfhidrico de estos aminoácidos se denominan cisteinasa y
metiona-reductasa respectivamente.

Nota: Todas las pruebas bioquímicas para ser validadas necesitan tener testigos apropiados. Estos
testigos son: a) un medio sin inocular e incubado bajo las mismas condiciones que los problemas, b)
un testigo positivo, que el mismo medio inoculado con una cepa de referencia que se conoce da
resultado positivo y c) un testigo negativo que es el mismo medio inoculado con una cepa la cual se
conoce da un resultado negativo.

DESARROLLO

MATERIAL III
 1 Tubo de 13 mm X 100 mm con caldo triptona;
 1 Tubo de 13 mm x 100 mm con medio SIM;
 1 Tubo de 13 mm X 100 mm con medio de LIA;
 Reactivo de Kovacs o Ehrlich;
 Papel tornasol rosa;
 Cepas problema.
.
METODOS III

Producción de ácido sulfhídrico e indol

1. Siembre por picadura en el medio de SIM la cepa indicada.
2. Incube los tubos a 28º C por 24 h.
3. Observe el resultado e interprete como sigue:
Producción de H2S: Presencia de un precipitado negro
Movilidad: turbidez en regiones alejadas de la picadura de inoculación.
Producción de indol: añadir de 3 gotas a 5 gotas del reactivo de Kovacs o Ehrlich. La
aparición de un color rojo en la superficie del medio indica una prueba positiva.
4. Registre los resultados.

Reducción de azufre: el organismo de la

izquierda el H2S negativo. El organismo de la
derecha es H2S positivo.
Prueba de indol: los tubos de SIM Movilidad en SIM: estos tubos de SIM
fueron inoculados con un organismo fueron inoculados con un organismo
indol negativo (-) en la izquierda y un móvil en la izquierda y un organismo
organismo indol positivo (+) en la no móvil en la derecha.
derecha.

Figura 17. Reacciones en el medio SIM. (1)

Producción de amoniaco e indol

1. Inocule con una asada los tubos de caldo triptona con cada una
de las cepas indicadas.
2. Coloque una tira de papel tornasol en la boca del tubo
sujetándolo con el tapón de algodón, sin que toque el medio de
cultivo.
3. Incube los tubos a 37º C durante 24 h.
4. Observe el vire del papel tornasol (de rosa a azul) que indica la
liberación de amoniaco.
5. Añada de 3 gotas a 5 gotas del reactivo de Kovacs o Ehrlich
como en la sección anterior.
6. Registre los resultados.

Figura 18. Caldo triptona. Producción de

indol sin reacción (izquierda) con
reacción (derecha). (5)
Producción de lisina-descarboxilasa
1. Inocule por picadura y estría un tubo con medio de LIA con cada una de las cepas indicadas.
2. Incube los tubos a 37º C por 24 h.
3. Interprete los resultados como sigue:
Descarboxilación positiva: color púrpura en el fondo del tubo.
Descarboxilación negativa: color amarillo en el fondo del tubo.
Desaminación positiva: color rojo naranja en la superficie del tubo.
Desaminación negativa: sin cambio de color en la superficie.
Producción de H2S: presencia de un precipitado negro.
4. Registre los resultados.

Figura 19. Resultados LIA, de izquierda a

derecha: (R/A); (K/A); H2S positivo - note la
formación de un pequeño precipitado negro
cerca de la mitad y la producción de gas por la
fermentación de glucosa en la base-; control sin
inocular; y (K/K) – oscurecido por el precipitado
negro H2S. (1)

RESULTADOS III
1. Registre los resultados obtenidos en las diferentes pruebas de metabolismo de aminoácidos
en la siguiente tabla:

Prueba Muestra problema

H2S -
SIM Indol -
Movilidad +
Caldo Amoniaco -
triptona Indol -
Decarboxilación +
LIA Desaminación -
H2S -
CUESTIONARIO III
Investigue las respuestas para las preguntas siguientes y con ellas redacte un párrafo a manera
de discusión. No olvide escribir la bibliografía consultada.

Existen ciertas pruebas bioquímicas donde se puede caracterizar varias

propiedades de la bacteria a la vez, por ejemplo, la prueba SIM cuyas siglas en
ingles indican que características fenotípicas de la bacteria resaltan, significando
azufre (S), indol (I) , movilidad(M), es una prueba que utiliza un medio diferencial
donde se evidencia la habilidad para reducir azufre hacia H 2S , lo cual se refleja
en la prueba al tornar el medio color crema a un color negro intenso, en caso de
no haber cambio de color en el medio, se prueba la producción de indol a partir de
aminoácidos al adicionar el reactivo de kovacs que se une al indol formando
rosindol evidenciándose como un anillo rojo, para la prueba de motilidad, se
observa turbidez alrededor de la estriada sólo con bacterias con cilios y flagelos
que tienen la capacidad de moverse. Otras pruebas bioquímicas donde varias
características fenotípicas se ven evidenciadas es en la prueba LIA, donde
también se mide la producción de H2S producto del citrato de amonio férrico y
tiosulfato de sodio, que otorgan la coloración negra característica, asimismo esta
prueba está diseñada para observar la acción de la prueba lisina descarboxilasa,
cuya acción se ve evidenciada por el pírpura de bromocresol el cual se torna
púrpura al alcalinizarse por el uso de la enzima, en caso de utilizar la enzima
lisina desaminasa el medio se tornará amarillo en el fondo y rojizo en la
superficie. El medio triptona es una prueba bioqúimica en caldo , donde se evalúa
la actividad de la enzima triptofanasa, esta triptofanasa utiliza como sustrato el
aminoácido triptófano del caldo degradándolo en ácido pirúvico e indol, la prueba
es positica para indol al ser detectado por el reactivo de kovacs al formar rosindol
de color rojo , mientras tanto la banda marcadora de pH de papel tornasol indica
la liberación de amoniaco producto de una desaminación.
 PRACTICA 10
METABOLISMO BACTERIANO
Parte IV
Respiración
OBJETIVO IV
El alumno determinará la habilidad de los microorganismos para obtener electrones por el proceso de
respiración con diferentes sustratos.

FUNDAMENTO.
La respiración es un proceso de fosforilación oxidativa, asociada a una cadena de electrones,
genera un gradiente electroquímico, el cual es utilizado por la ATP sintetasa para acoplar ATP.
La capacidad respiratoria se encuentra ampliamente distribuida entre los microorganismos.
Todos los eucariotes, con excepción del grupo de los microesporidios (únicos que no tienen
mitocondrias) tienen capacidad de respirar usando al oxígeno como aceptor final de electrones. Como
donadores de electrones usan compuestos orgánicos como el succinato, NADH y FADH que provienen
del metabolismo de azúcares o aminoácidos. El azul de metileno actúa como un aceptor artificial de
electrones el cual pasa de su forma oxidada (azul) a su forma reducida (incoloro) cuando se evita su
reoxidación por el oxígeno del aire, utilizando para este propósito una capa de aceite mineral.
Los procariotes, además de contar con respiración aeróbica, algunos grupos poseen también
la capacidad de respirar anaeróbicamente y pueden usar NO 3-, NO2-, (SO4)2-, CO2, Sº, Fe3+ o fumarato
como aceptores finales de electrones. Entre los procariotes litotróficos, los donadores de electrones
pueden ser moléculas orgánicas (como las ya descritas) o inorgánicas entre las que se
encuentran H2, H2S y NH3.

DESARROLLO

MATERIAL IV
 Cajas de Petri con agar nutritivo;
 4 Tubos de 16 mm X 150 mm estériles;
 1 Tubo de 13 mm X 100 mm con 3 ml de caldo nitrato;
 Micropipetas de 1000ly 200 l;
 Puntas estériles para micropipetas;
 Matraz Erlenmeyer con 30 ml de leche estéril con glucosa al 0,5%;
 Solución de azul de metileno al 0,1%;
 Aceite mineral estéril;
 Reactivo de ácido sulfanílico;
 Reactivo de α-naftil amina;
 Agua oxigenada al 10%;
 Reactivo de oxidasa;
 Tiras de papel filtro;
 Cepas problema.
METODOS IV

Reducción de azul de metileno

1. Marque una serie de tubos de 16 mm X 150 mm del 1 al 5.
2. Añada 0,5 ml de azul de metileno al matraz con leche.
3. Añada a cada tubo la leche, suspensión bacteriana y aceite, de acuerdo al orden que
se señala en la siguiente tabla:

Tubo 1 2 3 4 5
Leche estéril con azul de 4,5 ml 4,0 ml 3,5 ml 3,0 ml 2,5 ml
metileno
Suspensión bacteriana 0 0,5 ml 1,0 ml 1,5 ml 2,0 ml
Homogenizar suavemente el contenido de cada tubo
Adicionar aceite mineral 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Nota: la suspensión bacteriana en este primer método será proporcionada por el instructor.
4. Incube todos los tubos en baño maría a 37º C y anote el tiempo que tardan en decolorarse.
5. Anote los resultados.
Figura 20. Reducción de azul
de metileno. El tubo de la
izquierda es un control que
ilustra el color original del
medio oxidado. El tubo de la
derecha indica la reducción
bacteriana del azul de
metileno. La velocidad de
reducción está relacionada con
la concentración de
microrganismos presentes. (1)

Reducción de nitratos a nitritos

1. Siembre la cepa en caldo nitrato. Guarde un tubo sin inocular como testigo.
2. Incube a 37º C por 24 h.
3. Determine la presencia de nitritos añadiendo a cada tubo 3 gotas de -naftilamina y 3 gotas
de ácido sulfanílico.
4. Una coloración rojo ladrillo indica la presencia de nitritos (formación de un complejo
diazóico). Si no aparece coloración roja añadir un poco de zinc (granalla) y observar si
aparece color.
Crecimiento en caldo nitrato antes de la adición de
los reactivos. Tubos 1 a 5, de izquierda a derecha. El
tubo 2 es un control sin inocular usado para
comparación del color. Note la producción de gas en
el tubo 5, el gas producido es un indicador de la
desnitrificación y un resultado positivo. Se
adicionaron los reactivos a los tubos del 1 al 4. Ver
esquema a la derecha.
Después de la adición de los reactivos, el tubo 1
muestra un resultado positivo. Los tubos 3 y 4 son
inconclusos puesto que no muestran cambio de Después de los reactivos y el zinc. finalmente, una pizca de
color. El zinc el polvo debe ser adicionado a los
tubos 2 (control), 3 y 4 para verificar la presencia
o ausencia de nitrato. Ver esquema a la derecha.

Figura 21. Reducción de Nitratos a Nitritos. (1)

Pruebas de citocromo oxidasa y catalasa

1. Siembre en una caja de agar nutritivo por estría abierta las cepas indicadas.
2. Incube a 37º C por 24 h.
3. Para la prueba de la oxidasa, transfiera una asada de cada cepa a una tira de papel filtro.
Añada al papel una gota de reactivo de oxidasa, o aplique un disco que contenga el reactivo.
El sistema citocromo oxidasa se encuentra por lo general en organismos aerobios y los
hace capaces de utilizar el oxígeno como aceptor final de electrones y producir H 2O2. Los
microorganismos que poseen esta enzima, en presencia del O2 y del reactivo desarrollan
un complejo de color púrpura.
4. Después de tomar la muestra para la prueba de oxidasa, añada sobre el crecimiento de las
cepas, unas gotas de H2O2. La mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios
facultativos tienen una enzima llamada catalasa, la cual descompone el agua oxigenada,
evitando la acumulación de este metabolito tóxico. La aparición de burbujas en el cultivo,
después de la adición del reactivo, indica una prueba positiva.
 5. Registre los resultados.

Figura 23. Prueba de catalasa en portaobjetos. La

producción de burbujas visibles indica un resultado
positivo en la prueba de catalasa en portaobjetos. Un
organismo catalasa positivo está a la izquierda. Un
organismo catalasa negativo está a la derecha. (1)
Prueba de oxidasa sobre el crecimiento bacteriano. Unas pocas gotas de reactivo en bacterias oxidasa positivas producen un color azul púrpura inmediatam

Prueba de portaobjetos de oxidasa. Los resultados positivos con esta prueba deben aparecer dentro de l

Figura 22. Prueba de oxidasa. (1)

RESULTADOS IV
1. Registre los resultados obtenidos en las diferentes pruebas realizadas durante la práctica
en la siguiente tabla:

Prueba
Cepa Reducción de azul de Reducción de NO3- Oxidasa Catalasa
metileno (min)
K. pneumonie No estudiada ------------------- ------------------ ------------
E. coli No estudiada ------------------- ------------------ ------------
B. subtilis Positiva Positivo, al Positiva Positiva
1min. 45 segundos agregar zinc
Hubo cambio
de color.
S. aureus No estudiada ------------------ ------------
P. aeruginosa No estudiada ------------------- ------------------ ------------
P. vulgaris No estudiada ------------------- ------------------ ------------
Muestra problema -------------------
Prueba de nitratos Prueba de reducción de azul de metileno

Prueba Catalasa Prueba Oxidasa

CUESTIONARIO IV
Investigue las respuestas para las preguntas siguientes y con ellas redacte un párrafo a manera
de discusión. No olvide escribir la bibliografía consultada.

1. Indique las reacciones que se llevaron a cabo en cada una de las pruebas realizadas
 OBSERVACIONES DE LA PRÁCTICA COMPLETA
- En la prueba de citrato de Simmons aunque no hubiese un cambio en el color que indica
una fermentación del citrato, si hubo un crecimiento parcial, lo cual indica probablemente
que la bacteria utilizó la propia glucosa que estaba disponible.
- La prueba bioquímica del caldo MR-VP arrojó un resultado negativo para ambas pruebas, lo
cual es un resultado anormal para la bacteria debido a que en las pruebas de Durgham se
comprobó que la bacteria problema podía fermentar exitosamente la glucosa, por lo tanto es
posible que se vuelva a realizar un caldo
- La prueba de agar de leche sea analizó principalmente como un resultado negativo sin
embargo, existe la posibilidad de que sea negativo al haber una región sombreada en los
alrededores del crecimiento bacteriano que indicarían un halo pero al ser tan tenue dicho
halo es incierto si es positiva o negativa la prueba.
- La prueba de leche tornasol no tubo ningún cambio de color tras la incubación, sin embargo,
presentó ciertos coágulos en el fondo del tubo de color púrpura obscuros

CONCLUSIONES DE LA PRÁCTICA COMPLETA

El conocimiento de la fisiología y del metabolismo bacteriano tiene algunas aplicaciones prácticas. En

principio permite conocer el modo de vida y el hábitat de diferentes especies bacterianas. El ser humano
actuando como huésped, ofrece una variedad de nichos ecológicos que se diferencian entre sí por aspectos
físicos y químicos (temperatura, concentración de oxígeno, pH, presión osmótica, etc.), en los cuales pueden
crecer y multiplicarse distintas especies bacterianas según sus requerimientos nutricionales, ambientales y
atmosféricos.

Además, permite formular medios de cultivo para el aislamiento e identificación de los patógenos
participantes. Desde un enfoque terapéutico, nos permite conocer y entender el modo de acción de algunos
antibióticos que bloquean una vía metabólica o la síntesis de alguna macromolécula esencial para la bacteria.
BIBLIOGRAFÍA DE LA PRÁCTICA COMPLETA
1. Seeky H.W, Vandermark P.J. (1991) Microbes in action. A laboratory manual of microbiology. 4th edition.
2. Benson (2001) Microbiological Applications: Laboratoy manual in general
microbiology. 8va ed. Estados Unidos. McGraw-Hill.
Registre los resultados obtenidos para cada una de las pruebas realizadas, utilizando la siguiente
notación:
Para crecimiento: relativo. - medido en cruces; Para las pruebas: positiva = (+), negativa = (-).
Para fermentaciones indicar producción de ácido, gas, ambos o ausencia de los mismos.

Compile los resultados obtenidos en esta práctica y llene la siguiente tabla.

Estudiante: Microorganismo:
Equipo Fuente de aislamiento:
Características morfológicas: Características fisiológicas
Forma celular: Cocos Pruebas Resultados
Agrupación: Staphylococcus Glucosa + (sin gas)

Hidrólisis Fermentación
Tamaño: Lactosa + (sin gas )
Presencia de esporas: Si Sacarosa - (sin gas)
Tinción de Gram: Positivo (+) Manitol + (con gas )
Movilidad: Si
Cápsula: Si
Tinciones específicas: Gelatina -
Características de cultivo Almidón -
Colonia: Caseina
Forma: Fosfolípidos -
Bordes: Indol -
Elevación: Rojo de Metilo -
Consistencia: V-P -
Luz trasmitida o reflejada: (acetilmetilcarbinol)
IMViC

Consistencia: Uso de Citrato -

Crecimiento en agar inclinado:
Pruebas Adicionales Reacción Tiempo
Prueba Resultado Acidificación
Leche tornasol

Reduccion leche/azul Positiva Alcalinización

de metileno Positiva Coagulación
Oxidasa Positiva Reducción
Catalasa Peptonización
Sin cambio

Recapitulemos los procedimientos que ha realizado a la muestra problema para su identificación:

Inició con la descripción de la morfología colonial seguido de la caracterización microscópica mediante

la reacción a la tinción Gram; en esta clase con las pruebas propuestas, ha caracterizado la muestra
de acuerdo con su metabolismo.

Todos estos resultados, en conjunto con el apoyo bibliográfico de esquemas de identificación

(diagramas dicotómicos) serán de ayuda para la identificación de su muestra problema. De no ser así,
obtendrá con el análisis de resultados, un acercamiento para determinar el género del microorganismo
y en la práctica final podrá concluir la identificación de éste con las pruebas sugeridas en la bibliografía.
Le invito a que en el transcurso de las siguientes sesiones haga la revisión bibliográfica
correspondiente para lograr la identificación de su muestra problema, para lo cual sugiero el material
siguiente:

Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. MacFadin J.F.

1984. Ed. Panamericana, México.

Microbiology. A laboratory Manual. 6th Ed. Capuccino J.G. y Sherman N. 2002. Ed.
Benjamin Cummings, San Francisco, Ca.

BIBLIOGRAFÍA
3. Leboffe M. J. & Pierce B. E. (2010). Microbiology Laboratory Theory & Application. United
States of America: Morton Publishing Company.
4. Reyna L. G. (2008). Manual de Prácticas. Laboratorio de Bacteriología y Micología Generales.
México: Universidad de Guanajuato.
5. http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/gelatina.pdf
6. http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/lecitinasa.pdf
7. http://winklerltda.cl/quimicav2/wp-content/uploads/2019/05/632224-FT-Caldo-Triptona-
Triptofano-tubo-12x120-mm.pdf
8.