ESCUELA DE TECNOLOGIA MÉDICA

LABORATORIO MICROBIOLOGÍA BÁSICA

GUÍA N° 1

COCACEAS GRAM NEGATIVAS Y BACILOS GRAM POSITIVOS

Título del Laboratorio: Pruebas de identificación de Género y Especie de Cocaceas Gram Positivas

Nombre de los docentes responsables: T.M. María Ester Aliaga López

T.M. Jenny Rojas Cordero
T.M. María Fernanda Segovia Olivares

1.- Objetivo del Laboratorio: Pruebas de identificación de Género y especie de Cocaceas Gram (-) y
bacilos Gram positivos

2.- Materiales:

• Torulas estériles • Tubos de Urea

• Porta objetos • Agua oxigenada de 10-20 Volúmenes
• Kit de tinción Gram • Reactivo de Oxidasa
• Placas de agar sangre de cordero • Tubos de MIO
• Placas de agar chocolate • Suero fisiológico en ampollas
• Aceite de inmersión • Agar DNAsa
• Factores V y X

3.- Introducción:
Cocáceas gram (-):
• Neisseria sp.
• Moraxella sp.

Cocobacilos gram (-):

• Haemophilus sp.
• Bordetella sp.

Bacilos gram (+):

• Corynebacterium sp.
• Listeria sp.

3.1. Familia Neisseriaceae

Género Neisseria:
Neisseria son diplococos gramnegativos. El género contiene
dos especies patogénicas y muchas comensales, la mayoría
de las cuales son habitantes inocuos de los tractos respiratorio
y alimentarios superiores. Las especies patogénicas son Neisseria
meningitidis, una causa importante de meningitis y bacteriemia,
y Neisseria gonorrhoeae, la causa de la gonorrea.

Características Generales

Neisseria son cocos gramnegativos que en forma típica aparecen en

pares con los lados opuestos achatados, lo que les da una apariencia
de “granos de café”

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• Oxidasa positiva
• Catalasa positiva (La mayoría)
• Inmóviles
• Aerobio estricto
• DNAsa negativo
• Las especies patógenas tienen crecimiento
requerimientos nutricionales complejos
• Los tiempos de incubación son más alargados en
las especies patógenas necesitando hasta 72 hrs
para su desarrollo en placa
• Son sensibles a los agentes fisicoquímicos, como
altas temperaturas, desecación y
metales pesados.

Nota: Neisseria elongata es la única especie de origen

humano con una morfología bacilar.

Características de la colonia

Para recuperar Neisseria se dispone de medios de cultivos selectivos enriquecidos como el medio de
Thayer Martin, son medios en base a agar chocolate suplementados con factores de crecimiento, contienen
además antibióticos que inhiben el desarrollo de otros microorganismos y permiten el aislamiento de
Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis y N lactámica.
• Vancomicina: Inhibe el crecimiento de bacterias gram (+)
• Colistin: Inhibe el crecimiento de bacterias gram (-), excepto Neisseria.
• Nistatina: Inhibe el crecimiento de hongos.
• Trimetroprim: Inhibe el crecimiento de bacterias gram (-) especialmente Proteus sp.

Las especies patógenas para el ser humano son N. gonorrhoeae y N. meningitidis

Características Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria saprófita

fenotípicas
Significancia Patógeno humano (Puede Patógeno de transmisión Flora comensal
clínica aislarse de LCR, sangre y sexual (Principalmente asociado a
tejidos, lesiones de piel y contaminación en toma de
secreción faríngea)
muestra)
Medio y Agar Sangre de cordero Agar Chocolate Agar Sangre de cordero
condiciones de Agar Chocolate Agar Thayer-Martin Agar Chocolate
incubación Agar Thayer-Martin 35 ± 2°C. Requiere CO2 35 ± 2°C. Requiere CO2
35 ± 2°C. Requiere CO2
Tamaño Pequeño a Mediano Pequeño Pequeño
Color Blanco / Gris Blanco / Gris Blanco / Gris (Ocasionalmente
pigmentadas)
Bordes Regulares Regulares Regulares
Aspecto Liso, convexo y brillante Liso, convexo y brillante Liso, convexo y brillante

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Cápsula Sí No No

Se han definido 12 serogrupos

con base en la especificidad
antigénica de su cápsula
polisacárida. Los serogrupos
productores de enfermedad de
mayor importancia son A, B,
C, W-135 y Y.

Juntamente con los géneros Moraxella (incluyendo Branhamella catarrhalis, actualmente Moraxella
catarrhalis), y Kingella conforman la familia Neisseriaceae.

Género Moraxella

Moraxella catarrhalis

Características Generales

Moraxella catarrhalis es un diplococo gram (-) y un importante patógeno del tracto respiratorio humano.
Otras especies de Moraxella rara vez causan infección en humanos.
• Oxidasa positiva
• Catalasa positiva
• Aerobio
• DNAsa positivo
• No produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa y fructosa
• Productoras de β-lactamasas
• Crece en 24-48 hrs en medios comunes, como agar sangre y agar chocolate
• Temperatura de incubación 35 ± 2ºC.

Nota: Actualmente, es aceptado como el tercer patógeno más importante en el tracto respiratorio humano
después de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae.

Características de la colonia
Características Moraxella catarrhalis
fenotípicas

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Significancia clínica Parte de la flora normal en la vía respiratoria
Agente causante de infecciones pulmonares y de oído medio.
Medio y condiciones Agar Sangre de cordero
de incubación Agar Chocolate
35 ± 2°C. Requiere CO2
Tamaño Pequeño
Color Gris
Bordes Regulares
Aspecto Liso, convexo y opacas
No se adhiere a la placa
Hemólisis No hemolítica
Características
microscópicas y
macroscópicas

CARACTERISTICAS
GENERO Morfología Oxidasa Catalasa Ácido a partir de
celular glucosa
Neisseria Diplococos¹ + + V
Moraxella Diplococos¹ + + _
Kíngella Cocobacilos + _ +

4-. Procedimientos y fundamentos

Prueba de la oxidasa:
Esta prueba se basa en la capacidad de la enzima citocromo- oxidasa de oxidar el sustrato tetrametil-
para fenildiamina dihidroclórico, (un aceptor de electrones) en presencia de oxígeno, formando un
producto final de color púrpura oscuro, el indofenol.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia de un cultivo fresco a partir de agar sangre o Mueller Hinton.
2. Agregar una pequeña cantidad de la colonia a un papel impregnado con el sustrato o a tiras
preparadas comercialmente.
3. Leer la reacción hasta 10 segundos.

Nota: La tira reactiva, al estar en contacto con el ambiente virará de color de forma espontánea después
de unos minutos, debido al oxígeno ambiental.

Resultados:

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Resultado Color Interpretación

Fucsia (dentro de los Neisseria sp
Positivo primeros 10 segundos) Moraxella sp.
Negativo Sin cambio de color

Control de calidad
Control positivo: Cepa Neisseria gonorrhoeae
Control negativo: Cepa Escherichia coli

Agar DNAsa
La DNasa se puede detectar mediante la inoculación en motas o estrías del
microorganismo en un medio DNasa, con o sin colorante metacromático, azul de toluidina O, y después de
24 horas de incubación a 35°C, el ácido desoxirribonucleico hidrolizado presenta transparencia o variará
de azul a rosado, debajo y alrededor de la colonia.

Procedimiento:
1. Sembrar una estría con la colonia en estudio de un cultivo fresco a partir de agar sangre o
Mueller Hinton.
2. Incubar durante 18 – 24 horas a 35 ± 2 °C en estufa con atmósfera al 5% de CO 2.

Resultados:

Resultado Color Interpretación

Positivo Halo alrededor de la colonia Moraxella sp.
Negativo Sin cambio de color Neisseria sp

Las pruebas confirmatorias de las especies de Neisseria incluyen: pruebas

de utilización de carbohidratos, pruebas cromogénicos de enzimas-sustratos.

Prueba de utilización de carbohidratos. Medio CTA

El medio CTA es un medio semisólidos de agar base cistina–tripticasa que contiene un 1% de hidratos de
carbono y un indicador de pH rojo de fenol microorganismos .
Se utiliza para determinar la fermentación de varios carbohidratos incluyendo glucosa,
maltosa , lactosa y sacarosa . Este enfoque se puede utilizar para tipificar organismos porque, aunque las
cepas obtienen rápidamente resistencia a los antibióticos , rara vez adquieren la capacidad de metabolizar
nuevos nutrientes.

Procedimiento:
1. Preparar un inóculo denso de un cultivo fresco en 0.5 mL de suero fisiológico
2. Rotular los 4 tubos CTA para estudio de azúcares.
3. Inocular la suspensión en cada tubo en el tercio superior de la profundidad del agar.
4. Incubar bien cerrados durante 18 – 24 horas a 35 ± 2 °C con atmósfera al 5% de CO2.

Resultados:

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La metabolización del carbohidrato produce ácidos orgánicos y acidifica el medio. La peptona presente en
el medio, sin embargo, también es degradada por las bacterias presentes y produce sustancias de pH
alcalino. El indicador de rojo fenol cambia de naranja rojizo a amarillo cuando la cantidad de ácido producido
por la fermentación del carbohidrato es mayor que los productos finales alcalinos de la degradación de la
peptona.

Resultado Color Interpretación

Positivo Amarillo Fermenta carbohidrato
Negativo Rojo No fermenta carbohidrato

Azúcares fermentables
Microorganismo Glucosa Maltosa Lactosa Sacarosa
Neisseria gonorrhoeae X
Neisseria meningitidis X X
Neisseria lactámica X X X
Neisseria mucosa X X X
Neisseria sicca X X X
Moraxella catarrhalis No fermenta ningún azúcar común

Género Haemophilus
Características Generales

Cocobacilos Gram negativos de 0,4 mm de ancho y 1 mm de largo

• Anaerobios facultativos
• Catalasa (+), excepto H. haemolyticus y H. parahaemolyticus (Catalasa variable)
• Oxidasa (+)
• Nutricionalmente fastidiosas (No crece en agar sangre)
• Requieren medios enriquecidos con NAD (factor V) y/o hemina (factor X)
• Muy pleomórficas
• Fermentan glucosa, pero nunca lactosa ni manitol.
• No forma esporas
• Presenta dos variedades:
a) Capsuladas: se describen 6 serotipos designados con las letras “a” a la “f”
basado en los polisacáridos de su cápsula y con capacidad de producir
enfermedades invasoras.
b) No Capsulado: no tipificable o no clasificable que coloniza la nasofaringe en
50-75% de niños sanos y adultos; ocasionalmente se aísla del tracto genital.

Nota 1: El género Haemophilus sp puede crecer en Satelitismo, alrededor de otras

bacterias, como Staphylococcus aureus, que proporcionen el factor V.

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Nota 2: Las especies asociadas a infecciones en el ser humano incluyen H. ducreyi, H.
parainfluenzae, H. aphrophilus. Sin embargo, el único patógeno exclusivo humano es H.
influenzae.
Especies Cuadros clínicos
H. influenzae Meningitis, Neumonías, Epiglotitis, Septicemia
H. parainfluenzae Septicemia, Meningitis, Endocarditis
H. aegypticus Conjuntivitis
H. ducreyi Chancro blando
H. aphrophilus, H. paraphrophilus Placa dental

Características de la colonia
Su crecimiento es generalmente óptimo cuando se incuba a 35 ± 2°C durante 18 a 24
horas en una atmósfera con 5-10% de CO2.
En Agar Sangre sus características fenotípicas son:
• Satelitismo: Haemophilus solo es capaz de crecer alrededor de una colonia β-
hemolítica.
• Puntiformes (crece formando un rocío)
• Blanco
• Pequeñas

En Agar Chocolate sus características fenotípicas son

Características Haemophilus influenzae Haemophilus

fenotípicas parainfluenzae
Significancia clínica Patógeno humano exclusivo (es necesario Patógena vía
estudiarlo en cualquier muestra) respiratoria alta
Medio y condiciones Agar Chocolate
de incubación 35 ± 2°C. Requiere CO2
Tamaño Pequeñas a medianas
Color (Agar Sangre de Transparente a las 24 horas
cordero) Blanco a las 48 horas
Bordes Regulares
Aspecto Convexa, Lisa y Opaca
* Las colonias de las cepas capsuladas son de mayor tamaño y de aspecto más
mucoide, alcanzado los 3 mm. Presenta un olor característico

Gram Agar sangre Agar chocolate

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4.- Procedimientos y Fundamentos

Prueba de Satelitismo
Haemophilus influenzae requiere los factores hemina y NAD para su crecimiento. No
obstante, otras especies de Haemophilus requieren sólo NAD. Las especies que
requieren NAD no crecen en agar sangre a menos que sean hemolíticos y puedan liberar
el NAD de los glóbulos rojos. Sin embargo, crecen bien en agar sangre cerca de colonias
de estafilococos, los cuales son capaces de proveer el NAD. El NAD se difunde en el
medio alrededor de la cepa de Staphylococcus aureus y estimula el crecimiento
de Haemophilus en la zona adyacente.

Procedimiento:
1. Sembrar la cepa en estudio en agar
sangre (sembrado en césped en tres
direcciones)
2. Realizar dos estrías en forma de cruz
con una cepa de Staphylococcus
aureus ATCC 25923
3. Incubar durante 24 horas a 35 ± 2°C en
atmósfera enriquecida con CO2

Resultados:

Resultado Observación Interpretación

Crecimiento de colonias pequeñas alrededor de Haemophilus parainfluenzae.
Positivo Sta. aureus (Nota 2 y 3)

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Crecimiento de colonias en el medio sin ninguna
Negativo concentración particular alrededor de la cepa
de S. aureus

Nota 1: Para Haemophilus sp, la prueba de Satelitismo

sustituye la prueba del factor V y no requiere la compra
de reactivos

Nota 2: Haemophilus ducreyi no requiere el factor V,

pero debido a su naturaleza exigente no crecen en
agar sangre, ni alrededor de la cepa de S. aureus

Nota 3: H. haemolyticus y H.
parahaemolyticus pueden crecer sin S. aureus y no
demuestran el fenómeno de Satelitismo, aunque
requieren el factor V. Ambos son hemolíticos y pueden liberar el NAD al medio.
Control de calidad
- S. aureus ATCC 25923. Se debe demostrar Satelitismo en cada lote de agar sangre
usando una cepa de estafilococo y H. influenzae ATCC

Prueba de requerimientos de factores X y V

Es utilizada para determinar los requerimientos de factor X (Hemina) y de factor V (NAD:
nicotinamida adenina dinucleótido) para el crecimiento de especies de Haemophilus, ya
sea en forma aislada o en combinación. Se siembra una suspensión densa del
microorganismo en estudio en un medio de base rica (Agar Tripticasa soya o Agar Mueller
Hinton) que contiene discos impregnados con los factores V, X y VX.

Procedimiento:
1. Preparar una suspensión (Mac Farland 1) de un cultivo puro de la cepa en estudio
2. Sembrar en placa de agar Mueller Hinton o TSA con la suspensión preparada en
3 direcciones diferentes.
3. Colocar discos o tiras, uno con el factor V, otro con el factor X y otro con los dos
(XV), en la superficie del agar (alejados unos de otros)
4. Incubar durante 24 horas a 35 ± 2°C en atmósfera enriquecida con CO2

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Resultados:

Resultado Observación
Positivo El crecimiento de colonias pequeñas alrededor del disco impregnado
con los factores
Negativo Sin crecimiento o crecimiento de colonias en el medio sin ninguna
concentración particular alrededor del disco

Nota 1: H.

influenzae requiere tanto hemina como NAD para su crecimiento, por lo tanto
sólo crecerá alrededor del disco que contiene ambos factores (V y X).
Nota 2: H. haemolyticus y H. parahaemolyticus pueden ser diferenciados de H.
influenzae utilizando la prueba de la catalasa (H. influenzae es catalasa positivo
y H. haemolyticus es catalasa negativo, pero H. parahaemolyticus es catalasa
variable)
Nota 3: H. haemolyticus y H. parahaemolyticus pueden ser
diferenciadas con la prueba del Satelitismo porque al ser
hemolíticos pueden lisar los glóbulos rojos del medio y crecer
en el agar sangre.

Control de calidad:
Haemophilus parainfluenzae: requiere solo factor V
Haemophilus influenzae: requiere factores X y V

Biotipificación de H. influenzae y H. parainfluenzae

Uso de pruebas bioquímicas para la identificación y caracterización de microorganismos
del género Haemophilus basado en tres pruebas:

• Producción de indol
El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación
reductiva del triptófano y esta reacción es llevada a cabo por algunas bacterias

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que poseen las enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Para detectar
la producción de indol se utiliza el medio Caldo triptófano y la lectura de la prueba
se realiza con el reactivo de Kovacs (alcohol isoamilo, p-
dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico concentrado) con el que el
indol producido reacciona generando una coloración rosa intensa.

Procedimiento:
1. Rotular un Tubo de Agar MIO
2. Inocular el medio introduciendo la cepa en estudio en profundidad con un asa en
punta.
3. Incubar durante 24 horas a 35 ± 2°C
4. Para leer agregar dos gotas de reactivo de Kovacs

Resultados:

Resultado Color Observación

Positivo Rosado Haemophilus influenza
Negativo Amarillo Haemophilus parainfluenzae
Neisseria sp.

• Producción de Urea
La ureasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea a dióxido de
carbono y amoníaco. La actividad de la ureasa tiende a incrementar el pH del
medio en el que se encuentra debido a la producción de amoniaco.
Los organismos que producen ureasa tienden a ser patógenos del tracto
gastrointestinal o urinario, siendo que la ureasa les permite neutralizar el ácido
presente en estos medios acídicos.

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Procedimiento:
1. Rotular un Tubo de Agar Urea de Christensen
2. Inocular el medio introduciendo la cepa en estudio en
profundidad con un asa en punta.
3. Sembrar la cepa con la misma asa en la superficie inclinada del
medio
4. Incubar durante 24 hras a 35 ± 2°C

Resultados:

Resultado Color
Positivo Rosado
Negativo Amarillo

• Ornitina Descarboxilasa (ODC)

La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas

descarboxilasas específicas atacan los aminoácidos en su carboxilo terminar (COOH)
para formar una amina o diamina y CO2. Estas enzimas descarboxilasas solo se
forman cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente ácido en presencia de
L-Ornitina y sis productos cambian el pH a límites alcalinos.

Procedimiento:
1. Rotular un Tubo de Agar MIO
2. Inocular el medio introduciendo la cepa en estudio en profundidad con un asa en
punta.
3. Incubar durante 24 hras a 35 ± 2°C

Resultados:

Resultado Color
Positivo Morado
Negativo Amarillo

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Especie Biotipo Indol Ureasa Decarboxilasa de ornitina

I + + +
II + + -
III - + -
IV - + +
Haemophilus influenzae
V + - +
VI - - +
VII + - -
VIII - - -
I - - +
II - + +
III - + -
Haemophilus parainfluenzae IV + + +
VI + - +
VII + + -
VIII + - -

Serotipificación
La cápsula de muchas especies de bacterias es un factor de virulencia y permite
la serotipificación. Las cepas capsuladas de Haemophilus se pueden identificar por
tipificación serológica, en base a la composición química del polisacárido capsular.
Se prepara una suspensión densa del microorganismo en solución salina y se
realiza la reacción de aglutinación en lámina con los antisueros específicos, más un
control de solución salina. La aglutinación rápida (menos de 1 minuto) de los
microorganismos mediante un antisuero específico y la ausencia de aglutinación en el
control salino identifican la cepa aislada como un serotipo específico. Existen antisueros
comerciales polivalentes y específicos de tipo para H. influenzae.

Nota: En el caso particular de H. influenzae,

además de su identificación a nivel de especie, es
fundamental realizar una serotipificación
utilizando un suero polivalente, para determinar si
la cepa es tipificable o no, y si lo es se continúa
con la serotipificación utilizando sueros
específicos para cada uno de los antígenos
capsulares.

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API NH (Índice Analítico de Perfil o Analytical Profile Index)
Es una manera de clasificar las bacterias basada en experimentos, permitiendo la rápida
identificación. Este sistema introdujo una base estandarizada y miniaturizada de
las pruebas bioquímicas existentes, que hasta entonces eran complicadas de hacer y
difíciles de leer.
API NH es un nuevo sistema para la identificación de Neisseria sp y Haemophilus
sp. de significancia clínica y para Moraxella catarrhalis. Consiste en 10 microtubos que
contienen sustratos deshidratados, con los cuales se realizan 12 pruebas de
identificación (reacciones enzimáticas o fermentación de azúcares) como también la
detección de penicilinasa, prueba de interés en H. influenzae, H. parainfluenzae,
Moraxella catarrhalis y Neisseria gonorrhoeae.

Características de especies de Haemophilus spp.de importancia clínica

Especie X V CO 2 Hemolisis GLU SAC Lac MAN Catalasa
C
H. influenzae + + + — + — — — +
H. haemolyticus + + — + + — — — +
H. ducreyi + — — — — — — — —
H. parainfluenzae — + V³ — + + — + V
H. parahaemolyticus — + — + + + — — +
H. segnis — + — — w4 W — — V
H. paraphrophilus — + + — + + + + —
H. aphrophilus — — + — + + + + —
¹ Hemólisis en sangre de caballo.
2 Glu, glucosa; Sac, sacarosa; Lac, lactosa; Man, manosa
³ V, variable.
4. w, reacción débil

BACILOS GRAM POSITIVOS

CARACTERISTICAS GENERALES BACILOS GRAM POSITIVOS NO

ESPORULADOS
La virulencia de los Bacilos Gram positivos es variable, por ejemplo, Bacillus
anthracis es uno de los microorganismos más patógenos, y por otra parte, la mayoría de
los otros Bacillus y Corynebacterium (excepto C. diphtheriae) son contaminantes de
laboratorio. Sin embargo, algunas de estas cepas consideradas contaminantes son
potencialmente patógenas oportunistas en pacientes inmunocomprometidos. Por lo

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tanto, el hallazgo en dos muestras de sangre de Bacillus sp. O Corynebacterium sp.,
puede tener importancia clínica y no ser contaminación.

Bacilos Gram positivos no esporulados: Listeria y Corynebacterium.

Género Listeria
De las especies del género Listeria, la de mayor importancia clínica es Listeria
monocytogenes.
Listeria monocytogenes es una bacteria que se desarrolla intracelularmente y es
causante de la Listeriosis. Es uno de los patógenos causante de infecciones alimentarias
más violentos, con una tasa de mortalidad entre un 20 a 30%, más alta que casi todas
las restantes toxicoinfecciones.
Las enfermedades causadas por Listeria monocytogenes son poco frecuente. En
los ancianos e inmunodeprimidos causa meningitis y son producidas por el consumo de
alimentos contaminados con este microorganismo, además provoca cuadros infecciosos
severos en mujeres embarazadas y sus fetos, dado que tiene la capacidad para atravesar
la barrera placentaria y producir enfermedades congénitas graves. Y en los meses
iniciales de embarazo produce aborto.

Características Generales
El género Listeria sp. son Bacilos cortos gram (+), mide 0,4 µm de ancho × 1,2 de largo
• Oxidasa negativa
• Catalasa positiva
• Anaerobio facultativo
• No ramificado
• Capaz de crecer en un amplio rango de
temperaturas (1°C a 45°C)
• Crece con facilidad en medios enriquecidos
con sangre de cordero
• Crece en elevada concentración de sal
• Móvil a 22°C (Forma de sombrilla)
• Inmóviles a 36°C (Inactivación de sus flagelos perítricos)
• Fermenta azúcares como glucosa y maltosa
• No esporulado
• No capsulado

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Características de la colonia
Características Listeria monocytogenes
fenotípicas
Significancia clínica Patógeno intracelular
(Puede aislarse de LCR,
sangre o líquido amniótico)
Medio y condiciones Agar Sangre de cordero
de incubación 35 ± 2°C. Requiere CO2
Tamaño Pequeño
Color Blanco / Gris
Bordes Regulares
Aspecto Liso, convexo y brillante
Hemólisis β-hemólisis bajo la colonia

4.- Procedimientos y Fundamentos

Prueba de bilis-esculina
Esta prueba consiste en determinar la capacidad que tiene Listeria
monocytogenes de hidrolizar la esculina a esculetina y la glucosa en presencia de sales
biliares. La esculetina generada reacciona con los iones de hierro que contiene el cloruro
férrico en el medio y genera una coloración negra, siendo esta positiva.

Procedimiento:
1. Sembrar la cepa en estudio en una placa de agar Bilis esculina o picar en profundidad
en caso de agar en tubo.
2. Incubar a 35 ± 2ºC durante 18-24 hrs. en jarra con vela o en estufa con
5-7% de CO2.

Resultados:
Agar Bilis-Esculina Color Especie
Positivo Negro Listeria monocytogenes
Negativo Amarillo

Voges Proskauer (VP)

L. monocytogenes presenta un metabolismo fermentativo al generar ácido a
partir de la glucosa y por producir acetona, lo que conlleva a una reacción de Voges-
Proskauer positiva. La fermentación de estos azúcares se evidencia por la técnica de
voges-proskauer, la cual consiste en identificar si L. monocytogenes genera ácidos y
diacetilo ya que el medio contiene azúcares fermentables. Para ver la reacción se utilizan
los reveladores alfa-naftol y KOH.

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Procedimiento:
1. Preparar un inóculo de 2 Mc Farland de la cepa en estudio en un tubo con 0,25ml de
suero fisiológico.
2. Agregar un disco de diagnóstico VP y tapar el tubo.
3. Incubar a 35 ± 2°C por 4 horas.
4. Añadir 2 gotas de α-naphtol (5% en etanol) y una gota de KOH (40%) y mezclar
5. Dejar estabilizar durante 5 minutos y leer

Resultados:
Voges-Proskauer Color Interpretación Especie
Rojo/Rosado Positivo (Presencia de Listeria monocytogenes
Acetoína)

Amarillo Negativo (Ausencia de

Acetoína)

Prueba Test de CAMP

La prueba de CAMP es utilizada para la identificación de Listeria monocytogenes. El

resultado esperado será que Listeria monocytogenes genere el factor CAMP el cual produce
un sinergismo con la beta lisina producida por Staphylococcus aureus sobre
los eritrocitos generando una lisis de estos.

Procedimiento:
1. Realizar en una agar Sangre de cordero una estría de una cepa conocida de
Staphylococcus aureus (preferentemente Staphylococcus aureus ATCC 25923)
2. Seleccionar una colonia β-hemolítica en estudio.

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3. Realizar una estría de manera perpendicular al Staphylococcus
aureus con la colonia en estudio sin unirse entre sí.
4. Incubar a 35 ± 2ºC durante 18-24 hrs. en jarra con vela o en
estufa con 5-7% de CO2.

Resultados:

Forma de Especie
Hemólisis
Circulo (cabeza de Listeria monocytogenes
fósforo)

Movilidad a 25°C
Listeria monocytogenes posee flagelos perítricos que le confieren
movilidad en medios semisólidos a 25°C. Para ello se inocula en
profundidad con un asa y la cepa en estudio un agar MIO y se incuba
a temperatura ambiente. La movilidad se evidencia con la formación de
una especie de sombrilla.

Género Corynebacterium

La mayoría no causa enfermedades, sino que son parte de la flora saprofita de la piel y
la mucosa uretral y oral. El género Corynebacterium sp. incluye varias especies, siendo
la más importante.

En humanos las infecciones por C. diphtheriae causan difteria, una enfermedad aguda
contagiosa productora de una pseudomembrana compuesta por células epiteliales muertas,
leucocitos, glóbulos rojos y fibrina que se forma alrededor de las amígdalas y la faringe.

Son bacterias Gram positivas desiguales en tamaño,

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Características Generales

El género Corynebacterium sp. son Bacilos gram (+) rectos o ligeramente curvados a
menudo con la típica forma de V (lo que también se denomina “forma de letras chinas”
o empalizada) cuyo tamaño oscila entre 2-6 micrómetros de longitud y 0,5 micrómetros
de diámetro, con tinción irregular.
• Oxidasa negativa
• Catalasa positiva
• Aerobio o anaerobio
facultativo
• No esporulado
• Crece en caldo simple, agar
sangre y telurito potásico
• Inmóviles
• Necesitan biotina para su
crecimiento y algunas cepas
requieren
además tiamina y ácido p-
aminobenzoico (PABA)
• Ureasa (+) a los pocos minutos en C.urealyticum
• Pleomórfico (presenta un extremo abultado)

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Características de la colonia
Características Corynebacterium
fenotípicas diftheriae
Significancia clínica El hombre es el único
reservorio (Agente
causante de difteria)
Medio y condiciones Agar Sangre de cordero
de incubación 35 ± 2°C. No requiere
CO2
Tamaño Pequeño
Color Gris/traslúcida
Bordes Irregular (Bordes
dentados)
Aspecto Opaco, granuloso y liso
Medio Telurito Gris con centro negro
Hemólisis A veces β-hemólisis

CARACTERISTICAS GENERALES BACILOS GRAM POSITIVOS NO

ESPORULADOS
En este grupo se originan dos géneros de bacterias:
• Bacillus (bacilos aerobios con esporas)
• Clostridium, anaerobio, esporas deformantes o no deformantes.

Género Bacillus
Viven en el suelo, agua del mar y ríos, aparte de alimentos que contaminan con su
presencia. Aunque la mayoría de las especies de Bacillus son inocuas, algunas son
patógenas para las personas y los animales
Comúnmente se usan criterios eco-fisiológicos para agrupar a las diferentes
especies, en lugar de emplear taxones filogenéticos de difícil diferenciación.

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Características Generales

Bacillus es un género de bacterias en forma de bastón y gram positiva.

• Catalasa positiva (La mayoría de las especies)

• Aaerobios estrictos o anaerobios facultativos
• En condiciones estresantes forman una endospora que es resistente a las altas
temperaturas y a los desinfectantes químicos corrientes
• Saprófitas
• Móviles (Excepto B. anthracis)
• Hay especies productoras de antibióticos

Características de la colonia

Bacillus anthracis produce carbunco en personas y animales

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Bacillus cereus causa una intoxicación alimentaria similar a la estafilocócica. Algunas

cepas producen una toxina termoestable en los alimentos que se asocia con la
germinación de esporas y que genera un síndrome de vómitos en un plazo de 1 a 5 horas
tras la ingestión. Se ha comprobado que Bacillus cereus causa bacteriemia en enfermos
inmunodeprimidos, además de síntomas como vómitos y diarrea.

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Género Clostridium
Las especies de Clostridium están ampliamente distribuidas en el ambiente, habitando el
tracto gastrointestinal tanto de humanos como animales
Las especies más importantes son:

• C. botulinum (de la palabra botulus, salchicha) es un organismo productor de

una toxina alimenticia causante de botulismo, un desorden neurológico agudo
potencialmente letal.
• C. difficile (llamado así por su dificultad a ser aislado y cultivado) puede
sobrepoblar la flora saprófita intestinal durante terapias con antibióticos,
causando colitis pseudomembranosa.

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• C. perfringens (llamado perfringens, literalmente "que atraviesa" por estar
asociado a una necrosis invasiva) causa un amplio rango de síntomas,
desde intoxicación alimentaria hasta gangrena gaseosa.
• C. tetani (de tetani, que significa rigidez) es el organismo causante
de tétano (trismo), caracterizada por una rigidez muscular excesiva.
• C. septicum (su nombre proviene de la palabra septicum, traducido como
"putrefactor") es uno de los agentes etiológicos de la septicemia y una elevada
mortalidad.
• C. sordellii, puede formar parte de la flora genital femenino, ha estado involucrado
en casos de choque tóxico después del parto

Características Generales

Clostridium es un bacilo gram (+) con forma de fósforo, palillo de tambor o huso de hilar,
que se observan solo, en parejas o a lo máximo en cadenas cortas.

• Anaerobio estricto (C. tetani, por

ejemplo, requiere total anaerobiosis
y C. perfringes es menos exigente)
• Esporulado
• Actúa como parásito y saprófito
• Móviles (excepto C. perfringens)
• Incapaz de reducir sulfatos a sulfitos
• Son fácilmente inactivadas a pH ácido
o básico, como el ácido estomacal, el
de limpiadores y desinfectantes como
el cloro.
• Son fermentadores de azúcares
• Producen exotoxinas de efecto necrosante, hemolíticos y potencialmente letales

Clostridium difficile

Es el principal patógeno responsable de la diarrea adquirida en pacientes

hospitalizados y en personas que tienen que tomar antibióticos por un largo periodo de
tiempo.
Diversos factores de virulencia se asocian al desarrollo de la enfermedad. Los más
conocidos son las toxinas A y B que provocan inflamación a nivel de intestino grueso. Las

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toxinas generan aumento de la permeabilidad epitelial, producción de citoquinas,
infiltración de neutrófilos, producción de intermediarios reactivos del oxígeno, activación
de mastocitos, producción de sustancia P y daño directo a la mucosa intestinal.

Las pruebas de heces pueden diagnosticar C. difficile.

• Análisis de Citotoxicidad en Cultivo Celular o Neutralización de Citotoxina

Identifica el efecto citopático inducido por toxina B en muestras fecales en
cultivo de fibroblastos, observada como un halo característico alrededor de la
célula y la neutralización de este efecto con antisueros.

• Cultivo Toxigénico en deposiciones

Se cultiva la muestra en un medio selectivo en anaerobiosis y luego de aislar
las cepas de CD, se realiza la detección de la producción de toxinas. Actual
estándar de oro.

• Inmunoensayo Enzimático (EIA) de toxina A o toxinas A y B

En la actualidad es el método más utilizado para el diagnóstico de CD.
Existen pruebas de EIA disponibles comercialmente que detectan ya sea
únicamente la toxina A o ambas toxinas, A y B.

• Pruebas para Antígeno Común de CD (GDH) por EIA

GDH es un antígeno enzimático producido por CD y ocasionalmente otras
especies de Clostridium. Se propuso como método de screening sensible, pero no
específico de CD en deposiciones. Tiene un alto valor predictivo negativo, lo que
la convierte en útil para detección rápida, si se combina con otro método que
detecte toxinas.

• Detección mediante Amplificación de Ácido Nucleico (AAN) Existen dos tipos:

• Ensayos moleculares por Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR)
para detección de toxinas. Identifica el gen tcdB que codifica la toxina B. Se ha
planteado que es el método más sensible y específico para la detección de CD,
siendo actualmente recomendado como método diagnóstico.
• Ensayos moleculares por LAMP (loop mediated isotermo amplification).
Consiste en una reacción isotérmica de AAN que no requiere instrumentación de
alto costo para su implementación. Los kits comerciales detectan el gen tcdA del
locus de patogenicidad. Tiene alta sensibilidad y especificidad, pero es
controversial el hecho de que detecte tcdA ya que existen cepas toxina A
negativas. La detección mediante AAN representa un problema en pacientes
colonizados, en que un resultado positivo puede llevar a tratar pacientes que no lo
requieran. Es por esto que este método de detección se debe reservar para
pacientes con cuadro clínico sugerente.

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