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Ecotoxicología y seguridad ambiental 100 (2014) 218–225

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Ecotoxicología y Seguridad Ambiental

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Toxicidad comparativa de carbarilo, carbofurano, cipermetrina

y fenvalerato en Metaphire posthuma y Eisenia fetida.
—Un posible mecanismo
PN Saxena, SK Gupta, RC Murthy
norte

División de Biología Celular CSIR­Instituto Indio de Investigación en Toxicología, Lucknow 226001, India

información del artículo abstracto

Historia del artículo: Para establecer el uso de Metaphire posthuma como modelo de prueba sensible para estudios ecotoxicológicos, se llevaron a cabo pruebas de
Recibido el 1 de julio de 2013
toxicidad aguda de carbarilo, carbofurano, cipermetrina y fenvalerato en Eisenia fetida y Metaphire posthuma. Se utilizaron dos tipos diferentes de
Recibido en forma revisada
bioensayos, los bioensayos de toxicidad del papel de filtro de contacto y los bioensayos de toxicidad del suelo para determinar los valores de
8 de noviembre de 2013
LC50 para estos insecticidas. Entre los productos químicos probados, el carbofurano fue el más tóxico para ambas especies de lombrices. En el
Aceptado el 11 de noviembre de 2013
Disponible en línea el 7 de diciembre de 2013. método de contacto con papel, se encontró que los valores de CL50 de 72 h de carbofurano en M. posthuma y E. fetida fueron 0,08 μg/cm2 y 1,55
μg/cm2 respectivamente, mientras que en la prueba de suelo, los valores de LC50 de 14 días fueron de 0,49 mg/kg y 21,15 mg/kg respectivamente.
Palabras clave:
Al comparar los datos de toxicidad de estos químicos para ambas especies de lombrices de tierra, se encontró que M. posthuma era más sensible
Toxicidad aguda de las lombrices de tierra
que E. fetida. Según los datos de toxicidad aguda, el orden de toxicidad de los insecticidas en ambos procedimientos de prueba fue
Carbofurano y carbarilo
carbofurano4cipermetrina4carbaril4­fenvalerato para M. posthuma mientras que para E. fetida fue carbofurano4carbaril4fenvalerato4cipermetrina.
Cipermetrina y fenvalerato
Cálculos de orbitales moleculares.

espectro FTIR También aparecieron cambios morfológicos en los organismos expuestos a estos químicos, que fueron más pronunciados en M. posthuma en
Mecanismo de toxicidad concentraciones más bajas que en E. fetida en ambos procedimientos de prueba. Los resultados del presente estudio abogan por el uso de M.
posthuma para estudios de ecotoxicidad, siendo un modelo más sensible y confiable que E. fetida. A partir de datos sobre cargas atómicas
parciales, características estructurales y estudios espectroscópicos del carbarilo y carbofurano, se propuso un posible mecanismo de toxicidad de
los insecticidas carbamatos en las lombrices.

& 2013 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

1. Introducción
Las lombrices de tierra son invertebrados del suelo económicamente
importantes, representan entre el 60% y el 80% de la biomasa total del suelo y
potencialmente mantienen la estructura, la textura y la fertilidad de los suelos
aumentando la aireación y el drenaje a través de sus actividades de excavación,
alimentación y evacuación (Edwards y Lofty, 1977 ) . Estas características
funcionales confieren a las lombrices de tierra organismos del suelo ideales para su uso enpara pruebas deterrestre.
ecotoxicología toxicidad ciertamente aumentará la batería de pruebas de
En comparación con otros invertebrados terrestres como colémbolos, termitas, etc.
(Da Luz et al., 2004; Hentati et al., 2013), las lombrices de tierra son más sensibles
a los componentes contaminantes del suelo como insecticidas, lixiviados industriales
y metales, etc., por lo que se consideran bioindicadores confiables para la calidad
del suelo. Eisenia fetida es la única especie de lombriz de tierra hasta el momento
aprobada por normas internacionales para pruebas de toxicidad aguda de sustancias
químicas ambientales (OCDE, 1984; CEE, 1985). Es una especie que habita en
abono y se utiliza para la cría en cautiverio, que no es
Autor correspondiente. Dirección actual: Científico y jefe de la Unidad de Análisis de Contaminantes y
norte
común en suelos naturales. Sin embargo, su representante ecológico para las
especies que habitan en el suelo ha sido controvertido (Dean­Ross, 1982; Edwards
y Coulson, 1992; Reinecke y Reinecke, 2004; Pelosi et al., 2013). Desde un punto
de vista ecotoxicológico, existe una gran necesidad de validar especies indias de
lombrices para la evaluación de la toxicidad aguda de contaminantes ambientales
para el reflejo real de la ecotoxicidad en las condiciones indias y comparar su
susceptibilidad a diversos agroquímicos. Además, la validación de nuevos modelos
ecotoxicidad.
Entre las diversas especies de lombrices utilizadas para estudios de ecotoxicidad,
hemos probado la lombriz india Metaphire posthuma como posible candidata para
estos estudios. Además de la validación, los resultados de la toxicidad de varios
insecticidas pueden ser útiles para comprender el impacto final en el ecosistema del
suelo y la agricultura cuando estos gusanos excavan en el suelo hasta una
profundidad de 30 a 45 cm.
Metaphire posthuma está ampliamente distribuida en varios estados de la India
y otros países asiáticos (Bantaowong et al., 2011; Chaudhuri et al., 2012). Tiene un
cuerpo cilíndrico, largo, estrecho, bilateralmente simétrico, bien adaptado para

excavar. Un gusano maduro mide alrededor de 150 mm de largo y de 3 a 5 mm de

Productos Químicos, CSIR­Instituto Indio de Investigación Toxicológica, Lucknow 226001, India. Fax: þ91 522
2611547.
espesor. Son hermafroditas, pero su reproducción se produce por fecundación
Direcciones de correo electrónico: murthyrc@rediffmail.com, cruzada mediante el intercambio de sus espermatozoides. Los óvulos son
pnsaxena62@rediffmail.com (RC Murthy). fecundados por los espermatozoides.

0147­6513/$ ­ ver portada y 2013 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados. http://dx.doi.org/
10.1016/j.ecoenv.2013.11.006
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PN Saxena et al. / Ecotoxicología y seguridad ambiental 100 (2014) 218–225
células en el capullo que se desarrolla hasta convertirse en un gusano maduro. El
período normal de eclosión de un capullo es de 45 a 60 días.
Los insecticidas se utilizan ampliamente en la agricultura para aumentar masivamente
la producción de alimentos. En el presente estudio se utilizaron dos clases diferentes
de insecticidas: carbamato y piretroide sintético.
Se sabe que los insecticidas carbamatos son fuertes inhibidores de la acetilcolinesterasa
de los tejidos nerviosos y se utilizan para controlar los insectos que se alimentan de las
hojas y que habitan en el suelo (Gupta y Sunderaraman, 1988).
Los piretroides sintéticos tienen una mayor eficiencia, una vida media relativamente más
corta en el suelo y una menor toxicidad para los mamíferos. Alteran la función normal de
los nervios de los insectos modificando la cinética de los canales de sodio sensibles al
voltaje (Soderlund et al., 2002). Sin embargo, las altas concentraciones de insecticidas
en el suelo pueden afectar la población de lombrices. Se han documentado numerosos
estudios sobre los efectos de los insecticidas en diversas especies de lombrices de
tierra (Luo et al., 1999; Gupta et al., 2010; De Silva et al., 2010) , pero los estudios
comparativos de diferentes insecticidas en dos especies de las lombrices de tierra son
escasas.
Por lo tanto, se vuelve importante un estudio comparativo sobre la toxicidad de diferentes
insecticidas en diferentes especies para identificar especies más sensibles que se
utilizarán como modelo para evaluaciones de toxicidad de contaminantes ambientales.
La actividad biológica de los insecticidas probados en lombrices de tierra depende
principalmente de su interacción con proteínas/lípidos (Gupta y Sundararaman, 1988;
Mosley et al., 2003a; Tripathi y Bhardwaj, 2005). Los parámetros moleculares como la
forma, el tamaño, la geometría, la orientación y la polarizabilidad desempeñan un papel
importante en dichas interacciones.
Las densidades de carga de valencia obtenidas a partir de cálculos de orbitales
moleculares y datos espectroscópicos se pueden utilizar para comprender el mecanismo
de acción de estos insecticidas en las lombrices de tierra a nivel molecular. Anteriormente
se informaron estudios similares sobre la bioactividad de los insecticidas ciclodienos y
el diurón (Saxena et al., 2004; Saxena y Gupta, 2005).
La actividad biológica dependiente de la estructura de los insecticidas carbamatos
también se ha documentado en la literatura (Eya y Talcottt, 1980; Feaster et al., 1996).
En el presente estudio, informamos la toxicidad aguda de carbarilo, carbofurano,
cipermetrina y fenvalerato en dos especies de lombrices de tierra, E. fetida y M.
posthuma utilizando bioensayos de toxicidad de papel de filtro de contacto y toxicidad
del suelo para identificar las especies más sensibles que se utilizarán como Modelo para
pruebas de toxicidad de sustancias químicas ambientales. Se midió la concentración
letal media (CL50) para determinar los niveles tóxicos de diferentes insecticidas. También
se examinaron las anomalías morfológicas y las observaciones histopatológicas
inducidas por insecticidas en las lombrices de tierra. Basándose en características
estructurales, cargas atómicas parciales y datos espectroscópicos, se ha propuesto un
posible mecanismo de acción de los insecticidas carbamato en las lombrices de tierra.
2. Materiales y métodos
2.1. Productos químicos de prueba
Cipermetrina, fenvalerato, carbarilo y carbofurano con una pureza del 99,9% se adquirieron de Sigma
(St. Louis, MO). Se prepararon soluciones madre de los compuestos de prueba en acetona y se diluyeron
con agua desionizada para producir las concentraciones de prueba finales.
2.2. Especies de prueba
Se eligieron como organismos de prueba dos especies de lombrices de tierra, E. fetida y M. posthuma.
El cultivo de E. fetida se obtuvo de una granja de cría de lombrices (Rehmankhera, Lucknow) y se mantuvo
con una dieta de estiércol de vaca. El cultivo se mantuvo en condiciones de laboratorio a 2071 1C. Para las
pruebas de toxicidad se seleccionaron al azar lombrices adultas normales con clitelo desarrollado y que
pesaban entre 350 y 450 mg. Se separaron de los cultivos 3 h antes de su uso, se enjuagaron con agua
destilada para eliminar el estiércol de vaca y se colocaron en un papel de filtro humedecido a 2071 1 C en
una incubadora de demanda biológica de oxígeno para eliminar el contenido intestinal.
La lombriz de tierra, M. posthuma, se recogió localmente del suelo húmedo cerca de la orilla del depósito de
agua en el jardín y se mantuvo en cubos de plástico con tierra artificial en condiciones de laboratorio. Fueron
aclimatados durante una semana en el suelo sin tratar.
219
antes del inicio de la prueba a 2071 1C. Se separaron lombrices de tierra sanas y cliteladas con un peso
promedio de 3,12 g, se enjuagaron con agua destilada para eliminar la tierra y se colocaron en un papel de
filtro humedecido durante 24 h para evacuar el contenido intestinal antes de la experimentación.
2.3. Método de contacto con papel de filtro
La prueba de contacto con papel de filtro se realizó según las directrices de la OCDE con ligeras
modificaciones. En lugar de utilizar viales de vidrio, para el estudio se utilizaron placas de Petri de 9 y 16 cm
revestidas con papel de filtro. Se utilizaron entre 2 y 4 ml de cada concentración de prueba para humedecer
adecuadamente los papeles de filtro colocados en placas de Petri pequeñas y más grandes, respectivamente.
Todas las cajas de Petri con papel de filtro húmedo se mantuvieron abiertas durante 30 min para evaporar la
acetona. Para cada tratamiento, incluido el control con disolvente, se utilizaron en el experimento diez
réplicas, cada una de las cuales constaba de un gusano maduro por placa de Petri.
No se utilizó más de un gusano en la placa de Petri ya que la muerte de un gusano podría causar efectos
adversos en el otro en la misma placa. Todas las placas de Petri que contenían gusanos se mantuvieron en
una incubadora de demanda biológica de oxígeno a 2071 1C.
Después del período de incubación de 24, 48 y 72 h, se registró la mortalidad y la anomalía morfológica.
Las lombrices se consideraron muertas cuando no se observó respuesta al estímulo mecánico de la aguja.
Se realizó una prueba de determinación de rango de concentraciones de las sustancias de prueba de 0,
0,1, 1,0, 10, 100 y 1.000 μg/cm2 para determinar las concentraciones que causaban una mortalidad del 0 al
100%. También se probó un rango estrecho de concentraciones de 0,05 µg/cm2 , 0,10 µg/cm2 , 0,20 µg/cm2,
0,40 µg/cm2 , 0,80 µg/cm2 , 1,60 µg/cm2 y 3,20 µg/cm2 y 6,40 µg/cm2 . Para determinar LC50,
Se utilizaron cinco concentraciones de prueba y un control.
2.4. Prueba de toxicidad del suelo.
La prueba de suelo artificial se realizó según las directrices de la OCDE con algunas modificaciones.
En lugar de un diez por ciento de turba de sphagnum, se utilizó para el estudio un 30 por ciento de estiércol
de vaca. Este cambio en la materia orgánica del suelo se realizó para garantizar un crecimiento saludable
de M. posthuma. Así, en el bioensayo del suelo, se preparó un medio de suelo artificial con 30 por ciento de
estiércol de vaca, 20 por ciento de arcilla y 50 por ciento de arena fina. Los constituyentes secos se
mezclaron en la proporción correcta y se añadió agua desionizada para dar un contenido de humedad global
de aproximadamente el 35 por ciento del peso seco. Se usó carbonato de calcio para ajustar el pH a 6.070,5.
Para cada concentración de prueba, se disolvió el insecticida deseado en 15 ml de acetona mezclada con la
tierra húmeda. Después de mezclar adecuadamente, las muestras de suelo tratadas se mantuvieron abiertas
en bandejas de plástico durante 3 h para evaporar la acetona. La pérdida de humedad del suelo de prueba
se comprobó pesando los contenedores de prueba. La tierra de control también se trató con 15 ml de acetona
de manera similar. Después de proporcionar 35 por ciento de humedad en peso en el suelo, se colocaron
diez lombrices de tierra cliteladas en cada vaso (polipropileno de alta densidad; 2 L de capacidad) que
contenía un kg de suelo tratado y se mantuvieron en una incubadora de demanda biológica de oxígeno a
2071 1 C. La mortalidad y la anormalidad se evaluaron después de 7 y 14 días. Se utilizó un rango de
concentraciones de 0, 0,1, 1,0, 10, 100 y 1000 mg/kg de suelo seco para determinar un rango de
concentración que resultó en una mortalidad de 0 a 100%. Para determinar la CL50 se utilizaron cinco
concentraciones de prueba y un control.
2.5. histopatología
Los gusanos de control y tratados se sacrificaron mediante congelación (Sharma y Satyanarayan,
2011), se cortaron en trozos de 1 cm y se fijaron inmediatamente en una solución tamponada neutra de
formaldehído al 10 por ciento durante tres días (Gupta y Sundararaman, 1990).
A la fijación le siguió un lavado con agua corriente durante 6 h. Los tejidos fijados se deshidrataron mediante
series graduadas de alcohol, se aclararon con xileno, se incluyeron en cera de parafina y se cortaron
secciones de 5 μm y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los portaobjetos se observaron con un microscopio
óptico (Nikon, Japón) para examinar los cambios histopatológicos.
2.6. análisis estadístico
Los datos de mortalidad se obtuvieron después de exposiciones a insecticidas en contacto con papel y
pruebas de suelo, y se analizaron para determinar los valores de LC50 . Se utilizó el método recortado de
Spearman­Karber (Hamilton et al., 1977) para calcular la LC50 con intervalos de confianza superior e inferior
del 95 %.
Cálculos de orbitales moleculares y mediciones espectrales FTIR Los cálculos de
orbitales moleculares se llevaron a cabo utilizando la teoría RHF con conjuntos de bases STO­3G
disponibles en el programa Gamess (Schmidt et al., 1993) para estimar cargas atómicas parciales en
carbarilo y carbofurano (insecticidas carbamatos). En los cálculos se han utilizado coordenadas de datos de
estructura cristalina (Sandoz et al., 2000; Xu et al., 2005) . Estas cargas atómicas son muy útiles para
determinar el sitio activo de un insecticida. El espectro infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) de
carbarilo se registró con una resolución de 2 cm1 en el rango de 450 a 4000 cm1 en el espectrofotómetro
Perkin Elmer 1800 (Bucks, Reino Unido).
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3. Resultados insecticidas. Ambos organismos tratados con estos químicos exhibieron signos y
síntomas progresivos como enrollamiento, curvatura, extrusión de líquido celómico con
3.1. Toxicidad de contacto movimiento lento, hinchazones segmentarias, constricciones y degeneración (Fig. 1).
En algunos gusanos, las porciones hinchadas estallan lentamente provocando lesiones
Los resultados de la toxicidad aguda de varios insecticidas con prueba de papel sanguinolentas y, en última instancia, la muerte. Los síntomas de toxicidad, como
de filtro de contacto para E. fetida y M. posthuma se presentan en la Tabla 1. Los enrollamientos, temblores y secreción excesiva de mucosa en el método de contacto,
resultados demuestran que el efecto de todos los insecticidas en ambos organismos fueron visibles dentro de las 2 h de exposición a estos insecticidas a una concentración
de prueba dependía de la concentración y que el porcentaje La mortalidad aumentó al de 0,24 μg/cm2 en M. posthuma y a 1,20 μg/cm2 en E. fetida, mientras que los cambios
aumentar la concentración de morfológicos tales como hinchazón segmentaria y llagas sangrantes ocurrieron en
ambas especies de prueba después de 48 h de tratamiento con estos tóxicos a través
Tabla 1 de papel de filtro húmedo en concentraciones similares. En algunos casos, los síntomas
Resumen de los resultados de la prueba de toxicidad aguda con papel de filtro de contacto para de toxicidad fueron específicos de un insecticida en particular, por ejemplo, se encontró
Eisenia fetida y Metaphire posthuma. una constricción severa (que probablemente se desprendiera) en la región postclitelar
en los organismos de prueba con 0,09 μg/cm2 de tratamiento con carbofurano y 0,54
Insecticidas M. posthuma E. fetida
LC50 (IC del 95 %) μg/cm2 LC50 (IC del 95%) μg/cm2
μg/cm2 con carbarilo durante 48 h hasta método de contacto con papel (Fig. 1). El
porcentaje de mortalidad y anormalidades inducidas por diversos insecticidas fue
cipermetrina 0,30 (0,22–0,39) 3,84 (3,51–4,22) mayor en M. posthuma que en E. fetida.
Fenvalerato 0,55 (0,50–0,59) 3,72 (2,83–4,87)
carbofurano 0,08 (0,07–0,09) 1,55 (1,15–2,08)
Entre los insecticidas probados, el carbofurano fue altamente tóxico para ambas
carbarilo 0,48 (0,39–0,56) 1,74 (1,43–1,89)
especies de lombrices. El orden de toxicidad basado en los valores CL50 fue

Fig. 1. Anomalías morfológicas en M. posthuma y E.fetida. (a) Llagas sangrantes en la región del clitelo (E. fetida, 1,20 μg/cm2 de carbofurano a las 48 h), (b) hinchazón segmentaria (M. posthuma, 0,24 μg/
cm2 de carbarilo a las 48 h), (c) constricción severa en el poste región clitelar (E. fetida, 1,20 μg/cm2 carbarilo a las 48 h), (d) adelgazamiento (E. fetida, 0,18 μg/cm2 carbofurano a las 48 h), (e) llagas
sangrantes en la región posclitelar (M. posthuma, 0,24 μg/cm2 de fenvalerato a las 48 h), (f) constricción severa en la región postclitelar (E. fetida, 1.200 μg/cm2 de carbarilo a las 48 h) y (g) degeneración
postclitelar (M. posthuma, 0,24 μg/cm2 de cipermetrina a las 48h).
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como sigue: carbofurano4cipermetrina4carbaril4fenvalerato en M. posthuma y
carbofurano4carbaril4fenvalerato4cipermetrina en E. fetida.
3.2. Toxicidad del suelo
Los resultados de la toxicidad aguda de varios insecticidas con pruebas de suelo
artificial para E. fetida y M. posthuma se resumen en la Tabla 2. Los datos mostraron
una relación dependiente de la concentración y el tiempo de exposición con todos
los insecticidas probados. Cada uno de los insecticidas probados mostró diferentes
grados de toxicidad para M. posthuma y E. fetida. Las anomalías morfológicas como
hinchazones segmentarias, constricciones, llagas sangrantes y degeneraciones
posclitelares fueron generalmente visibles después de 6 a 24 h de tratamiento con
estos químicos en concentraciones mucho más altas que el método de contacto. A
los 7 días, el carbofurano mostró la mayor toxicidad para M. posthuma, seguido de
la cipermetrina, el carbarilo y el fenvalerato. El orden de toxicidad en orden
descendente fue el siguiente: carbofurano4cipermetrina4carbaril4fenvalerato en M.
posthuma y carbofurano4carbaril4fenvalerato4cipermetrina en E. fetida. Al día 14,
el carbofurano todavía presentaba la mayor toxicidad para M. posthuma y E. fetida
y el orden de toxicidad fue similar al del día 7. En la clase de insecticidas piretroides,
a los 14 días la cipermetrina fue 1,9 veces más tóxica que el fenvalerato en M.
posthuma, mientras que en E. fetida fue 13,5 veces menos tóxica que el fenvalerato.
Pero en los carbamatos, a los 14 días el carbofurano era 17,5 veces más tóxico que
el carbarilo en M. posthuma, mientras que en E. fetida era 1,3 veces más tóxico que
el carbarilo.
Los valores de CL50 obtenidos para diferentes insecticidas reflejan claramente una
mejor sensibilidad de M. posthuma sobre E. fetida. Los valores de toxicidad aguda
(CL50) de estos insecticidas en pruebas de suelo fueron superiores a los valores
obtenidos por el método de contacto con papel.
3.3. Estudios histopatológicos
El examen histopatológico de las secciones transversales del gusano de control
mostró una arquitectura normal de la pared corporal que muestra una membrana
cuticular continua y la naturaleza intacta de los músculos circulares y longitudinales
(Fig. 2). Las lombrices de tierra, E. fetida expuestas a 1,20 μg/cm2 de carbofurano
tratadas con los insecticidas, revelaron pérdida de su arquitectura normal y
desintegración de la membrana cuticular, las células epidérmicas y los músculos
circulares y longitudinales a las 48 h de exposición en el método de contacto, lo que
puede provocar Sangrado y fragmentación del cuerpo. También se observaron
daños similares en la membrana cuticular y desintegración de los músculos
circulares y longitudinales en la lombriz de tierra M. posthuma expuesta a 0,5 mg/kg
de carbofurano en el medio del suelo. También se observó un patrón similar de
cambios histopatológicos con otros insecticidas.
3.4. Cálculos de orbitales moleculares y mediciones espectrales FTIR.
Las cargas atómicas parciales de los átomos de carbarilo y carbofurano (Fig.
3) se presentan en la Tabla 3. Estas cargas electrónicas desempeñan un papel
importante en la actividad biológica de los insecticidas de carbamato.
La carga electrónica total de las cuñas activas de estos insecticidas se ha calculado
sumando las cargas individuales de sus átomos. Las frecuencias FTIR de carbarilo
en el rango de 450 a 4000 cm1 son
Cuadro
2 Resumen de los resultados de la prueba de toxicidad aguda con suelo artificial para Eisenia fetida y Metaphire posthuma.
Insecticidas M. posthuma E. fetida
7 días LC50(IC 95%) mg kg1 7 días CL50 ( IC 95%) mg kg1
cipermetrina 10,56 (8,23–13,55) 573,94 (472,92–696,55)
Fenvalerato 22,13 (19,56–25,03) 43,49 (33,72–56,08)
carbofurano 0,63 (0,42–0,96) 24,31 (17,03–34,71)
carbarilo 11,02 (8,64–14,06) 30,34 (24,42–37,69)
221
como se muestra en la Fig. 4. El rango de 500 a 1800 cm1 es una región rica en
espectro donde el carbarilo exhibe varias bandas infrarrojas nítidas e intensas.
4. Discusión
El presente estudio se llevó a cabo para comparar la sensibilidad de dos especies
de lombrices expuestas a cuatro insecticidas diferentes mediante dos métodos
diferentes. También se informaron estudios similares sobre la sensibilidad
comparativa de E. fetida y Perionyx excavatus a diferentes sustancias químicas (De
Silva y Van Gestel, 2009). Varias directrices han recomendado E. fetida como
especie de prueba para la detección de agroquímicos (OCDE, 1984; CEE, 1985;
Environment Canada, 2004; ISO, 2007). Sin embargo, su relevancia ecológica ha
sido limitada debido a su rara presencia en ecosistemas naturales y su
comportamiento resistente (Edwards y Coulson, 1992; Reinecke y Reinecke, 2004;
Pelosi et al., 2013). Se ha demostrado que varias especies de lombrices de tierra
con mayor relevancia ecológica, como Lumbricus terrestris (Mosley et al., 2003b),
Appor­rectodea calignosa (Hodge et al., 2000) y Lumbricus rubellus (Lukkari y
Haimi, 2005) son adecuadas para su uso. en la prueba de toxicidad del suelo. Entre
los productos químicos probados, el carbofurano fue altamente tóxico para ambos
organismos de prueba. La toxicidad relativa de los insecticidas puede ordenarse
como: carbofurano4cipermetrina4carbaril4fenvalerato en M. posthuma y
carbofurano4car­baril4fenvalerato4cipermetrina en E. fetida mediante ambos
métodos de prueba. Sin embargo, la toxicidad de estos químicos fue más
pronunciada en M. posthuma que en E. fetida en ambos procedimientos de prueba.
También se ha publicado en la literatura un estudio similar sobre la clasificación de
la toxicidad de otros insecticidas basado en valores de CL50 en P. excavatus (De
Silva et al. 2010).
La comparación de los resultados de la prueba de contacto con papel con los
obtenidos en suelos demuestra claramente que la prueba de contacto no tiene
valores predictivos para la toxicidad de un insecticida en suelos, aunque es
importante para la detección inicial de los químicos ambientales. Las diferencias
entre los valores LC50 más bajos y más altos de los insecticidas para M. posthuma
y E. fetida en el método de contacto con papel fueron sólo 6,9 y 2,5 veces
respectivamente, mientras que en el suelo fueron más de 38 y 26 veces. Estos
datos demostraron que las lombrices podían tolerar concentraciones más altas en
el suelo que en el papel de filtro húmedo.
Esta diferencia en el comportamiento del insecticida probablemente se deba a la
tasa de difusión/absorción del insecticida desde el medio hacia el cuerpo de la
lombriz. Está bien informado en la literatura que los insecticidas se absorben en el
medio del suelo mediante una fuerte unión por el contenido de materia orgánica del
suelo (Davis, 1971; Van Gestel y Van Dis, 1988). Por lo tanto, la disponibilidad de
insecticida para difusión en el suelo será menor que en el papel de filtro impregnado.
La prueba de papel de filtro de contacto se puede utilizar como técnica de detección
inicial para evaluar la toxicidad relativa de los productos químicos; sin embargo, no
representa la situación del ecosistema del suelo. Las pruebas de suelo artificial son
más representativas del entorno natural de las lombrices de tierra y los datos de
toxicidad aguda de varios insecticidas se pueden utilizar en la evaluación de riesgos
ecológicos en el ecosistema del suelo.
Los insecticidas carbamatos se utilizan para controlar los insectos que se
alimentan de las hojas y que habitan en el suelo. Son potentes inhibidores de la
acetilcolinesterasa del tejido nervioso de los insectos (Gupta y Sunderaraman,
1988). Los temblores observados en los gusanos tratados reflejan el efecto neurotóxico del
M. posthuma E. fetida
CL50 14 días (IC 95%) mg kg1 14 días LC50(IC 95%) mg kg1
9,83 (7,77–12,96) 551,14 (450,37–674,45)
18,66 (14,14–24,62) 40,77 (31,81–52,26)
0,49 (0,33–0,74) 21,15 (18,49–24,19)
8,57 (6,92–10,63) 26,86 (20,45–35,28)
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222 PN Saxena et al. / Ecotoxicología y seguridad ambiental 100 (2014) 218–225

Fig. 2. Cambios histológicos en M. posthuma y E. fetida. (a) Pared corporal de control de E.fetida que muestra la naturaleza intacta de los músculos y la capa epidérmica, (b) E. fetida expuesta a
carbofran (1,20 μg/cm2 , 48 h) por método de contacto, (c) M. posthuma expuesta a carbofurano (0,24 μg/cm2 , 48 h) por método de contacto, (d) E. fetida expuesta a fenvalerato (1,20 μg/cm2 , 48
h) por método de contacto, (e) E. fetida expuesta a cipermetrina (1,20 μg/cm2 , 48 h) por método de contacto, (f) E. fetida expuesta a carbofurano (10,5 mg/kg, 14 días) por bioensayo de toxicidad del
suelo, (g) M. posthuma expuesta a cipermetrina (8 mg/kg, 14 días) por suelo bioensayo de toxicidad y (h) E.fetida expuesta a fenvalerato (25 mg/kg, 14) mediante bioensayo de toxicidad en el suelo.

insecticidas. Los resultados de este estudio muestran que el carbofurano y el Saxena, 2003). Las concentraciones letales observadas se pueden correlacionar
carbarilo son altamente tóxicos para ambas especies de lombrices incluso con las concentraciones de campo suponiendo que la dosis aplicada se
después de 72 h (método de contacto con papel de filtro) y 14 días (método del distribuye homogéneamente sobre los 2,5 cm de la capa superior del suelo,
suelo). Nuestros estudios anteriores también mostraron que la exposición de por ejemplo, 0,49 mg/kg (valor CL50 de carbofurano en M. posthuma) equivale
30 días al carbarilo afectó significativamente la reproducción en M. posthuma (Gupta ay 0,17 kg/ha ( Van Gestel, 1992). Esto es mucho más bajo que el real.
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PN Saxena et al. / Ecotoxicología y seguridad ambiental 100 (2014) 218–225 223

h 3C9 C11H3

C10

O8 C12H2
7 7
8 13

6 6 14
O5 9 O5
O4 O4
C3 15 10 C3 dieciséis
15

14 11
N1 N1
13 12
H3C2 H3C2 h
h

Cuña 1 Cuña 2 Cuña 1 Cuña 2

carbarilo carbofurano

norte

norte

CL oh C
C CO
C oh
CL CH CH oh
CL
CH CO
CH oh

CH

CH3 CH3 CH3 CH3

Resto ácido Resto ácido

cipermetrina Fenvalerato

Fig. 3. Estructura molecular de los insecticidas utilizados en el estudio.

Tabla 3
Cargas atómicas parciales en varios átomos de carbarilo y carbofurano.

carbarilo carbofurano

Átomo Cargar Átomo Cargar

N1 0,3559 N1 0,4495
H1 0,1947 H1 0.2687
C2 0,0780 C2 0,1875
H2A 0,0651 H2A 0,1223
H2B 0,0762 H2B 0.1095
H2C 0,0862 H2C 0.1148
C3 0.4105 C3 0.4567
O4 0,2919 O4 0.3203
O5 0,2576 O5 0,2725
C6 0,1214 C6 0.1184
C7 0,0733 C7 0.1178
H7 0,0739 O8 0.2478
Fig. 4. Espectro FTIR de carbarilo (4000–450 cm1 ).
C8 0,0579 C10 0,1952
H8 0,0666 C11 0.3148
Eficiencia, vida media relativamente más corta en el suelo y menor mamífero.
C9 0,0617 H11A 0.1069
H9 0,0646 H12B 0,1020 toxicidad. Los piretroides alteran la función normal de los nervios de los insectos
C10 0,0046 H12C 0.1092 modificando la cinética de los canales de sodio sensibles al voltaje
C11 0,0577 C12 0.1011 (Soderlund et al., 2002). Se ha reportado en la literatura que
H11 0,0620 H12A 0.0979
La mayoría de los insecticidas piretroides no son tóxicos para las lombrices de tierra.
C12 0,0634 H12B 0.0979
H12 0,0663 C13 0.0019
prueba de suelo artificial. Nuestros hallazgos muestran que la cipermetrina y
C13 0,0606 C14 0.1011 El fenvalerato es más tóxico para M. posthuma que para E. fetida. La cipermetrina
H13 0.0642 H14 0.0885 fue la menos tóxica para E. fetida. Esto también indica además la
C14 0,0596 C15 0.0963 uso racional de estos compuestos en la agricultura para evitar daños a
H14 0,0650
El ecosistema del suelo.
C15 0.0039
Evaluación histopatológica de la sección transversal del gusano.
expuestos a estos insecticidas mostraron que la arquitectura normal
Concentración aplicada en campo (0,5 a 4 kg/ha). Entonces, un extremo de la pared corporal se vio afectada en gran medida. Membrana cuticular, epidérmica.
Se debe tener cuidado con el uso de estos compuestos en la agricultura. Las capas, los músculos circulares y longitudinales se desintegraron completamente,
para evitar daños graves a las lombrices. lo que provocó sangrado, constricción y fragmentación de la
Los insecticidas piretroides sintéticos se utilizan ampliamente en todo el mundo cuerpo. Anteriormente se informaron cambios histológicos similares en carbarilo.
para programas de control de plagas agrícolas debido a su mayor y lombrices de tierra tratadas con metal (Gupta y Sundararaman, 1988,
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224 PN Saxena et al. / Ecotoxicología y seguridad ambiental 100 (2014) 218–225
1990; Lourenço et al., 2011). Estas observaciones histopatológicas desempeñan un papel
importante en la comprensión del modo de acción de estos compuestos a nivel celular y
molecular.
Los estudios sobre las relaciones estructura­actividad de los piretroides demuestran que
la toxicidad tanto de los insecticidas como de los mamíferos depende en gran medida de la
forma molecular, el tamaño y las estructuras esteroquímicas de la fracción ácida de la molécula
(Soderlund et al., 2002).
Feaster et al., 1996 también demostraron la actividad dependiente de la estructura en los
carbamatos. En el presente estudio, hemos propuesto un posible mecanismo de actividad
biológica de los insecticidas carbamatos basado en el exceso de carga electrónica en el sitio
activo, la orientación y los datos espectroscópicos.
Aún no se comprende del todo el mecanismo molecular responsable de la toxicidad de
estos insecticidas en las lombrices de tierra. Sin embargo, los estudios histopatológicos y
bioquímicos sobre insecticidas carbamatos y piretroides indican que estos insecticidas
interactúan principalmente con las proteínas y lípidos de la pared corporal de las lombrices de
tierra (Gupta y Sundararaman, 1988; Mosley et al., 2003a; Tripathi y Bhardwaj, 2005). Como
el carbarilo y el carbofurano pertenecen al grupo de insecticidas carbamato, se ha considerado
que el resto carbamato es un probable sitio activo. Para demostrar la actividad biológica de los
carbamatos, la molécula de carbarilo se ha dividido en dos partes, cuña 1 y cuña 2 (Fig. 3).
La cuña 1 que tiene un exceso de carga de 0,1507 es la posible cuña activa.
La cuña 1 contiene átomos de N,O altamente electronegativos y un grupo metilo activo. La
cuña 2 ofrece una parte relativamente plana y desempeña un papel de soporte de anclaje para
tales interacciones. Las vibraciones moleculares de los átomos activos de la cuña polarizarían
las moléculas de proteínas y lípidos de la pared del cuerpo de la lombriz y se unirían allí. En
principio, esta polarización se produce debido al cambio en la polarizabilidad eléctrica durante
la vibración de los grupos que interactúan, provocando así perturbaciones. Dichas perturbaciones/
toxicidad se pueden monitorear a través de los modos de vibración N–H, CH3, CQO y C–O
que aparecen en 3315, 2942, 1713, 1418, 1388, 1363, 1011 669, 552 cm1 en el espectro FTIR
de carbarilo ( Fig . .4 ). Las asignaciones de las frecuencias observadas se realizaron sobre la
base de la forma de la banda, la intensidad máxima relativa y una comparación con moléculas
similares (Bellamy, 1975; Saxena y Gupta, 2005; Alverdi et al., 2004). La unión del carbarilo
con proteínas/lípidos puede provocar la desestabilización de las estructuras de estas
biomoléculas, provocando toxicidad para las lombrices de tierra. Lo mismo ocurre con el
carbofurano con un exceso de carga electrónica de 0,1578 en la cuña activa 1. Sin embargo,
la carga en la cuña activa del carbofurano es mayor que la del carbarilo, lo que probablemente
sea responsable de una mayor toxicidad del carbofurano en ambas especies de lombrices. El
mecanismo propuesto anteriormente también fue respaldado por los estudios realizados por
Lewis et al., 1998, quienes analizaron la actividad biológica de varios compuestos a partir de
su estructura molecular y electrónica utilizando un procedimiento orbital molecular similar.
Se puede proponer un mecanismo similar para los insecticidas fenvalerato y cipermetrina
(Fig. 3). En estos insecticidas, la fracción ácida puede considerarse como un sitio activo debido
a la gran polarización asociada con los átomos de Cl/Br, O y N. Estos átomos son capaces de
polarizar las moléculas de proteínas/lípidos de la pared del cuerpo de las lombrices y pueden
unirse allí, causando toxicidad.
5. Conclusión
El presente estudio sugiere que la sensibilidad de M. posthuma para la evaluación de la
toxicidad de sustancias químicas ambientales es compatible con otras especies de lombrices
de tierra. Las concentraciones de prueba, que fueron menos efectivas en E. fetida, produjeron
efectos toxicológicos más pronunciados en M. posthuma, lo que respalda una mayor
sensibilidad de M. posthuma sobre E. fetida. Una gran diferencia en los valores de CL50 en
E.fetida y M. posthuma respalda nuevamente la mejor sensibilidad de M. posthuma sobre E.
fetida. De todos los insecticidas probados, el carbofurano fue el más peligroso para los dos
organismos de prueba y afectaría a las poblaciones de lombrices de tierra. Vibraciones
moleculares que involucran
Los átomos de cuña activos con exceso de carga electrónica son responsables del
reconocimiento (mediante polarización) y la unión de los carbamatos a las moléculas de
proteínas/lípidos de la pared corporal de las lombrices, lo que provoca toxicidad.
El mecanismo propuesto se puede aplicar para predecir el potencial de toxicidad de otros
carbamatos.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen al Director del ITRC, Lucknow, India, por su gran interés y apoyo
constante en el presente estudio.
También se agradeció la asistencia de laboratorio del Sr. Sita Ram. II
Comunicación TR N° 2635.
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