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Revista de materiales peligrosos 414 (2021) 125553

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Diario de materiales peligrosos

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Trabajo de investigación

Biodegradación ambiental del grafeno: los hongos saprotróficos y

degradantes de la madera oxidan el grafeno de pocas capas

Fabio Candotto Carniela,*,1, Lorenzo Fortunab,1, David Zanellia, Marina Garridob, Ester
VázquezC,d, Viviana Jehová Gonzálezd, Mauricio Pratob,mi,F, Mauro Tretiacha
aDepartamento de Ciencias de la Vida, Universidad de Trieste, via L. Giorgieri 10, Trieste I-34127, Italia
bDepartamento de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Trieste, via L. Giorgieri 1, Trieste I-34127, Italia
CFacultad de Ciencias y Tecnologías Químicas, Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real E-13071, España
dInstituto Regional de Investigación Científica Aplicada (IRICA), Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real E-13071, España

miCentro de Investigación Cooperativa en Biomateriales (CIC biomaGUNE), Alianza Vasca de Investigación y Tecnología (BRTA), Paseo de Miramón 182, Donostia San

Sebastián E-20014, España

F Fundación Vasca para la Ciencia, Ikerbasque, Bilbao E-48013, España

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Editor: Dr. R. Debora Es importante conocer el perfil de biodegradabilidad ambiental de los materiales relacionados con el grafeno (GRM) para
predecir si estos materiales se acumularán en el suelo o serán transformados por descomponedores primarios. En este
Palabras clave: estudio, se expuso grafeno de pocas capas (FLG) a cultivos axénicos vivos y desvitalizados de dos basidiomicetos de pudrición
Descomponedores de hongos
blanca (Bjerkandera adustayPhanerochaete chrysosporium) y un ascomiceto saprotrófico del suelo (Morchella esculenta) con o
lacasa
sin lignina, por un período de cuatro meses. Durante este tiempo, el aumento de la biomasa fúngica y la presencia de H2O2y
peroxidasa de lignina
las enzimas oxidantes [laccasa/peroxidasa y lignina peroxidasa (LiP)] en los medios de crecimiento se evaluaron mediante
Análisis Raman
mediciones gravimétricas y espectrofotométricas, respectivamente. Se utilizaron espectroscopia Raman y microscopía
materiales 2d
electrónica de transmisión (TEM) para comparar la estructura de FLG antes y después de la incubación. Todos los hongos de
prueba disminuyeron el pH en los medios de crecimiento y liberaron H2O2y lacasa/peroxidasa, pero solo los basidiomicetos
liberaron LiP. Independientemente de la composición del medio de crecimiento, se descubrió que todos los hongos eran
capaces de oxidar FLG a un material similar al óxido de grafeno, incluidoM. esculenta,que liberaba sólo lacasa/peroxidasa, es
decir, las enzimas más comunes entre los descomponedores primarios. Estos hallazgos sugieren que FLG liberado
involuntariamente en ambientes terrestres probablemente sería oxidado por la microflora del suelo.

1. Introducción materiales relacionados con el grafeno (GRM) que pueden liberarse

El grafeno se considera uno de los materiales innovadores del futuro gracias a sus
extraordinarias propiedades químicas y físicas, lo que lo hace adecuado para numerosas
aplicaciones, incluidas la optoelectrónica, la automoción, la medicina, el almacenamiento
de energía y las comunicaciones móviles (Novoselov et al., 2012). Desde su aislamiento
en 2004 (Novoselov et al., 2004), el número de aplicaciones y tecnologías patentadas ha
aumentado exponencialmente con el tiempo y los frutos de la investigación ahora se
están volviendo ubicuos en la sociedad; algunos ejemplos incluyen equipos deportivos,
almohadillas para los oídos, disipadores de teléfonos, neumáticos y pastillas de freno
para bicicletas, asfalto para pavimentar carreteras y muchos más (para obtener una lista,
consultewww.graphene-info.com). Singularmente, estos objetos solo contienen una
pequeña cantidad de grafeno y
inadvertidamente al medio ambiente durante los procesos de producción, uso o
descarga. Sin embargo, algunas aplicaciones implican la liberación deliberada de
GRM para fines específicos, como el control de plagas (An et al., 2017; Liu et al.,
2017; Miraftab y Xiao, 2019; Wang et al., 2019) o entrega de medicamentos y
fertilizantes (An et al., 2017; Kabiri et al., 2017; Andelkovic et al., 2018) en los
cultivos. Desafortunadamente, el destino ambiental del grafeno y los GRM aún se
desconoce en gran medida, porque hasta la fecha solo se han investigado los
procesos de degradación químico-física por medios abióticos.Huh et al., 2011;
Radich et al., 2014).
El papel de los procesos de degradación mediados por organismos en el destino
ambiental de estos materiales se ha ignorado en gran medida (Fadeel et al., 2018). En los
hábitats terrestres, la materia orgánica muerta es progresivamente

* Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico:fcandotto@units.it (F. Candotto Carniel).
1Estos autores contribuyeron igualmente en este trabajo

https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.125553
Recibido el 3 de septiembre de 2020; Recibido en forma revisada el 2 de febrero de 2021; Aceptado el 25 de febrero de 2021
Disponible en línea el 1 de marzo de 2021
0304-3894/© 2021 Los autores. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
F. Candotto Carniel et al.
mineralizado para su uso como fuente de energía en carbono y otros nutrientes
por descomponedores primarios como bacterias y hongos. Los hongos
generalmente se han descrito como los descomponedores más eficientes, porque
usan hifas para penetrar el sustrato, mientras que las bacterias se limitan a crecer
y alimentarse en superficies expuestas de materia orgánica. Además, se sabe que
algunos hongos degradan macromoléculas recalcitrantes al ataque de bacterias (
Boonchan et al., 2000).
Un grupo especializado de basidiomicetos que degradan la madera (llamados
"podredumbres blancas") es capaz de degradar la lignina, que es uno de los
biopolímeros más abundantes, altamente heterogéneos y recalcitrantes de la
naturaleza. Para descomponer la lignina, el micelio fúngico produce y libera un
exudado complejo de una pluralidad de enzimas oxidativas (p. ej., peroxidasas
versátiles, dependientes de Mn, lignina, etc.), sus sustratos (p. ej.⋅H2O2, alcohol
veratrílico, etc.) y biosurfactantes (Pérdida de Ostrem y Yu, 2018). El ciclo catalítico
de estas enzimas genera especies de radicales altamente oxidantes, que pueden
oxidar compuestos no fenólicos (LiP) o fenólicos (MnP) de la lignina,
fragmentándola.Ten Have y Teunissen, 2001). Además, la presencia de fragmentos
de lignina parece estimular aún más la producción y liberación de los exudados
antes mencionados (Rogalski et al., 1991). Los biosurfactantes mejoran el proceso
al disminuir las fuerzas de tensión superficial e interfacial de los fragmentos de
moléculas degradadas, haciéndolos más hidrofílicos y, por lo tanto, biodisponibles
(Volkering et al., 1995).
Esta capacidad se aprovechó en el pasado para desarrollar tecnologías para la
eliminación de contaminantes persistentes del medio ambiente, pero también
para fines industriales. De hecho, estos hongos pueden degradar con éxito
moléculas xenobióticas (Pinedo-Rivilla et al., 2009). Por ejemplo, algunos hongos
de pudrición blanca (al igual que numerosas bacterias) pueden degradar una
variedad de contaminantes orgánicos, desde los hidrocarburos aromáticos
policíclicos menos persistentes (es decir, benzo-a-pireno) (Pérdida de Ostrem y Yu,
2018) a compuestos organohalogenados de gran persistencia como los PCB, las
dioxinas y los furanos (Mori y Kondo, 2002; Stella et al., 2017). Por lo tanto, las
podredumbres blancas y otros basidiomicetos se utilizaron para la
biorremediación de aguas residuales industriales y suelos contaminados.Robinson
y Nigam, 2008; Faraco et al., 2009; Fan et al., 2013). Ejemplos de posibles
aplicaciones industriales para el proceso degradativo de pudriciones blancas
fueron el “blanqueo” de pulpa de madera para la industria papelera (Kondo et al.,
1994) y la solubilización de carbón duro y de bajo rango para obtener polímeros
de bajo peso molecular solubles en agua con valor añadido para otros procesos
industriales (Hofrichter et al., 1997; Catcheside y Ralph, 1999). Los estudios sobre
carbones mostraron que las podredumbres blancas eran capaces de romper y
transformar los mantos de carbón gracias a la acción mecánica de las hifas y a las
enzimas que utilizan para degradar la materia orgánica muerta, en particular LiP y
MnP, respectivamente (Catcheside y Ralph, 1999).
Por estas razones, las pudriciones blancas (junto con otros hongos
saprotróficos) pueden ser los mejores candidatos para estudiar la degradación de
los GRM, o al menos para su transformación en especies químicas más
vulnerables a una amplia gama de descomponedores primarios, como hongos
menos agresivos y bacterias Los pocos estudios disponibles sobre este tema
probaron las capacidades de degradación de las pudriciones blancas y su
peroxidasa de lignina purificada (LiP) en nanomateriales de carbono ya oxidados (
Chen et al., 2017; Yang et al., 2019). Las formas oxidadas de grafeno, como el
óxido de grafeno (GO) y el GO reducido, poseen defectos en su red que las hacen
más propensas a ser oxidadas por enzimas extracelulares degradantes, como las
peroxidasas.Kotchey et al., 2012). En comparación, el grafeno y el grafeno de
pocas capas (FLG) están hechos de casi un 100% de átomos de carbono
organizados en una estructura de panal bidimensional regular (Geim, 2009) y, por
lo tanto, debería ser más resistente a los radicales producidos por las enzimas
extracelulares fúngicas. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue probar la
capacidad de los basidiomicetos de podredumbre blanca y los ascomicetos
saprotróficos en la biodegradación de FLG. Para ello, los basidiomicetos
Bjerkandera adustayPhanerochaete chrysosporium, y el ascomicetoMorchella
esculentafueron seleccionados para (i) conocidas capacidades degradativas,
incluso hacia moléculas xenobióticas recalcitrantes, (yo) producción y liberación de
diferentes grupos de enzimas degradantes (Tuor et al., 1995; Gramss et al., 1999),
y (iii) porque son representativos de organismos que degradan la madera o la
hojarasca. Para probar si estos hongos son capaces de degradar FLG, fueron
2
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crecido hasta cuatro meses en cultivos líquidos enriquecidos con FLG, que
fue analizado por Raman y microscopía electrónica de transmisión (TEM) al
final del período de incubación.
2. Materiales y métodos
2.1. Preparación y caracterización FLG
FLG fue preparado por el tratamiento de molienda de bolas descrito por
González-Domínguez y coautores (González-Domínguez et al., 2018) a partir
de una mezcla de grafito (7,5 mg de polvo de grafito SP-1, Bay Carbon, EE.
UU.), y melamina (22,5 mg de 1,3,5-triazina-2,4,6-triamina, Sigma-Aldrich,
D ). La mezcla sólida resultante se suspendió en agua y la melamina se lavó
dializándola contra agua. La fracción líquida con láminas estables en
suspensión (FLG) se liofilizó y cuando se requirió, el material se resuspendió
en agua hasta una concentración final de 100µg ml-1. Los polvos FLG se
caracterizaron por análisis termogravimétrico (TGA) con un TGA Q50 (TA
Instruments, EE. UU.) a 10◦C por minuto bajo nitrógeno atmosférico, desde
100◦C a 800◦C. Se vertió una alícuota de la suspensión de FLG en una oblea
de Si, se secó en una placa caliente y se analizó con un microscopio inVia
Raman (Renishaw, Reino Unido) a 532 nm con un 100×objetivo y una
potencia incidente del 1% (1 mW µmetro-2). Los análisis cuantitativos de C, H,
N y O se realizaron con un analizador elemental LECO CHNS-932 (LECO
Corporation, EE. UU.). SieteµL de la suspensión de FLG se vertió en rejillas de
níquel (3 mm, malla 200), se secó al vacío y se observó con un TEM de alta
resolución a un voltaje de aceleración de 200 kV. Las imágenes se analizaron
con el software Fiji para calcular la distribución de tamaño lateral.
2.2. Cultivos y crecimiento de hongos.
Cepas axénicas de los basidiomicetos del hongo de la pudrición blanca
Bjerkandera adusta(Willd.) P. Karst. (cepa nr. CBS 595.78) yPhanerochaete
chrysosporium(Fr.) P. Karst. (CBS 246.84), y el ascomiceto del suelo Morchella
esculenta(L.) Pers. (CBS 172.73) se adquirieron del Westerdijk Fungal
Biodiversity Institute (Utrecht, NL). Los hongos se subcultivaron en
recipientes Microbox Junior 40 (Duchefa Biochemie, NL) llenos con 20 g de
medio de agarosa de extracto de malta sólido compuesto por 30 g L-1
extracto de malta; 5 g L-1peptona de la carne; 15 g L-1agar y crecido en
condiciones de poca luz (c. 18µmol fotones m-2s-1) usando un ciclo de
14/10 hrs de luz/oscuridad a 20◦C hasta el desarrollo de abundante
biomasa.
2.3. Crecimiento fúngico con FLG
Se llevó a cabo un experimento preliminar para evaluar si la presencia de FLG
en los medios de cultivo tenía un efecto negativo sobre el crecimiento de las
especies de hongos de prueba. La biomasa fúngica se cosechó de cultivos sólidos
(descritos enSección 2.2) pesado, resuspendido en medio glucosado de extracto
de malta líquido (MEG) (Muzikář et al., 2011) a una concentración de 50 mg mL-1
(peso fresco) y homogeneizado con un triturador de tejidos (VWR, EE. UU.).
Alícuotas de 200µL se inocularon en matraces Erlenmeyer estériles llenos con 10
ml de MEG enriquecido con 0, 12,5 y 50µg ml-1de FLG. Los cultivos se mantuvieron
en la oscuridad a 20◦C para 1 (T1), 2 (T2) y 4 (T3) meses. Cada condición de cultivo
para cada punto de tiempo (T1–3) se preparó por triplicado. Los cultivos se
rellenaron periódicamente con MEG puro o enriquecido con lignina para
compensar la evaporación del agua y el agotamiento de nutrientes durante la
prueba.
2.4. Experimento de degradación
Para evaluar la capacidad de los hongos de prueba para degradar FLG, 200µL
de suspensiones fúngicas homogeneizadas se inocularon en matraces Erlenmayer
estériles de 25 mL llenos con 10 mL de MEG puro (cultivos de control; Ctrl) y en
MEG enriquecido con FLG, lignina coloidal o ambos (FLG y/o cultivos enriquecidos
con lignina: respectivamente, F , L, F+L) a una concentración de
F. Candotto Carniel et al.
25µg ml-1; La lignina coloidal se preparó segúnKurek et al. (1990). Para determinar
si la presencia de materiales biológicos (es decir, la pared celular y los
componentes citoplásmicos liberados por las células muertas) y/o los compuestos
del medio de crecimiento contribuyen a modificar FLG por sí mismos, se
prepararon dos conjuntos adicionales de frascos que contenían MEG enriquecido
con FLG. : uno no fue inoculado (NI) y el otro fue inoculado (un matraz por especie)
con micelio muerto (DM; desvitalizado en autoclave). Los cultivos de control, FLG y/
o enriquecidos con lignina se prepararon por triplicado y se cultivaron en las
mismas condiciones descritas enSección 2.3.
2.5. Evaluación de la transformación/degradación de FLG por hongos
120µSe tomaron muestras de L de MEG enriquecido con FLG en T0 (es decir,
antes de la inoculación) y en T3 de cultivos tratados, NI y DM. Las alícuotas
muestreadas se trataron con lavados secuenciales de tres pasos (1: SDS 30 g L-1; 2:
HCl 1 M; 3: 100% etanol) siguienteYang et al. (2019)para liberar FLG del micelio
restante. En cada paso, se separó FLG de la solución de lavado mediante filtración
al vacío en un filtro de 0,025µFiltro-membrana MF-Millipore de malla m (diám. 2,5
cm, Merck, D). FLG se recuperó empapando la membrana del filtro en 1 ml de
Milli-Q H2O, y luego sonicar la membrana durante 5 minutos. Antes de los
experimentos, el posible efecto de este proceso de lavado en FLG se probó
mediante espectroscopia Raman. No se detectaron cambios en el espectro Raman
de FLG. Dos alícuotas de 30 y 7µL se recogieron y se depositaron en portaobjetos
de vidrio Polysine (Thermo-Scientific, EE. UU.; n = 3) y rejillas de carbono puro (3
mm, malla 200; n = 3), respectivamente. Los portaobjetos de vidrio y las rejillas
TEM se secaron sobre gel de sílice durante 48 horas y luego se analizaron de la
siguiente manera. El análisis Raman se llevó a cabo con un microscopio inVia
Raman (Renishaw, Reino Unido) centrándose en entre 6 y 30 escamas FLG a 532
nm con un 50×objetivo y una potencia incidente del 1% (1 mWµmetro-2). Las
observaciones TEM se realizaron con un microscopio electrónico Philips EM208
(Philips, N) operando a 100 kV y equipado con una cámara Quemesa EMSIS
(EMSIS, D).
2.6. Evaluación de la actividad de peroxidasa/laccasa y LiP
A continuación, se filtraron 2 ml de control (T0) y MEG enriquecido con FLG con
una jeringa con punta filtrada (0,2µmetro). La muestra de control se utilizó para
detectar la actividad inicial de las peroxidasas/laccasas genéricas y las lignina
peroxidasas (LiP) en medios de cultivo mediante métodos colorimétricos,
proporcionando el sustrato primario específico de la enzima, es decir, 2,2-azinobis-
(3-etilbenzotiazolina-6- sulfonato) (ABTS), alcohol veratrílico (VA) y H2O2según sea
apropiado. La actividad de la peroxidasa/lacasa genérica se detectó tras la
producción dependiente de enzimas del radical catiónico ABTS (ABTS•+)(Bach et al.,
2013) sumando 168µL de ABTS (84 mM) y 0,4 µL de H2O2(210 mM) [Nota: la adición
de H2O2solo era necesario para
B. adustayP. chrysosporiumculturas] a 832µL de MEG filtrado. De manera
similar, la presencia de LiP se detectó midiendo la producción de
veratraldehído, que es un subproducto de la actividad de LiP derivado de la
oxidación de VA (Ten y Kirk, 1988). Para este ensayo, 5.6µL de VA (1,5 M) y
0,4µL de H2O2(210 mM) se agregaron a 996µL de MEG filtrado. El cambio de
absorbancia debido a la acumulación de ABTS•+y se siguió el veratraldehído
durante un período de incubación de 45 minutos, a 734 y 310 nm
respectivamente con un espectrofotómetro Jenway 7315 UV/VIS (Bibby
Scientific, Reino Unido). Cuando los ensayos enzimáticos dieron resultados
negativos, las mediciones espectrofotométricas se repitieron después de 24
horas. Los valores de absorbancia de ambos ensayos enzimáticos se
refirieron a los de las muestras en blanco preparadas sin la adición de H2O2.
2.7. pH y H2O2contenido en medios de cultivo
Al finalizar el experimento, cuando todos los cultivos fúngicos alcanzaron
la fase de crecimiento estacionario, el medio de crecimiento restante de
control y cultivos enriquecidos con FLG y/o lignina se dividió en dos alícuotas
de ~3 y 0,5 ml. La primera alícuota se utilizó para medir el pH utilizando un
pH-metro Crison Basic (Crison, S). La segunda alícuota se filtró (como se
explicó anteriormente) con una jeringa con punta filtrada (0.2µmetro),
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diluido 1:1 con cloroformo puro, vortex y centrifugado durante 1 min a
350×g para eliminar proteínas y enzimas que podrían causar H2O2
agotamiento con el tiempo. Luego se recuperó el sobrenadante y H2O2
contenido se cuantificó colorimétricamente usando el Amplex Red®kit (Life
Technologies, EE. UU.). El cambio de absorbancia se controló a 560 nm con
un lector de microplacas BioTek ELx808 (Biotek Instruments, EE. UU.). H2O2
concentración se evaluó mediante una curva de calibración construida sobre un
0,625-50µgama M. La calidad de las mediciones se evaluó mediante el análisis de
muestras de control con una cantidad conocida de H2O2.
2.8. Dinámica de crecimiento
El aumento de biomasa de cultivos fúngicos se controló
gravimétricamente desde T1-T3 durante los experimentos preliminares y de
degradación. El micelio a granel se separó del medio restante utilizando
pinzas. Posteriormente se recogieron fragmentos muy pequeños o conidios
después de centrifugar (2 min a 9000×gramo). El sobrenadante restante se
descartó y la biomasa recuperada por centrifugación se combinó con el
micelio a granel en tubos de Eppendorf previamente pesados, empapados
en nitrógeno líquido.2y liofilizado durante 72 h. Se midieron los pesos secos
de biomasa (n = 3) pesando los tubos y restando el peso de tara del tubo.
2.9. Análisis de los datos
Se usaron mediciones de biomasa relacionadas con los experimentos
preliminares y de degradación para probar si las concentraciones
seleccionadas de FLG (0, 12.5 y 50µg ml-1) o la composición del medio de
crecimiento (Ctrl, F, L, F+L) afectaron el crecimiento fúngico a lo largo del
tiempo (T1–3). En particular, los valores promedio de biomasa específicos de
especies calculados para cada condición de crecimiento se compararon
estadísticamente con un ANOVA de dos vías, seleccionando "puntos de
tiempo" y las "concentraciones de FLG" o "puntos de tiempo" y "composición
de medios de crecimiento" como factores categóricos para los resultados de
los experimentos preliminares y de biodegradación, respectivamente. Los
valores de absorbancia relacionados con los dos ensayos enzimáticos se
expresaron comoµmol de ABTS o VA estandarizados por unidad de biomasa.
Diferencia significativa en términos de H2O2El contenido en cultivos fúngicos
específicos de especie en función de la composición del medio de
crecimiento (es decir, Ctrl, F, L, F+L) en T3 se evaluó mediante ANOVA no
paramatemétrico de Kruskal-Wallis. Antes del análisis estadístico, los
espectros Raman se preprocesaron para eliminar los picos y la señal de
fluorescencia debido a la presencia de compuestos fúngicos residuales en
las muestras analizadas. Los espectros se corrigieron restando la señal de la
línea de base con funciones polinómicas y se suavizaron utilizando el
algoritmo de filtro de suavizado de Savitzky-Golay (Lieber y Mahadevan-
Jansen, 2003). Luego, para verificar si los hongos pueden haber modificado
la FLG, los valores I(D)/I(G) derivados de espectros Raman de cultivos
enriquecidos con FLG en fase estacionaria (es decir, T3) se analizaron con un
ANOVA de dos vías. Esta comparación estadística se realizó seleccionando la
ausencia/presencia del inóculo (ie “inoculum”) y la presencia/ausencia de
lignina o micelio muerto (ie “compuestos”) como factores categóricos. A
continuación, se llevó a cabo un análisis estadístico más profundo de los
espectros Raman completos utilizando técnicas multivariadas, como el
análisis de componentes principales (PCA) y los análisis de conglomerados
(CA), con el objetivo de identificar más diferencias en los espectros de las
escamas de FLG expuestas a diferentes especies de hongos. en diversos
medios de crecimiento.
3. Resultados y discusión
in vitroEl cultivo de hongos se ha utilizado con frecuencia para estudiar la
forma en que los hongos descomponen la materia orgánica muerta y la hojarasca
(Ten Have y Teunissen, 2001), y contaminantes orgánicos persistentes (Pinedo-
Rivilla et al., 2009). Este enfoque se utilizó aquí para verificar si dos basidiomicetos
de podredumbre blanca que degradan la madera y un ascomiceto saprotrófico
son capaces de biodegradar FLG. Sin embargo, incluso en condiciones ideales y
F. Candotto Carniel et al. Revista de materiales peligrosos 414 (2021) 125553

En condiciones controladas, la presencia de una sustancia potencialmente tóxica
en el ambiente de crecimiento podría afectar negativamente la fisiología del
hongo, alterando el crecimiento o incluso causando la muerte del organismo.
Hasta la fecha, solo Yang y sus colegas (Yang et al., 2019) han observado efectos
negativos sobre la estructura morfológica y el desarrollo del micelio de
P. chrysosporiumcuando se expone a altas concentraciones de óxido de grafeno
(GO≥2 mg ml-1). Hasta el momento no hay reportes en la literatura sobre efectos
tóxicos de FLG en hongos, aunque se sabe que FLG puede causar efectos
negativos principalmente por la dureza y delgadez de sus hojuelas (Montagner et
al., 2017). En este estudio, se evaluó preliminarmente el efecto de los GRM en el
crecimiento de hongos seleccionados mediante la incubación de cultivos líquidos
de hongos con concentraciones de FLG de 0 a 50µg ml-1durante uno (T1), dos (T2)
y cuatro (T3) meses. Los resultados muestran que hasta 50µg ml-1de FLG, el
crecimiento fúngico no se vio significativamente afectado (Figura S1; Tabla S1),
incluso si las hifas estuvieran en contacto directo con los agregados FLG (verFigura
S2b,d). Por esta razón, el experimento sobre la capacidad de biodegradación de
los hongos se llevó a cabo utilizando una concentración de FLG (25µg ml-1)
intermedio al rango antes mencionado.
3.1. Crecimiento fúngico y cambios microambientales que respaldan
procesos biodegradables
Los cambios microambientales que respaldan los procesos biodegradativos se
monitorearon durante T1-T3 evaluando la presencia de enzimas oxidantes (lacasa/
peroxidasa y lignina peroxidasa) y H2O2en medios de crecimiento de diferente
composición, es decir.medio de glucosa de extracto de malta pura (MEG; Ctrl) y
MEG enriquecido con 25µg ml-1de FLG (F), lignina (L) o ambos (F + L).
En T1, cuando los cultivos fúngicos desarrollaron una biomasa que oscilaba
entre 21± 6 mg (peso seco,M.esculenta) a 26±2 miligramos (B. adusta) (Figura 1a-
c), ABTS•+producción relacionada con la actividad de lacasa/peroxidasa, fue de 7,6
y 6,7µmg-1(sobre peso seco fúngico; dw) enB. adustayP. chrysosporium medios de
crecimiento, respectivamente (Figura 1d, e), mientras que no fue detectable en
M.esculenta(Figura 1f), incluso después de 24 h de incubación (ver materiales y
métodos).
Como era de esperar, la actividad de la lignina peroxidasa (LiP), expresada
como un aumento del contenido de veratraldehído, solo se detectó enB. adusta

Figura 1.Biomasa fúngica (ac) enBjerkandera adusta,Phanerochaete chrysosporiumyMorchella esculentacultivos crecieron en medio de crecimiento puro (C) o enriquecido con 25µg ml-1
de lignina (L), FLG (F) o ambos (F+L) durante uno (T1), dos (T2) y cuatro (T3) meses. Las letras encima de las barras en ac indican diferencias estadísticamente significativas (ANOVA de dos
vías, prueba post-hoc HSD de Tuckey) entre cultivos de la misma especie (n = 3). Presencia de enzimas oxidativas (laccasa/peroxidasa y lignina peroxidasa) en los medios de crecimiento
antes mencionados después de T1-T3, expresada como ABTS•+(df) y contenido de veratraldehído (Vald) (gi) [µM por mg de peso seco fúngico (peso seco)].

4
F. Candotto Carniel et al.
(3.5µmg-1dw) yP. chrysosporium(5.9µmg-1dw) culturas (Figura 1g–i), ya
queM.esculentano produce LiP (Papinutti y Lechner, 2008).
De T1 a T2,B. adustayP. chrysosporiumaumentaron su biomasa en 4,2 y 3,7
veces respectivamente (Figura 1a, b). No se observó un aumento proporcional en
la actividad enzimática en los medios de crecimiento de ambos hongos de la
pudrición blanca, lo que resultó en una disminución tanto en el ABTS•+
y contenido de veratraldehído en la biomasa fúngica seca (Figura 1d, e, g, h). En
comparación,M.esculentala biomasa no aumentó significativamente con respecto
a T1 (Figura 1C). Sin embargo, el ABTS•+contenido en los medios de crecimiento se
hizo detectable después de 24 h de incubación, con un contenido máximo de 1,3µ
mg-1dw (Figura 1F).
De T2 a T3,B. adustayP. chrysosporiumlos cultivos dejaron de crecer (con
pocas excepciones) y se observó una ligera disminución de la actividad enzimática
extracelular (Figura 1g, h). Por el contrario, la biomasa enM.esculentacultivos
aumentó de 1,8 a 3,4 veces, mientras que el ABTS•+el contenido fue de 2,2 a 6,6
veces mayor, con respecto a T2, para los cultivos Ctrl y F, respectivamente. (Figura
1c, f). Contrariamente a informes anteriores, el medio enriquecido con lignina (L)
no estimuló el crecimiento de hongos de pudrición blanca (Figura 1a–c) o
producción de enzimas que degradan la lignina (Figura 1d-i) pero, curiosamente,
pareció disminuir la actividad de lacasa/peroxidasa enM.esculentamedio de
crecimiento (Figura 1f) en comparación con medios de crecimiento libres de
lignina (cultivos Ctrl y F). Este último resultado está de acuerdo con la hipótesis de
que las lacasas podrían usar fragmentos de lignina fenólica liberada como
mediadores en la oxidación de la lignina restante.Ten Have y Teunissen, 2001), por
lo que compite con ABTS.
En T3, cuando todos los cultivos alcanzaron la fase estacionaria, H2O2Se midió el
contenido y el pH en los medios de cultivo. Como se observa para las mediciones de
biomasa y actividad enzimática, H2O2contenido difirió entre las especies, pero no entre
las condiciones de crecimiento (Figura 2C.A). La H más alta2O2
se detectó contenido enM.esculenta(122±mg de 3 nM-1dw) mientras que el más
bajo enP. chrysosporium(26±mg de 15 nM-1dw) (Figura 2antes de Cristo). La H alta
2O2contenido enM.esculenta(~4 veces superior con respecto a los cultivos de
basidiomicetos) explica por qué el ensayo ABTS se pudo realizar sin añadir más
cantidades de este sustrato primario. Es importante destacar que el pH del medio
de crecimiento disminuyó de ~5,5 en T0 a ~3,0 en T3, lo que confirma que todos
los hongos pudieron liberar enzimas oxidativas y su sustrato oxidante primario (H
2O2) y disminuir el pH a valores en el rango óptimo para la actividad de las
enzimas antes mencionadas (Pollegioni et al., 2015). Por lo tanto, estas mediciones
confirmaron que todos los hongos probados crearon las condiciones necesarias
para mantener un microambiente oxidativo/degradante, sin verse afectado por la
presencia de FLG.
3.2. Modificaciones de FLG inducidas por podredumbre blanca y hongos saprotróficos
caracterización FLG. La caracterización química y física reveló un
alto grado de pureza en el FLG utilizado en este estudio. Análisis
elemental y disminución de peso (registrado por TGA, ca. 3% a 600◦C)
Figura 2.H2O2contenido en medio de cultivo puro (C) o enriquecido con 25µg ml-1de lignina (L), FLG (F) o ambos (F+L) deBjerkandera adusta,Phanerochaete chrysosporium yMorchella
esculentacultivos después de cuatro meses (T3) de incubación. Los valores se expresan como medias.±sd (n = 3) por peso seco de biomasa fúngica.
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Revista de materiales peligrosos 414 (2021) 125553
confirmó una falta de contaminación y grupos funcionales respectivamente,
demostrando que FLG estaba compuesto por>95% C (Figura S3). El espectro
Raman se caracterizó por un pico intenso que apareció a ~1580 cm-1, la
banda G y dos picos menos intensos adicionales a ~1345 y ~2700 cm-1, las
bandas D y 2D respectivamente (Figura S3). La relación entre la intensidad (I)
de las bandas D y G es un indicador de la presencia de defectos en la red de
grafeno. En este caso I(D)/I(G) = 0,46 lo que confirma un bajo nivel de
defectos que suele atribuirse a los bordes de las láminas micrométricas (
Torrisi et al., 2012). Además, el I(2D)/I(G) = 0.43, es consistente con los
valores (<1) reportado en la literatura para este material (Ferrari et al., 2006;
Mogera et al., 2015). La observación de TEM reveló que el tamaño lateral
promedio de las escamas FLG era 509±233 nm, pero también se detectaron
copos inferiores a 100 nm (Fig. S3c–d).
Porque carece de grupos funcionales y defectos en su red (Denis e Iribarne,
2013), FLG es el más similar al grafeno monocapa en términos de reactividad
química entre todos los GRM. Por las razones antes mencionadas, se consideró
que FLG era el mejor candidato para desafiar las capacidades enzimáticas de los
hongos saprotróficos y/o degradadores de la madera. Para este propósito, se
utilizó el análisis Raman para distinguir las formas reducidas de oxidadas de GRM (
Kaniyoor y Ramaprabhu, 2012) incluso cuando están pobremente concentrados y/
o ligeramente cubiertos por matrices biológicas (es decir, material fúngico o
compuestos de medios de crecimiento) que se sabe que aumentan la señal de
fluorescencia (Lieber y Mahadevan-Jansen, 2003). TEM se utilizó para evaluar
posibles modificaciones estructurales de FLG, como agujeros y fragmentación de
escamas.
Los medios de crecimiento contienen extractos de malta y levadura, es decir,
una mezcla de carbohidratos, proteínas y vitaminas. Durante el crecimiento de
hongos, los medios de cultivo se enriquecen progresivamente con micelios
muertos que son capaces de adsorber metales (Hemambika et al., 2011) y tintes
textiles decolorantes (Fu y Viraraghavan, 2001; Lipczynska-Kochany, 2018); estos
también podrían reaccionar potencialmente con FLG. Por lo tanto, FLG también se
expuso tanto a medios de cultivo no inoculados (NI) como a cultivos desvitalizados
(DM) para probar si los compuestos del medio de crecimiento o el micelio muerto
alteraban la red de FLG. Los espectros Raman de copos de FLG muestreados de
cultivos NI y DM en T3 tenían una intensidad de banda I(D)/I(G) y 2D muy cercana
a la observada en FLG sin tratar (Figura S4), aunque se observó un ligero cambio
en la forma de la banda 2D (Figura S4). Esto último podría estar relacionado con
cambios de carga (dopaje) en presencia del medio de cultivo (Guarnieri et al., 2018
).
Las observaciones TEM de los medios de cultivo de NI revelaron la formación
de agregados de FLG (copos de forma regular, no translúcidos; verFig. 3a frente a
b y df), que es un fenómeno común que generalmente ocurre durante unos pocos
días en medios acuosos (Widenkvist et al., 2009; Yang et al., 2011). Estos
resultados prueban que los medios de crecimiento (así como los micelios muertos)
no causaron ninguna alteración estructural en la red FLG durante la duración (4
meses) del experimento. En comparación, numerosos copos recuperados de
cultivos enriquecidos con FLG (F y F+L) de todos los hongos de prueba
F. Candotto Carniel et al.
Fig. 3.Micrografías TEM de escamas representativas de: FLG antes de la incubación con los hongos (a) y después de 4 meses de incubación en medio de crecimiento
axénico (b); óxido de grafeno (Graphenea) (c); FLG después de cuatro meses de incubación en cultivos desvitalizados (df) y vivos (gi) deBjerkandera adusta(d, g),
Phanerochaete chrysosporium(e, h) yMorchella esculenta(f, i). Barras: a, b, c, g = 100 nm; d, h = 200 nm; f, i = 400 nm; e = 500 nm.
tenía un espectro Raman caracterizado por una banda D más ancha e intensa, una banda
G desplazada (de 1582 a 1608 cm-1) y una banda 2D menos pronunciada o ausente (
Figura S4). Por lo tanto, los copos de FLG se analizaron en T3 para comparar los efectos
de los hongos una vez que alcanzaron una fase de crecimiento estacionario (Figura 1C.A).
La comparación basada en ANOVA de los valores I(D)/I(G) reveló que
Figura 4.Resultados de la comparación basada en ANOVA entre los valores I(D)/I(G)
medidos para copos de FLG (n = 248) recuperados de cultivos no inoculados (NI) en T0 y
de cultivos vivos (+/-) o desvitalizados (DM : diagrama de caja punteada) culturas de
Bjerkandera adusta(B. adu),Phanerochaete chrysosporium(P. chr) yMorchella esculenta(
M esc) sin (-) y con (+) lignina en T3. Las líneas horizontales centrales del diagrama de caja
representan valores promedio, los bigotes incluyen un rango no atípico. Los diagramas
de caja marcados con letras diferentes tienen valores promedio significativamente
diferentes.
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Revista de materiales peligrosos 414 (2021) 125553
las escamas expuestas a cultivos F y F+L tuvieron los valores más altos (
Figura 4), con un promedio de 0.670±0.270 (M.esculenta) a 0.938±0.084 (P.
chrysosporium). Según estudios dirigidos específicamente a evaluar la
oxidación del grafeno por análisis Raman, dicho aumento de la banda D
indica claramente la presencia de imperfecciones estructurales creadas por
la unión de grupos hidroxilo y epóxido en el plano basal del carbono (Allen
et al., 2010; Yang et al., 2009). Las respectivas observaciones TEM mostraron
que las escamas de FLG expuestas a cultivos fúngicos se veían
marcadamente diferentes de las de los cultivos NI y DM, con la aparición de
arrugas y pliegues en los márgenes (compararFig. 3g-yo conFig. 3C).
Los resultados de ANOVA confirmaron que el aumento de I(D)/I(G) depende de
la interacción entre el "inóculo" y los "compuestos" (Tabla S2). De modo que,
mientras FLG se escama de vivirP. chrysosporiumLos cultivos tenían valores I(D)/
I(G) significativamente altos independientemente de la presencia de lignina (
Figura 4), los deB. adustamostró un aumento significativo de I(D)/I(G) solo cuando
el hongo se cultivó en medios de cultivo enriquecidos con lignina (Figura 4). Copos
FLG deM.esculentalos cultivos en comparación tenían valores de I(D)/I(G) no
significativamente diferentes de los cultivos de NI y DM respectivos, aunque se
observó un aumento promedio (+40%) (Figura 4). Este resultado sugiere que no
todos los hongos de prueba liberan enzimas y moléculas que son capaces de
oxidar significativamente FLG a un material similar a GO.
Para corroborar estos resultados, los espectros Raman completos se analizaron
adicionalmente mediante el análisis de componentes principales (PCA) junto con un
análisis de conglomerados (CA). PCA reveló que el 88,2% de la varianza de todos
F. Candotto Carniel et al.
El espectro Raman (n = 248) fue explicado por el primer (76,9%) y el segundo
(11,3%) componentes principales (PC;Figura 5A): PC1 se correlacionó
negativamente con la intensidad de la banda D (r= -0,88) y la dispersión Raman
registrada a 1608 cm-1(r= −0,97), la banda D' (Figura 5A), mientras que PC2 se
correlacionó positivamente (r=0,60) a la intensidad de la banda 2D. El aumento de
la intensidad y amplitud de las bandas D y D' están generalmente asociados con la
oxidación de la red de grafeno (Kaniyoor y Ramaprabhu, 2012), un proceso que
causa el cambio de la banda G de ~1589 cm-1a ~1608cm-1(Kudin et al., 2008).
Además, los GRM oxidados tienen una banda 2D más ancha y menos pronunciada
que generalmente se describe como una protuberancia modulada en esta región (
Kaniyoor y Ramaprabhu, 2012). Por lo tanto, los espectros proyectados dentro del
primer y segundo trimestre están relacionados con escamas de FLG "inalteradas"
o no oxidadas (n = 105), mientras que los del tercer y cuarto trimestre están
relacionados con escamas de FLG oxidadas a un material similar a GO (n = 143) (
Figura 5A).
Curiosamente, el CA reunió los espectros proyectados en cuatro grupos ("a–d";
Figura 5A), separando las escamas inalteradas (grupo a) de las escamas oxidadas
(grupos bd). Además, los espectros promedio de los grupos “b–d” revelaron la
presencia de un gradiente de oxidación de “b” a “d”, reconocible por un aumento
significativo progresivo de la intensidad de la banda I(D)/I(G) y D' (Figura S5a, b) y
una disminución de la intensidad de la banda 2D (Figura S5c). Sin embargo, los
grupos se superponen parcialmente porque incluyen escamas con un grado de
oxidación similar.
En resumen, (i) el resultado de ANOVA (Tabla S2) indicando que sólo
B. adustayP. chrysosporiumson capaces de inducir un aumento significativo de I(D)/I(G)
no es del todo fiable y (yo) La oxidación de FLG puede ser iniciada por todas las especies
fúngicas independientemente de las enzimas que secretan (consulte la sección anterior;
Figura 1). De hecho (aunque con diferentes frecuencias) se encontraron copos de FLG
altamente oxidados (es decir, los clasificados en los grupos "c" y "d") en cultivos de los
tres hongos (Figura 5B): del 43% en
P. chrysosporiumal 18% enM.esculenta. El alto porcentaje de escamas FLG
inalteradas deM.esculentacultivos (45%;Figura 5B) puede explicarse por la
tasa de crecimiento relativamente lenta de esta especie, que solo alcanzó la
fase de crecimiento exponencial y liberó una cantidad relevante
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Revista de materiales peligrosos 414 (2021) 125553
cantidad de enzimas oxidantes y H2O2en los últimos dos meses de incubación en
las condiciones probadas (higos. 1, 2). A pesar del lento crecimiento (y la falta de
lignina peroxidasa),M.esculentafue realmente capaz de oxidar FLG. Este resultado
muestra que la lacasa y la peroxidasa (Baldrian y Šnajdr, 2006) puede promover la
oxidación de GRM químicamente inertes como FLG.
3.3. Relevancia ambiental y estudios posteriores
En este estudio, se demostró que hongos seleccionados pueden oxidar FLG a
un material similar a GO. Considerando que las enzimas utilizadas en este estudio
son producidas por numerosos descomponedores primarios, y que los procesos
oxidativos forman la base de la biodegradación de la materia orgánica (Baldrian y
Šnajdr, 2006; Sinsabaugh, 2010), se puede plantear la hipótesis de que el FLG
liberado involuntariamente en los ecosistemas terrestres podría degradarse
lentamente por la microflora del suelo durante períodos prolongados, como se
observa para otros compuestos altamente recalcitrantes como los PAH (Pérdida
de Ostrem y Yu, 2018) y contaminantes organohalogenados (Vyas et al., 1994;
Čvančarová et al., 2012; Mori et al., 2017). Por lo tanto, es posible que un período
de incubación más largo que los cuatro meses probados aquí podría haber llevado
a un grado de oxidación avanzado de FLG, caracterizado por agujeros en la red de
grafeno seguido de fragmentación de escamas, como se observó en experimentos
de degradación de FLG in vitro con seres humanos. mieloperoxidasas (Kurapati et
al., 2018). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, hasta la fecha, no se sabe
nada sobre la posible interacción con los componentes del suelo del material GO-
like derivado de la oxidación fúngica, como se observa en cambio para otros GRM
con materia orgánica natural en ambientes acuáticos (Dimiev et al., 2013; Jiang et
al., 2017). Nuestros datos indican claramente que las enzimas fúngicas pueden
oxidar de manera eficiente uno de los GRM más estables, el FLG, lo que debilita la
hipótesis de que dichos materiales podrían persistir en el medio ambiente durante
largos períodos. Por lo tanto, la investigación futura debería abordar si el material
similar a GO derivado de hongos podría degradarse aún más hasta su conversión
completa en CO2por la microflora del suelo.
Figura 5.Análisis de componentes principales (PCA)
de los espectros Raman de copos de FLG (n = 248)
recuperados de cultivos no inoculados en T0 (NI;
cuadrados) y de cultivos vivos o desvitalizados (DM:
triángulos) deBjerkandera adusta (B. adu),
Phanerochaete chrysosporium(P. chry) yMorchella
esculenta(M esc) sin (-; símbolos en colores claros) y
con (+; símbolos en colores oscuros) lignina en T3
(círculos) (A). Los espectros Raman en el espacio PCA
se proyectaron de acuerdo con los dos primeros
componentes principales (PC). Los vectores azul
oscuro representan la contribución del cambio del
número de onda Raman principal para explicar la
varianza de los datos. Las elipses de concentración
negras, moradas, rojas y azules definen cuatro
grupos principales (ad, respectivamente) identificados
con Cluster Analysis (CA). El inserto en (A) en la parte
superior derecha muestra los espectros promedio de
los cuatro grupos. Diagramas circulares del
porcentaje de espectros Raman clasificados por
especies (cultivos vivos) y grupos de anuncios (B).
(Para la interpretación de las referencias al color en
esta figura, se remite al lector a la versión web de
este artículo).
F. Candotto Carniel et al.
Fondos
Este trabajo ha recibido financiación del programa de investigación e
innovación de la Unión Europea Horizonte 2020 Graphene Flagship bajo el
acuerdo de subvención No 785219 y 881603, el Ministerio de Economía y
Competitividad de España (Proyecto CTQ2017-88158-R) y la Junta de
Comunidades de Castilla-La Mancha. (Proyecto SBPLY/17/180501/ 000204).
M. Prato es el destinatario de la Cátedra AXA de Bionanotecnología
(2016-2023). Parte de este trabajo se ha realizado en el marco del Programa
de Unidades de Excelencia María de Maeztu de la Agencia Estatal de
Investigación de España – Subvención nº MDM-2017-072 0.
Declaración de contribución de autoría CRediT
Fabio Candotto Carniel: Conceptualización, Investigación, Metodología,
Supervisión, Visualización, Redacción - borrador original.lorenzo fortuna:
Conceptualización, Metodología, Análisis formal, Investigación, Visualización,
Redacción - borrador original.David Zanelli: Investigación, Metodología.
Marina Garrido: Investigación, Análisis formal, Metodología.Viviana Jehová
González: Investigación, Análisis formal.Ester Vázquez:Recursos, Redacción:
revisión y edición.Mauricio Prato: Adquisición de fondos, Administración de
proyectos, Recursos, Supervisión, Redacción - revisión y edición.Mauro
Tretiach: Conceptualización, Adquisición de fondos, Administración de
proyectos, Recursos, Supervisión, Visualización, Redacción - revisión y
edición.
Declaración de interés en competencia
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni
relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo
informado en este documento.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Luigi Camerlenghi (Trieste), por su ayuda en el
laboratorio, a Alicia Fraile e IRICA por sus servicios en la caracterización de FLG, al
Dr. Paolo Bertoncin del centro de microscopía TEM de la Universidad de Trieste
por las observaciones de FLG TEM y a la Dra. Marina Tretiach (Universidad de
Sydney, AUS) para revisión en inglés.
Apéndice A. Información de apoyo
Los datos complementarios asociados con este artículo se pueden encontrar
en la versión en línea endoi:10.1016/j.jhazmat.2021.125553.
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