UNIVERSIDAD DE PANAMA VICERRECTORIA DE INVESTIGACIN Y POSTGRADO PROGRAMA CENTROAMERICANO DE MAESTRIA EN ENTOMOLOGA

"Caracterizacin Molecular de 6 cepas del gusano barrenador del ganado Cochliomyia hominivorax (Coquerel) y de la especie Cochlomyia macellaria (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae)".

CLAUDIA E. TOLEDO PERDOMO

TESIS SOMETIDA COMO REQUISITO PARA OPTAR AL GRADO DE MAESTRA EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN ENTOMOLOGA AGRCOLA

Asesor principal Dr. Steven Skoda, Ph.D.

Panam, Repblica de Panam 2007

UNIVERSIDAD DE PANAM VICERRECTORIA DE INVESTIGACIN Y POSTGRADO PROGRAMA CENTROAMERICANO DE MAESTRIA EN ENTOMOLOGA

"Caracterizacin Molecular de 6 cepas del gusano barrenador del ganado

Cochliomyia hominivorax (Coquerel) y la especie Cochliomyfa mace//aria (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae)".

CLAUDIA E. TOLEDO PERDOMO

2007

APROBADO

AGRADECIMIENTO

Deseo expresar mi eterno agradecimiento a Dios y la Virgen Mara, por sus mltiples bendiciones que he recibido y a mis padres Julio y Bety por el apoyo que me han brindado. Al comit de asesores Doctor Steven Skoda, Doctora Oris Sanjur, Magister Ivan Luna y Magister Percis Garcs. .. De una manera muy especial, quiero dar mi profundo agradecimiento a la Doctora Oris Sanjur, del Instituto Smithsonian, por todo su apoyo incondicional y tiempo dedicado a esta investigacin, adems quiero resaltar mi agradecimiento por su calidad humana y su valiosa amistad. Agradezco al Doctor Steven Skoda, de ARS USDA, quien deposit su confianza en mi y me brind la oportunidad de realizar esta investigacin, adems de su gran apoyo. A los profesores Doctora Yolanda guila, Magister Ivn Luna y Magister Percis Garcs por todo su apoyo durante todo el tiempo de mi desempeo en la maestra. Al Servicio Alemn de Intercambio Acadmico -DAAD- por la beca otorgada para poder realizar mis estudios de maestra, especialmente a Magister Neddy Zamora. Al Doctor Eldrege Bermingham por darme la oportunidad de realizar mi investigacin en el laboratorio de Biotecnologa del Instituto Smithsonian. A la Doctora Laura Geyer, Grethel Grajales, Maribel Gonzles, Carlos Vergara, Mabelle Chong, Eyda Gmez y Javier Jara del laboratorio de Biotecnologa del Instituto Smithsonian. As tambin a Jorge Castillo, Gladys Quinteros y Mario Vsquez del laboratorio de Investigacin del gusano barrenador del ganado ARS-USDA; y finalmente a Ricardo Rovira y Rolando Torres del Instituto Conmemorativo Gorgas. A Todos ellos por su amistad y apoyo.

r` ^1

ndice General ndice de Figuras ndice de Cuadros Resumen Summary Introduccin Revisin de literatura 1. Descripcin taxonmica y biolgica del gusano barrenador del ganado -GBG C. hominivorax Aspectos ecolgicos en el comportamiento del GBG C. hominivorax 2. 3. Distribucin geogrfica del GBG C. hominivorax 4. Descripcin taxonmica y biolgica de Cochliomyia macellaria 5. Principales caractersticas utilizadas para diferenciar C. hominivorax de C. macellaria 6. Miasis 6.1. Signos clnicos 7. Miasis en humanos 8. Importancia econmica 9. Mtodos de control y erradicacin 9.1. Sacrificio y tratamientos qumicos 9.2. Produccin masiva en laboratorio 9.3. Tcnica del insecto estril - TIS 9.4. Programa de erradicacin del gusano barrenador del ganado 10. Anlisis moleculares 10.I El ADN mitocondrial de los insectos 10.2 El ADN mitocondrial de Cochliomyia hominivorax 10.3 Tcnicas moleculares utilizadas 15. Estudios genticos realizados de C. hominivorax y C. macellaria 15.1. Estudios para C. hominivorax 15.2. Estudios para C. macellaria 16. Caractersticas ecolgicas de los lugares de origen de las cepas de C. hominivorax 16.1 Oaxaca, Mxico 16.2 Quintana Roo, Mxico 16.3 Chiapas, Mxico 16.4 Oeste de San Jos, Costa Rica 16.5 Norte de la Ciudad de Panam, Panam 17. Descripcin de la crianza de las cepas 18. Caractersticas de rea de colecta de C. macellaria Materiales y mtodos 1. Material biolgico 2. Colecta de C. macellaria 3. Extraccin del mtADN 4. Amplificacin de PCR 5. Evaluaciones para cada Cebador

ji 1 2 3 9 10 12 13 14 16 17 19 20 21 22 22 22 23 25 26 26 27 28 31
31

33 34 34 34 35 36 36 37 38 39 40 42 43 44 45

5.1 Cebador 3 5.2 Cebador 4 5.3 Cebador 7 5.4 Cebador 8 5.5 Cebador 9 5.6 Cebador 10 6. PCR para cada Cebador 7. Visualizacin de PCR 8. Preparacin para cortar bandas Secuenciacin en ciclo (cycle sequencing) 9. 10. Columnas de Sephadex 11. Optimizacin de protocolos de PCR para Cochliomyia macellaria 11.1. Cebador 7 11.2 Cebador 8 11.3 Cebador 9 Regiones amplificadas 11. 12. Anlisis filogenticos Resultados 1. Optimizacin de los cebadores para C. hominivorax Optimizacin de los cebadores para C. macellaria 2. 3. Tamao de las regiones amplificadas 4. Relaciones filogenticos de las cepas 4.1. Cebador 7 4.2. Cebador 8 4.3. Cebador 9 4.4. Consenso Discusin 1. Regiones amplificadas 2. Caracterizacin molecular de las cepas de C. hominivorax y C. macellaria 3. Relacin molecular entre las 6 cepas de Cochliomyia hominivarax Conclusiones Recomendaciones Literatura citada Anexo Anexo 1 Anexo 2

45 47 48 49 49 50 51 51 52 52 53 53 53 53 54 55 55 57 58 58 58 58 58 60 60 60 66 67 67 69 76 78 80 88 89 91

ndice de Figuras Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Representacin circular de mtDNA de C. hominivorax Jaulas de reproduccin de las moscas y bandejas con pupas, laboratorio de ARS-USDA, Pacora, Panam. Localizacin geogrfica del origen de las cepas evaluadas rbol filogentico de las cepas C. hominivorax de la regin NADH5, mtADN rbol filogentico de las cepas C. hominivorax de la regin NADH4/NADH5, mtADN rbol filogentico de las cepas C. hominivorax de la regin NADH4 mtADN rbol filogentico de las cepas C. hominivorax del consenso, regin NADH4 -NADH5, mtADN 28 38 41 62 63 64 65

II

ndice de Cuadros Cuadro 1. Cuadro 2. Cuadro 3. Cuadro. 4. Cuadro 5. Principales caractersticas para diferenciar C. hominivorax y C. macellaria. Latitud, longitud y ao de colecta de las cepas de C. hominivorax y la especie C. macellaria. Principales caractersticas de las cepas de C. hominivorax. Principales caractersticas para diferenciar a los adultos de C. hominivorax de C. macellaria en el campo Cebadores utilizados en la investigacin. 16 40 40 42 45

RESUMEN El gusano barrenador del ganado, Cochliomyia hominivorax (Coquerel) es una plaga de importancia econmica para animales de sangre caliente, principalmente el ganado vacuno. El programa Agriculture Research Service (ARS) de USDA tiene identificados a 6 cepas procedentes de Mxico, Panam y Costa Rica, las cuales fueron caracterizadas molecularmente. Para ello se optimizaron 3 cebadores de 6 que fueron evaluados. Por medio del mtodo de secuenciacin cclica se obtuvieron las regiones del genoma mitocondrial NADH4 His tRNA NADH5. Para establecer las relaciones filogenticas se realizaron los anlisis de Parsimonia, NJ, Mxima Verosimilitud y Bayesiano, mostrando la misma topologa de la formacin de 4 clados definidos. El primero formado por las cepas de Oaxaca y Quintan Roo, el segundo por las cepas procedentes de Chiapas, el tercero por las cepas de Costa Rica y Panam y el cuarto por una poblacin de Brasil, la cual fue obtenida de GenBank. En la investigacin tambin se incluy a la especie Cochliomyia macellaria (Fabricius), donde se evaluaron los tres cebadores que se optimizaron para C. hominivorax, de los cuales se lograron optimizar dos, amplificando la regin de NADH4 y una pequea regin de NADH5. Con esta regin amplificada es posible la diferenciacin molecular con C. hominivorax.

SUMMARY The screwworm, Cochliomyia hominivorax (Coquerel) is an important pest which parasitizes livestock and other warm-blooded animals. The Agriculture Research Service (ARS) of the USDA identified 6 Zines from Mexico, Panama and Costa Rica, which nave been characterized molecularly. Six primers were evaluated and three were optimized and successfully amplified. Using cycle sequencing we obtained sequences from the regions NADH4 His tRNA -- NADH5. We used Parsimony, NJ, Maximum Likelihood and Bayesian methods to analyze the phylogeny of the six lines and another population from Brazil. These analyses resulted in singular topologies with four clades: the first consisting of the fines from Oaxaca and Quintana Roo, the second clade consisting of the lines from Chiapas, the third clade with the lines from Costa Rica and Panama and fourth clade formed by ene population from Brazil, which we obtained from GeneBank. We also included Cochliomyia macellaria (Fabricius). We evaluated three primers and successfully amplified and optimized two. We obtained sequences from NADH4 and part of NADH5. It is possible to differentiate between C. hominivorax and C. macellaria using this region.

INTRODUCCIN

INTRODUCCIN

El gusano barrenador del ganado (GBG), Cochliomyia hominivorax (Coquerel), es una plaga de importancia econmica para animales de sangre caliente, principalmente el ganado vacuno y tambin afecta a los humanos. Desde 1965 los gobiernos de Estados Unidos y Mxico iniciaron acercamientos a fin de compartir acciones para contrarrestar los efectos del gusano barrenador. En 1966 el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos declara a la nacin libre del gusano barrenador del ganado, asumiendo la responsabilidad de mantener una barrera biolgica a lo largo de las dos mil millas que comprenden la frontera de Mxico y Estados Unidos con el objetivo de prevenir una nueva migracin del gusano barrenador que reinfestara el territorio norteamericano. En 1972 se concret la colaboracin conjunta para la erradicacin del gusano barrenador del ganado. Para esto fueron necesarios 19 aos para erradicarlo en Mxico, por lo que en 1991 este pas fue declarado oficialmente libre de esta plaga, siendo necesario la dispersin de 250 mil 631 millones de moscas estriles. Los avances en la campaa de erradicacin en Mxico definieron el establecimiento de una nueva barrera biolgica entre Mxico y Estados Unidos en 1999 (Elizalde, 2005).

Posteriormente, el Programa se ha extendido con el propsito de abarcar todo el Istmo Centroamericano, incluyendo Panam, hasta llegar al Tapn de Darin. Mediante esta nueva etapa del Programa de Erradicacin del Gusano Barrenador se iniciaron los programas de Guatemala en 1987, Belice en 1989, El Salvador y Honduras en 1991, Nicaragua 1992 y Costa Rica en 1995. El avance del Programa hizo posible la erradicacin del gusano en Belice y Guatemala (1994), El Salvador (1995), Honduras

(1996) y Nicaragua (1999), Costa Rica (2000) (Embajada de Estados Unidos, Costa Rica, 2005).

Las operaciones areas y de campo en Panam iniciaron en 1998 y el avance en el programa de erradicacin del gusano barrenador del ganado ha sido significativo. Para septiembre de este mismo ao se registraron ms de dos mil casos del gusano barrenador. Para eI ao 2004 ya las tres cuartas partes del territorio panameo se declararon tcnicamente libres de este insecto. En el 2005, un segundo caso de GBG ocurri en Metet-Darin, identificado el 9 de junio del 2005 (COPEG, 2005; Embajada de Estados Unidos en Panam, 2005). Finalmente, en julio de 2006 Panam fue declarado libre del gusano barrenador del ganado.

El costo del Programa para la Erradicacin del Gusano Barrenador en Centroamrica ha sido de aproximadamente 200 millones de dlares y en Costa Rica de 41 millones. La relacin de costo - beneficio de este programa en Costa Rica estuvo entre 4.8 y 12.8. Si el programa cost 41 millones de dlares, se obtuvieron entre 168 y 448 millones de dlares en beneficios. Despus de erradicado el gusano barrenador de Costa Rica, los beneficios directos a los productores costarricenses se estimaron en ms de 13 millones de dlares por ao. Los dos gobiernos compartieron los costos, de igual manera que se hizo con los otros pases centroamericanos 85 % de los costos los cubri el gobierno de los Estados Unidos de Amrica y 15 % cada uno de los pases centroamericanos (Embajada de Estados Unidos en Costa Rica, 2006).

En la actualidad el gusano barrenador del ganado se encuentra presente en algunos pases del Caribe como Cuba, Republica Dominicana, Hait, Jamaica, Trinidad y Tobago y en Amrica del sur, exceptuando Chile, afectando la sanidad pecuaria y pblica, adems de la economa de esas regiones, donde la poblacin ganadera es de 463,392 millones (bovinos, equinos, sumos, ovinos, caprinos). Con respecto a la poblacin humana, existen 330,570 millones de personas en riesgo de ser atacados por el gusano barrenador del ganado (FAO, 2005a). Asimismo, esta situacin contina poniendo en riesgo de nuevas infestaciones a los pases donde la plaga ya ha sido erradicada.

Una de las actividades importantes del programa de erradicacin del gusano barrenador del ganado es su correcta identificacin. En estudios realizados se han encontrados diferencias morfolgicas entre individuos de distintas poblaciones del gusano barrenador del ganado como la variacin del color de cuerpo y de los ojos, anormalidades de la venacin de las alas y otras diferencias morfolgicas. Estas variaciones podran influir en el vuelo, la visin, comportamiento, vigor, longevidad, etc., adems de poner en duda su correcta identificacin. As, segn Baumhover (1966) para confirmar la identificacin y separacin de la plaga en estudios ecolgicos o separar las especies de poblaciones nativas es necesario el desarrollo de marcadores genticos para adultos. El estudio de los genomas mitocondriales (mtADN) se ha venido incrementando, debido a que estos aportan informacin gentica que puede ser usada en investigaciones moleculares y de evolucin. Estudios realizados por Litjens et al. (2001) demostraron que en el gusano barrenador del ganado basando el anlisis especfico en las regiones mtDNA

facilitan el potencial de acercamiento para la identificacin taxonmica y relaciones entre poblaciones.

Actualmente el Servicio de Investigacin Agrcola ARS- del Ministerio de Agricultura de los Estados Unidos USDA- poseen 6 cepas del gusano barrenador del ganado, las cuales presentan algunas diferencias morfolgicas. Estas cepas son procedentes de Mxico, Costa Rica y Panam. Su caracterizacin molecular, por medio a de las secuencias del mtADN ayudar a demostrar si existe alguna relacin filogentica entre ellas.

Cochliomyia macellaria (Fabricius) es una especie muy comn en el neotrpico

de Amrica, con un rango de distribucin comprendido desde el sur de Canad hasta Argentina. Es considerada como una plaga secundaria de miasis en el ganado, alimentndose principalmente de tejidos muertos (Litjens et al. 2001). Su distribucin geogrfica se traslapa con la de C. hominivorax adems que morfolgicamente son muy similares. Adems del alto parecido morfolgico entre los adultos de ambas especies, tambin lo es en el estado inmaduro; es decir, en los distintos estadios larvales, que en determinado momento resulta muy dificil identificarlas. Esto representa un problema para el programa de erradicacin del Gusano Barrenador del Ganado, debido a que las liberaciones de moscas estriles, declarar una zona libre, una zona infestada o una zona re-infestada depender de la correcta identificacin de C. hominivorax. Una liberacin errnea en zonas donde ya no est la plaga representa un alto costo para el programa. Debido a lo anterior es importante caracterizar molecularmente a las especies

Cochliomyia hominivorax y Cochliornyia macellaria porque esto aportar informacin que posteriormente facilitar la separacin entre ambas especies en las muestras de las larvas colectadas en el campo y as permitir tomar decisiones para el manejo del programa de erradicacin del ganado como por ejemplo realizar liberaciones de C.
hominivorax solo

cuando realmente sean necesarias.

El presente trabajo tiene como objetivos: determinar la relacin molecular entre las 6 cepas evaluadas de Cochliomyia hominivarax. Para cumplir con este objetivo se realizaron los anlisis filogenticos de Neighbor Joining (NJ), Mxima Parsimonia, Mxima Verosimilitud (Maximum Likelihood, ML) y el Anlisis Bayesiano. Asimismo, caracterizar molecularmente cada una de las cepas de Cochliomyia hominivorax y Cochliomyia macellaria por el mtodo de secuenciacin cclica. Finalmente, optimizar el protocolo para PCR y el programa para el termociclador utilizado por Maliphan et al. (2006) para cada uno de los 6 cebadores utilizado en la investigacin.

Revisin de Literatura

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El gnero Cochliomyia posee cuatro especies: C. aldrichi, C. hominivorax, C. macellaria y C. mnima; de las cuales la que presenta mayor importancia econmica por su impacto sanitario en animales mamferos y los seres humanos es C. hominivorax, muy conocida comnmente como el gusano barrenador del ganado, GBG (Hall, 1973 y Cunninghain, 1993).

1. DESCRIPCIN TAXONOMICA Y BIOLOGICA DEL GUSANO BARRENADOR DEL GANADO GB G- C. hominivorax Phylum:
Clase:

Arthropoda
Insecta

Orden : Suborden: Superfamilia: Familia: Gnero: Especie:

Diptera Cyclorrhapha Muscoidea Calliphoridae Cochliomyia Cochliomyia hominivorax (Coquerel).

Cochliomyia hominivorax es un parsito obligado de los mamferos, siendo especie endmica en las regiones del trpico y sub-trpico del continente americano (Norte, centro, sur Amrica e islas del caribe). La temperatura templada es la que presenta las condiciones ptimas para su desarrollo; sin embargo las sequas prolongadas, temperaturas altas o muy bajas son condiciones sub-ptimas. La actividad de los adultos de C. hominivorax decrece cuando la temperatura est por debajo de los 21C y no pueden sobrevivir cuando la temperatura es menor de los 9C por un perodo de 3 meses

4 das de vida las hembras copulan y comienzan a alimentarse. Dos das despus

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consecutivos o 12C por 5 meses consecutivos durante el ao (Erziclioglu, 1987 y Jasiorowski, 1993). Los adultos poseen un alto poder de vuelo y dispersin, los cuales se han reportado en moscas que han alcanzado una dispersin hasta de 290 Km en dos semanas (Jasiorowski, 1993).

Segn Baumhover (1966) y Drugueri (2004), el ciclo de vida de C. hominovorax dura en total aproximadamente de 3 semanas a 2 meses, dependiendo de la temperatura y de la humedad. Se ha demostrado que el ciclo es ms corto en verano. Las hembras ovipositan en los bordes de las heridas, ombligos de los neonatos, mordeduras, mucosas lesionadas, orbita ocular, orejas, etc., las cuales son atradas por el olor de la sangre del animal. Estas pueden ovipositar en grupos de 200 a 500 en lneas que se superponen como tejas en el borde de una herida. Las masas de huevos tardan entre 12 y 21 horas para que eclosionen las larvas, pasando por tres estadios, dentro del tejido subcutneo del hospedero. Las larvas permanecen sobre el hospedero slo de 5 a 7 das, luego caen al suelo, donde se transforman en pupa y dependiendo de la temperatura, entre 1 a 8 semanas emergen los adultos (imagos). Los estudios han demostrado que las pupas pueden sobrevivir un mes a una temperatura de -5C, mostrando un 70% de eclosin. Estudios ms recientes indican que pueden permanecer de 45 a 50 das vivas a intervalos continuos a esta temperatura.

En cuanto a los adultos, menos del 1% de los mismos sobrevivieron una noche a temperatura de -6.7C (Cunningham, 1993; Krafsur y Lindquist, 1996). A la edad de 3 4 das de vida las hembras copulan y comienzan a alimentarse. Dos das despus

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empiezan a depositar los huevos. Con clima clido el ciclo total dura 21 das (Baumhover, 1966; Drugueri, 2004).

Crystal (1967) y Adams (1979) reportan que la edad de apareamiento de las hembras es nicamente del tercero al quinto da. Las hembras incrementan gradualmente su receptividad para aparearse desde el 3 al 14 da, ovipositan aproximadamente 200 huevos, en donde la condicin nutricional de la hembra y los factores ambientales son influyentes en esta cantidad.

2.

ASPECTOS ECOLGICOS EN EL COMPORTAMIENTO DEL GBG, C. hominivorox Segn Thomas (1993), est especie es un parsito obligado, causante de una

miasis. Los adultos se localizan entre los arbustos de una zona boscosa en donde reposan y se alimentan. Los rboles que estn floreciendo son los preferidos, alimentndose del nctar y miel, los cuales son necesarios para que el adulto sobreviva. En general Thomas y Mangan (1989) demostraron la preferencia de la mayor cantidad de moscas en zonas boscosas que en los pastizales abiertos. Entre el tercer y cuarto da de edad las hembras llegan a ser sexualmente activas y el apareamiento ocurre generalmente cuando los machos se agregan en algn sitio seleccionado de acuerdo al camino utilizado normalmente por las hembras. Al quinto da de edad las hembras estn listas para la oviposicin. La fase de apareamiento es la que reporta la mayor mortalidad debido a que en este momento estn distradas y son presa fcil de hormigas y otros deperedadores y oportunistas.

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En cuanto a la dinmica poblacional de los adultos de C. hominivorax, Krafsur (1987) reporta que existe una relacin con veranos calientes y hmedos asociados a la abundancia de las poblaciones de C. hominivorax, indicando la preferencia de estos especimenes a dicho clima. As tambin, estudios realizados por Gomes et al. (1998), en Brasil, demostraron que en los meses donde se registraron medias de temperaturas mximas de 29.7C en enero y 29.3C en febrero, combinadas con precipitacin de 364.2mm y 185.0 mm, respectivamente, hubo disminucin de la poblacin de C. hominivorax. Sin embargo, para el mes de marzo, donde se registr una temperatura mxima de 30.1C y una precipitacin de 165.1 mm aument la poblacin, por lo que consideran que el nivel poblacional est asociado a la temperatura y la precipitacin, en donde a medida que aumenta la precipitacin disminuye la poblacin. As tambin, las influencias de la vegetacin y su relacin con el nivel poblacional de las moscas lo demostraron Gomes et al. (1998), al obtener mayor captura en los lugares que presentaban mayor cantidad de rboles, sugiriendo que estas moscas tienen preferencia hacia lugares con mayor cantidad de rboles o arbustos.

3. DISTRIBUCIN GEOGRFICA DEL GBG C. hominivorax

,' hominivorax, es nativa de las regiones tropicales y subtropicales del continente americano. Previo a la erradicacin, su distribucin original estaba comprendida entre la regin de los paralelos 30 norte y 30 sur, abarcando el centro y sureste de los Estados Unidos, Mxico, Centro Amrica, Panam, las islas del Caribe y Sur Amrica. En la actualidad el gusano barrenador del ganado se encuentra presente en forma endmica en Amrica del Sur, excepto en Chile. Tambin est presente en algunos paises del Caribe

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como Cuba, Republica Dominicana, Hait, Jamaica, Trinidad y Tobago, poniendo en riesgo una poblacin ganadera susceptible de ms de 515 millones de animales (FAO, 2005c).

4.

DESCRIPCIN TAXONOMICA Y BIOLOGICA DE Cochliomyia

macellaria

Phylum: Clase: Orden : Suborden: Superfamilia: Familia: Gnero: Especie:

Arthropoda Insecta Diptera Cyclorhapha Muscoidea Calliphoridae

Cochliomyia

Cochliomyia macellaria (Fabricius).

Cochliomyia macellaria (Fabricius) es una de las principales especies que causan

miasis cutnea secundaria. Su distribucin original se limita al continente americano desde Mxico hasta la Patagonia y en la regin rtica hasta el sur de Canad (Guimaraes,
1983).

Debido al hbito necrfago de las larvas, los adultos generalmente estn asociados con tejidos muertos junto con otras especies de las familias Caliphoridae, Sarcophagidae
y Muscidae. Econmicamente, esta especie es menos importante que C. horninivorax; sin

embargo, C. macellaria tambin es encontrada parasitando tejidos necrtico en mamferos vivos, contribuyendo con la gravedad de la lesin ya existente en el mamfero.

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Sin embargo, no se desarrolla en zonas profundas de los tejidos vivos como lo hace C. hominivorax (Cunninghaim, 1993).

La longevidad de los adultos es de dos a seis semanas, encontrndolos con frecuencia visitando carroa, animales muertos, depsitos de basura, frutos cados, peces expuestos en mercados, etc. (Guimaraes, et al. 1978; Byrd, 1995). Las hembras

ovipositan hasta 1,000 huevos en lotes de 40 a 250. En condiciones ptimas los huevos eclosionan dos horas despus de ser ovipositados y el perodo de desarrollo larval es de aproximadamente de 6 a 20 das. Posteriormente, las larvas caen al suelo, donde pupan y permanecen en este estado durante un perodo de 3 a 27 das. Finalmente, el perodo total de desarrollo de huevo a adulto es de 39 das (FAO, 1993).

La selectividad de la distribucin en el campo, cerca de carroa o animales muertos responde en mayora a las hembras con un 90%, debido a que estas buscan un substrato para la oviposicin. Un estudio realizado por Gomes et al. (2000) en Brasil, reporta la presencia de C. macellaria todos los meses del ao, coincidiendo el incremento de la poblacin con el aumento de la temperatura y el inicio de las lluvias. Los picos poblacionales se presentaron en los meses de septiembre, octubre y diciembre durante el periodo lluviosos y disminuyeron durante la poca seca, en los meses de junio y julio. As tambin, Butler (1996) realiz estudios de laboratorio con C. macellaria, indicando que la temperatura ptima para las larvas fue de 39C. En el desarrollo del huevo a adulto se evaluaron 3 temperaturas: 21C, 26C y 32.2C mostrando mayor preferencia por las altas temperaturas.

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5. PRINCIPALES CARACTERISTICAS UTILIZADAS PARA DIFERENCIAR C. hominivorax DE C. macellaria Cuadro 1. Principales caractersticas para diferenciar C. hominivorax y C. macellaria (Cunninhaim, 1993). C. hominivorax C. macellaria
Huevo Huevo Depositados en masas en forma de tejados La sutura dorsal extendindose desde el micrpilo hasta casi el extremo posterior, Larvas Primer Instar Larvas Segundo Instar Larvas Tercer Instar Esclerito dorsofarngeo pequeo Troncos traqueales dorsales con pigmentacin oscura. Troncos traqueales dorsales de los estigmas posteriores con una pigmentacin oscura desde la unin con los estigmas hacia delante hasta el segmento 9 10. Pupa Aproximadamente 10.2 mm de longitud y 4.3 mm de ancho Adultos Placas frontoorbitales con setas negras. Basicosta de la hembra de color pardo oscuro. Las hembras tienen en la parte posterior de la cabeza una franja anaranjada rojiza. En los machos esta mancha es pequea. En la parte ventral del abdomen, en el tercer y cuarto segmento, en los bordes laterales no tienen manchas blancas, solamente puntos blancos. La herida Las larvas producen una herida profunda, en forma de bolsa, alimentndose de manera gregaria de los tejidos vivos, situadas con la cabeza hacia abajo y sin moverse mucho en la superficie de la herida, Depositados en masas irregulares La sutura dorsal se extiende desde el micrpilo abarcando el 80% del huevo. Esclerito dorsofarngeo grande Troncos traqueales dorsales no tan pigmentados. Troncos traqueales dorsales pigmentados en la cuarta parte posterior del ltimo segmento, donde se unen con los estigmas posteriores. Aproximadamente 7.6 mm de longitud y 2.8 mm de ancho Placas frontoorbitales con setas de color claro. Basicosta de la hembra de color amarillo. En la parte posterior de la cabeza, los dos sexos tienen una mancha negra. En los bordes de la parte ventral del abdomen, en el tercer y cuarto segmento, presenta manchas blancas. En los casos de miasis, las larvas se alimentan de tejidos necrticos, alrededor de los bordes de la herida. En los animales de pelo largo por la lana o pelo que la rodea, no producen una herida en forma de bolsa.

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6.

MIASIS Esta palabra proviene del griego myias (myia = mosca; ase = enfermedad), que

significa enfermedad causada por moscas. Representando la infestacin de tejidos de animales vertebrados por larvas de mosca. La ecologa de la miasis es definida como el conjunto de interacciones biolgicas entre el husped y los parsitos, causando una infestacin sobre animales y humanos por las larvas de algunas moscas (Diptera) de las familias Calliphoridae, Sarcophagidae, Oestridae, Muscidae, Phoridae y Fannidae (Poudevigne, 1995; Enciclopedia Microsoft Encarta, 2004; Boros, et al. 2006). Dentro de las especies causantes de miasis se encuentran C. hominivorax, Chrysomya bezziana y Wohlfahrtia magnifica (Jasiorowski, 1993).

Dos especies de Cochliomyia se encuentran asociadas a miasis, C. hominivorax y C. macellaria. Sin embargo, en un principio, errneamente C. macellaria ha sido implicada como causante de miasis primaria durante muchos aos, confundindola con C. hominivorax. Las larvas de C. macellaria pueden ser muy abundantes en carroa. Cuando estas se encuentran en miasis, son solamente invasoras en tejidos secundarios, encontrndose en la superficie de la herida. Es vital para establecer un control una correcta identificacin del insecto causante del dao (Poudevigne, 1995; Boros, et al. 2006). En funcin del parasito que provoca la infeccin se distinguen tres tipos de miasis (FAO 2005b). a. Miasis Obligatoria: moscas cuyo desarrollo larvario tiene lugar ntegramente sobre los vertebrados vivos.

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b. Miasis Facultativa: mosca cuyas larvas se alimentan de carroa, pero, que ocasionalmente pueden parasitar animales vivos. c. Miasis Accidental: larvas de ciertas moscas que siendo habitualmente coprfagas o saprfagas pueden llevar a cabo la oviposicin sobre los alimentos, siendo capaces de resistir la accin de los jugos gstricos y alcanzar el intestino.

Desde el punto de vista clnico, segn Jasiorowski (1993) las miasis se pueden agrupar en:

a.

Miasis Cutnea: las larvas perforan la piel para alimentarse de la sangre del

hospedero (hematfagas). En otras especies de moscas las larvas atraviesan la piel sana provocando un fornculo o excavan galeras y tneles en la epidermis o tejidos ms profundos, provocando graves daos en el hospedero. En otros casos, los adultos son atrados por las heridas abiertas del futuro hospedero, depositando sobre estas los huevos. Generalmente, la herida se torna circular y muy profunda de aproximadamente 5 a 10 cm de profundidad o ms, resultando en un extenso tejido destruido por las larvas. Estas heridas tienen un caracterstico olor a putrefaccin. Las larvas de C. hominivorax se encuentras en las partes profundas de la herida, a diferencia de las especies de dao secundario que se encuentran cercanas a la superficie.

b.

Miasis de las cavidades corporales: moscas que ovipositan en las cavidades

nasofarngeas y oculares y en los conductos auditivos.

19

c.

Miasis intestinales y urogenitales: infestaciones accidentales de esas zonas al

ingerir larvas o al penetrar estas por el recto. Ciertos adultos son atrados por zonas infestadas o sucias, infestando las larvas el tracto urogenital.

Segn Poudevigne (1995), las caractersticas necesarias de la herida para que se desarrollen las larvas de C. hominivorax son: tener una tasa alta de humedad y un pH de 7.2 como una condicin mnima para la oviposicin y para el desarrollo de las larvas. El pH ptimo se ubica a 7.6 y se encuentra en miasis de tipo 3 o en herida con fuerte contaminacin por bacterias proteolticas.

Los efectos patolgicos que se producen de la infestacin del gusano barrenador del ganado pueden ser (Poudevigne, 1995): Efecto traumtico causado por las larvas al alimentarse del tejido del animal; Efecto de irritacin causado por el movimiento de las larvas dentro de la herida. Infeccin secundaria causada en la herida por otros organismos contaminantes como bacterias, virus, protozoos u hongos. Efectos txicos a travs de la excrecin de las larvas.

6.1.

Signos Clnicos Las infestaciones comienzan en cualquier lesin abierta incluyendo algunas tan

pequeas como las picaduras de garrapatas. Las hembras grvidas depositan sus huevos en los bordes de las heridas. Las primeras larvas se mueven inmediatamente hacia la herida y comienzan a alimentarse. En las primeras etapas es extremadamente dificil

K1]

detectar las larvas en la herida por su pequeo tamao. Estas se hacen visibles slo por ligeros movimientos en la superficie de la herida (FAO, 2005a).

Despus del tercer da de la infestacin

la herida se va haciendo

significativamente ms grande por las larvas. Estas se pueden notar fcilmente alimentndose en posicin vertical a la herida con sus espirculos expuestos en la superficie y generalmente puede ser diferenciada de otras larvas de moscas por su comportamiento en la herida. Las larvas se encuentran normalmente profundamente en los tejidos del husped y no en la superficie de la herida (FAO, 2005a).

En el quinto da la lesin es obvia, con grandes larvas de tercer estadio. La herida tiene olor ftido caracterstico del gusano barrenador del ganado y con un exudado oscuro. En esta etapa la herida est mayormente predispuesta para subsecuentes oviposiciones de otras hembras, contribuyendo as, a una mayor debilidad y la posible muerte del animal (FAO, 2005a).

7.

MIASIS EN HUMANOS Desde 1935 se han venido reportando casos de miasis en humanos. A pesar que

existe poca informacin y divulgacin de miasis en humanos es muy importante alertar a la poblacin humana que viven en reas donde se encuentra la plaga del gusano barrenador del ganado. Se ha demostrado que los casos en humanos han sido prevalentemente en las poblaciones de grupos socioeconmicos bajos. Se han

encontrado casos donde se inicia la miasis por heridas, en mucosas con produccin de secreciones y otros donde los seres humanos han ingerido accidentalmente larvas de

21

dpteros en los alimentos. Otras larvas se desarrollan dentro de ella y pasan al ser humano que las ingiere. Algunas de estas larvas, con cutcula muy resistente a los jugos digestivos, son capaces de pasar a travs del tracto digestivo y emerger vivas por el ano (FAO, 2005a).

Tambin se han presentado casos donde la miasis causa deformaciones anatmicas permanentes (FAO, 2005 b). En la actualidad en Medelln, Colombia, se han reportado 24 casos entre el ao 2001 al 2005 en un hospital de tercer nivel, presentndose los casos en las mucosas, odos y el cerebro (Valderrama, 2006).

La miasis en humanos ha sido clasificada clnicamente segn las cavidades infestadas en los humanos: estomatomiasis, nasomiasis, rinomiasis, otomiasis (Boros, et al. 2006).

8. IMPORTANCIA ECONMICA

El gusano barrenador del ganado (GBG), Cochliomyia hominivorax se le considera una zoonosis; es decir, una enfermedad de los animales que puede ser transmitida a los humanos. No obstante, los efectos de este problema en la produccin pecuaria resultan verdaderamente dramticos. Las prdidas econmicas que se originan con la infestacin del gusano barrenador implican anualmente cientos de millones de dlares. En los Estados Unidos previo a la erradicacin, las perdidas anuales eran de aproximadamente US$ 650 millones. El impacto de esta plaga en los animales es inmediato: presentan disminucin de peso, se deteriora la produccin lctea y crnica, muestran daos en pieles y presentan infecciones en las heridas por bacterias

22

oportunistas. En algunas ocasiones llevan al animal a la muerte a travs de la anorexia, perdida de peso, anemia y hemorragia, etc. Aunque existen tratamientos para revertir el problema, en la mayora de los casos la solucin implica el sacrificio e incineracin del animal; adems, de los costos constantes de la vigilancia y el tratamiento. En el ao 2002 las prdidas ocasionadas por las gusaneras del gusano barrenador del ganado en Brasil fueron de 150 millones de dlares (Crozariol, 2005).

9. METODOS DE CONTROL Y ERRADICACIN

9.1.

Sacrificio y Tratamientos Qumicos Inicialmente se aplic el control de la plaga mediante el empleo de tratamientos

qumicos como lo son los insecticidas para matar la larva de la mosca y como medida preventiva para evitar la reinfestacin. En casos extremos algunos productores optaron por el sacrificio de los animales (Jasiorowsky, 1993).

9.2.

Produccin Masiva en Laboratorio El gusano barrenador del ganado fue reproducido artificialmente por primera vez

utilizando una dieta artificial para las larvas, que bsicamente consista en una mezcla de leche, sangre, carne sin grasa y formalina. Para la colonia de adultos, se colocan en jaulas, se alimentan con agua, miel y huevo molido (Baumhover, et al. 1969). Estudios posteriores para la dieta de los adultos, han utilizando miel, producto del huevo deshidratado y otra con miel y protena de carne (Chaudhury, 2000). Actualmente se producen masivamente en laboratorio con dieta artificial para larvas basada en leche,

23

sangre de ganado bovino, agua, huevo disecado y molido, fibra y formalina. La fbrica de produccin de la mosca estril del gusano barrenador del ganado estuvo ubicada desde 1976 en Tuxtla Gutirrez, Mxico, produce aproximadamente 500 millones de moscas por semana (Anderson y Leppla, 1992) y en el ao 2006 fue trasladada a Pacora, Panam.

9.3.

Tcnica del Insecto Estril - TIS La tcnica del insecto estril puede ser descrita de la forma ms simple como una

forma de control de la natalidad. En 1937, el doctor E. F. Knipling fue el primero en proponer la erradicacin del gusano barrenador del ganado a travs de la esterilizacin de los machos, para que luego de su liberacin en el campo estos se apareen con las hembras nativas. En 1951 Bushland y Hopkins esterilizaron moscas del gusano barrenador del ganado con 5 kv de rayos X o radiacin gamma (60 Co) administrado a pupas de 5 das de edad (Baurnhover, 1966). Las primeras experiencias de liberaciones de la mosca del gusano barrenador del ganado en campo se realizaron en el sureste de Estados Unidos de Amrica, y posteriormente en la isla de CuraQao. Los estudios han demostrado que la dosis de esterilizacin de rayos X y rayos gamma administradas al gusano barrenador del ganado puede afectar seriamente la longevidad de los machos o su competitividad bajo condiciones de laboratorio (Baumhover, 1966).

Segn Knipling (1983), biolgicamente el gusano barrenador del ganado presenta las siguientes caractersticas a considerar en la aplicacin de la tcnica del insecto estril como herramienta del control autocida:

24

a.

Es principalmente un insecto tropical y los estudios han demostrado una merma en su poblacin en los meses de invierno.

b. c.

Las hembras presentan un comportamiento mongamo para aparearse. Las larvas pueden infestar y madurar en un amplio rango de hospederos.

La tcnica del insecto estril requiere semanalmente una produccin de millones de insectos producidos en laboratorio, para posteriormente ser tratados con radiacin X o gamma para su esterilizacin, utilizando Cesium 137. Luego del tratamiento, los

insectos son dispersados en las reas destinadas para la erradicacin de la plaga en una proporcin de 10 moscas estriles por cada silvestre o su dispersin preventiva en reas erradicadas. Con esto se pretende que en el campo se produzca el apareamiento de los machos esterilizados en laboratorio con hembras silvestres, nativas de la regin. De esta forma se interrumpe el ciclo de vida y progresivamente se reduce la poblacin (Jasiorowski, 1993).

La tcnica goza de total selectividad; es decir, que los insectos estriles liberados copulan solo con los de su misma especie, no alterando el equilibrio biolgico del agroecosistema, dirigindose slo hacia la plaga que se desea controlar y no se desarrollan resistencias (Jasiorowski, 1993).

25

9.4.

Programa de Erradicacin del Gusano Barrenador del Ganado -GBG

En 1933 el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos determin que la mosca del gusano barrenador del ganado C. hominivorax era distinta a la especie C. macellaria, la cual en 1858 Coquerel, mdico francs, la descubri en lo senos frontales de un convicto que finalmente muri. Desde entonces se han registrado muchos casos en humano (Romero, 2003).

En 1936

se llev a cabo la produccin masiva bajo condiciones artificiales por

Melvin y Bushland. En la erradicacin fue decisivo tambin el uso de la tcnica de los insectos estriles propuesta por Knipling en
1937. La

tcnica del insecto estril ha sido

su primera y ms ambiciosa aplicacin en todo el mundo hasta el momento. En 1972 se estableci la Comisin Mxico- Americana para la erradicacin del gusano barrenador del ganado y ha continuando a partir de ese momento a extendindose por toda Centro Amrica. La erradicacin del gusano barrenador en los Estados Unidos de Amrica y en Mxico se ha conseguido con un costo superior a los 500 millones de dlares EE.UU (Bram, 1985; FAO,
1992;

Elizalde, 2005; Vargas- Tern, et al, 2005).

En

respuesta a la emergencia sanitaria acontecida por esta plaga, la Organizacin

de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO) design y realiz con xito un programa de erradicacin basado en la tcnica del insecto estril (TIE). Una de las primeras acciones de la FAO fue recomendar que la miasis ocasionada por el gusano barrenador del ganado se incluyera en la lista internacional de enfermedades de

26

los animales de notificacin obligatoria (Lista B). La recomendacin fue aprobada por la sesin general en la Organizacin Mundial de Sanidad Animal (OIE) en Pars, el 12 de mayo de 1989. Esto signific que la enfermedad se incluira en los sistemas de reporte internacional y los datos de ocurrencia se publicaran en el Libro Anual de Salud Animal de la FAOIWHO/OIE. Asimismo, que las recomendaciones especiales para la importacin y exportacin de animales se incluyeran en el Cdigo Zoosanitario Internacional de la OIE (FAO, 2005a).

10. ANALISIS MOLECULARES

10.1 El ADN Mitocondrial de los Insectos Los genes de los artrpodos estn formados por el DNA localizado en los cromosomas y consisten en protenas. RNA y DNA. El DNA es un polmetro de nucletidos. Cada nucletido consiste de un azcar pentosmico, una de las cuatro bases nitrogenadas (adenina, timina, guanina, citosina) y un grupo fosfato (Hoy, 2003).

El DNA en los insectos presenta una estructura compleja, por lo que las diferentes especies de los insectos tienen un nmero diferente de cromosomas haploides, constituidos en un rango de 1 a 221. El porcentaje de bases nitrogenadas es menor en los insectos que en los vertebrados. Por ejemplo, guanina + citosina ((3+C) presentan un 32% - 43% del ADN, comparado con los vertebrados que presentan el 45% (Hoy, 2003).

27

El ADN mitocondrial es el material gentico ubicado en las mitocondrias y generan energa para la clula. Este no se recombina, as que los nicos cambios que puedan presentarse se deben a mutaciones a lo largo de mltiples generaciones, es decir, durante el tiempo evolutivo. El rango del tamao del genoma mitocondrial se encuentra de 6 kb a ms de 2 Mb. En el ADN mitocondrial (mtADN) se da la fosforilacin oxidativa que da como resultado la formacin de trifosfato de adenosina (ATP), que es la molcula primaria de almacenamiento de energa qumica en la clula. El mtADN es un componente significativo de el total del ADN en las clulas de los insectos y es transmitido por la madre a la progenie (Hoy, 2003).

10.2 El ADN Mitocondrial de Cochliomyia hominivorax Los aspectos que favorecen el uso del mtADN como un marcador evolutivo son: el predominio de la lnea materna, la falta de una extensiva recombinacin y la rpida proporcin de sustitucin de nucletidos.

El genoma mitocondrial de C. hominivorax, segn Lessinger et al. (2000) es una molcula circular de 16022 pb. Al analizar el contenido del gen y la organizacin en general corresponde a una tpica Brachycera. En el genoma de C. hominivorax se encontr un gen que usualmente contiene 13 protenas codificables, 22 genes tRNA y 2 genes rRNA. La principal regin no codificable, identificada como la Regin Control del mtADN, est localizada entre el tRNA y rRNA y los genes 12S con un tamao de 1175 pb. Adems, la Regin Control posee un alto contenido de A+T (77%) al igual

28

que otras especies del orden Diptera (Ceralitis capitala, Drosophila yacuha, Drosophila

melanogaster, Anopheles gambie, Anopheles quadrimaculatus).

tRNR-Val

tRNR-Met tP.NR-1 le

tRNA-Cys

tO-Leu
C07S1

tRNA -Tyr

ND1 tRNH-Ser

15K
2.SK "

12.5K
-

CYTB
tRFIR -T

-Pro

6
ND4L

./ L@K

SK ,,

CpxptRNH-Leu -tR-Lys ffP 11 Yk3 tRNR

COM3

rRNR -H

NR-G y N45 trr+n s tRkR-Arg tHNR-Rla tRNR-Rsn YRNF-C1u tRNF-p - RNp +strand - RHH -strand

ND3

- CDS +trnd - CtS -trard

Fig 1. Representacin Circular de mtDNA de C. honnivorax (Fuente: Maliplian eta!. 2006).

10.3 Tcnicas Moleculares Utilizadas a. Extraccin de ADN

La aplicacin de diversas tcnicas para la investigacin en el campo de la biologa molecular para el anlisis del genoma depende de la extraccin del ADN puro, con alto rendimiento y de muy buena calidad. Existen varios mtodos para la extraccin del ADN. Su eleccin depender del tipo de tejido a utilizar. Las membranas celulares deben destruirse de manera que el ADN sea liberado dentro del buffer de extraccin. El ADN debe ser protegido de la accin enzimtica, por lo que se utiliza detergentes como EDTA (cido etilene-diamintetractico), agente quelante que une los iones de magnesio. Luego de la incubacin inicial, las protenas desnaturalizadas y la mayora de los

29

carbohidratos son removidos al emulsificar la mezcla buffer y tejido con fenoles o cloroformo (Gallego, 2002).

b.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa PCR-

El PCR es una metodologa in vitro utilizada para sintetizar enzimticamente secuencias definidas de ADN. Este mtodo fue inventado por Kary Mullis en 1983. La reaccin en cadena de la polimerasa permite la amplificacin masiva de las secuencias de ADN especficas, siendo una herramienta importante en la biologa molecular. Esta tiene su fundamento en la anexin de dos cebadores cortos. Cada uno de ellos son complementarios en la secuencia del ADN flanqueante de la regin a ser amplificada (Gaitn y Gallego, 2002). La reaccin usa una plantilla de ADN, dos oligonucletidos cebadores que hibridizan a la cadena opuesta del ADN y la enzima Taq ADN polimerasa, que cataliza la elongacin de los "cebadores. La mezcla de los cebadores, ADN, dNTPs (dexonucletidos trifosfatos), MgCb y Taq es calentada para separar las cadenas del ADN que tienen la secuencia de inters (Cox y Sinclair, 1998; Gaitn y Gallego, 2002).

c. Electroforesis Se conoce como electroforesis al transporte de partculas a travs de un disolvente mediante un campo elctrico. Esta tcnica fue desarrollada inicialmente por Ame Tiselius en 1930 para la separacin de protenas sricas (Bernal, 2002). La mayora de los polmeros biolgicos poseen cargas elctricas, siendo capaces de migrar bajo la

30

influencia de un campo elctrico. Esta es una tcnica muy utilizada en la separacin de cidos nucleicos. En la electroforesis de cidos nucleicos, el efecto de tamiz molecular del gel tambin es el principal factor de la separacin, puesto que la relacin carga- masa es la misma para todos los polinucletidos. Las molculas de menor tamao avanzan ms rpidamente a travs del gel que las de mayor tamao (Freifelder, 1991).

d. Secuenciacin La secuenciacin de nucletidos en el ADN es la portadora de la informacin gentica que codifica por protenas y RNA. En los aos 70 se generaron dos mtodos para realizar este procedimiento. El primero es el mtodo de Maxam y Gilbert (Degradacin qumica), que consiste en la utilizacin de reactivos qumicos que modifican especialmente las purinas y pirimidinas presentes en el ADN, realizando cuatro reacciones. La cadena se rompe de un modo selectivo en cada una de las

posiciones ocupadas por las cuatro bases modificadas. El segundo mtodo es el de Sanger en Inglaterra (enzimtico), el cual se fundamenta sobre dos propiedades del ADN polimerasa, es decir, su habilidad para sintetizar una copia complementaria de una plantilla de ADN y de utilizar 2'3'-dideoxinuclesidos trifosfatos como sustratos. Este mtodo consiste en la sntesis de una cadena complementaria al ADN que se pretende secuenciar. En un ADN de cadena sencilla se aparea un oligonucletido cebadores complementario que acta como cebador (Gaitn, 2002). Segn Hoelzel (1992), la secuenciacin es un mtodo ptimo para la comparacin de poblaciones debido a su alta resolucin y facilidad de interpretacin.

31

e. Secuenciacin en Ciclo Este procedimiento consiste en una amplificacin lineal de la reaccin de secuencia, usando 25 ciclos de desnaturacin y alineamiento de un cebador especfico a una cadena y la extensin en presencia de Taq DNA polimerasa ms dideoxinucleotidos marcados (Fluorescencia). Una de las principales ventajas de esta tcnica es reducir la cantidad de ADN necesaria para la secuenciacin, debido a que se produce una cantidad suficiente despus de 25 ciclos de amplificacin (Gaitn, 2002).

Segn Gaitn (2002) se han determinado las siguientes aplicaciones de la secuenciacin en ciclo: Evolucin de genes, incluyendo estudios del proceso que produce la variacin a nivel de secuencias, estudios del origen de alelos nuevos o loci nuevos e investigaciones de convergencia y seleccin. Estudios de poblaciones o intraespecficos incluyendo estudios de variacin geogrfica, flujo de genes, hibridizacin y conservacin gentica. Estudios interespecficos tales como la construccin de filogenias de especies para evaluar la macroevolucin de patrones y procesos.

15. ESTUDIOS GENTICOS REALIZADOS A C. hominivorax y C macellaria 15.1. Estudios para C. hominivorax Lessinger et al. (2000) determinaron la secuencia del genoma mitocondrial del gusano barrenador del ganado, obteniendo una secuencia de 16,022 pb (pares de bases), indicando que este tamao es tpico de un genoma mitocondrial del suborden Brachycera.

32

Tambin se han realizado varios estudios genticos poblacionales en el gusano barrenador del ganado en varias regiones de Amrica. Por ejemplo, Roehrdanz (1989) realiz estudios de la variabilidad gentica intraespecfica del mtDNA de 30 cepas de C.
hominivorax, desde Texas hasta Costa Rica utilizando 15 enzimas de restriccin,

demostrando que estas poblaciones presentan variacin gentica. Azeredo-Spin, (1993) realiz estudios para 12 poblaciones de Brasil procedentes de 7 localidades encontrando alta variabilidad en el genoma mtADN. De igual forma, estudios de anlisis citogenticos y morfolgicos han sido desarrollados en algunas poblaciones del gusano barrenador del ganado en Norte Amrica y Brasil (Vargas y Lima, 1995). Narang y Degrugillier (1995) realizaron estudios con el gusano barrenador del ganado con poblaciones de Libia y las compar con las de Norte y Centro Amrica, Jamaica y Sur Amrica, utilizando 8 enzimas de restriccin. Tambin Jaramillo y Villada (1999), trabajaron en 6 poblaciones panameas del gusano barrenador del ganado secuenciando el gen Citocromo oxidara I, encontrando que las secuencias no presentaron diferencias significativas concluyendo que en Panam existe panmixia entre las poblaciones estudiadas. Lyra et al. (2005) realizaron estudios en siete poblaciones del gusano

barrenador del ganado y de C. macellaria en distintas zonas geogrficas ganaderas de mayor importancia de Uruguay, observndose nueve haplotipos, demostrando una alta variabilidad en el mtADN de las poblaciones evaluadas. Sin embargo, al aplicar el ndice de similaridad, indic que no hay evidencia de diferenciacin en las subpoblaciones, concluyendo que la poblacin de C. hominivorax de Uruguay es una nica poblacin en equilibrio. Posteriormente, Maliphan, et al. (2006) realiz estudios en

33

poblaciones criadas en el laboratorio de Bioseguridad USDA-ARS de Lincoln, Nebraska, utilizando 30 enzimas de restriccin encontrando 16 sitios de restriccin.

15.2. Estudios para C. macellaria

Lessinger y Azerdo-Espin (2000) dirigieron sus estudios en varias especies de moscas causantes de miasis (Cochliomyia hominivorax, Cochliomyia macellaria, Chrysomya megacephala, Luculia eximia y Dermatobia hominis) en la regin de Control del ADN mitocondrial, encontrando una variacin en la longitud entre especies comprendidas entre 1,000 pb a 1,600 pb. Litjens, et al. (2001) tambin realizaron

estudios en la caracterizacin molecular de C. hominivorax e incluyeron a la especie C. macellaria. Ellos amplificaron dos regiones especficas, Citocromo Oxidasa subunidad I con 870 pb y la Regin Control hasta el gen 12S rRNA con 2,100 pb en siete poblaciones de Brasil.

Con respecto a C. macellaria con tcnicas como RAPD-PCR, RFLP-PCR, etc. estn el de Skoda, et al. (2002) quienes realizaron estudios comparativos con C. hominivorax y C. macellaria utilizando la tcnica ramdon amplified polymorphic DNA polymerase chain reaccion (RAPD-PCR) evaluando 120 "primers" elegidos al azar, de los cuales encontraron 21 "primers" que producen marcadores. Posteriormente fueron estudiados estos 21 "primers", en dnde encontraron que siete de estos producen claros y reproducibles marcadores que fueron evaluados en cuatro poblaciones del gusano barrenador del ganado y C. macellaria.

34

16. CARACTERISTICAS ECOLOGICAS DE LOS LUGARES DE ORIGEN DE LAS CEPAS DE C. hominivorax

16.1 OAXACA, MEXICO Oaxaca esta ubicada al norte 1839', al sur 1539' de latitud norte; al este 9352', al oeste 9832' de longitud oeste. En esta regin predomina el clima tropical. Su temperatura media anual es de 18C. Sin embargo, presenta una geografa provocando variaciones del clima, en los litorales prevalece una temperatura promedio de 27C, mientras que en el valle es de 22 C con clima templado subhmedo. En cuanto a la altitud, la mnima est al nivel de mar, presentando un clima clido, y la mxima se encuentra en la Sierra Madre del sur con 3,750 msnm en donde el clima es templado con inviernos fros. En Oaxaca se encuentran todos los ecosistemas, desde selvas hmedas y bosques tropicales hasta selvas secas, bosques espinosos y zonas desrticas. La precipitacin promedio anual se presenta desde los 509 mm hasta los 3795 mm, dependiendo de la regin (INEGI, 1998; INEGI, 1999; I EGI, 2000; SEP, 1997)

16.2

QUINTANA ROO, MEXICO Geogrficamente Quintan Roo est ubicada al norte 2137', al sur 1753' de

latitud norte; al este 8642', al oeste 8920' de longitud oeste. El relieve es escaso, presentando su altitud mxima a 230 msnm. En este estado predomina el clima tropical con lluvias en verano, excepto en el suroeste y el sureste, donde predomina una temperatura tropical con intensas lluvias peridicas e invierno seco en el norte. Al oeste tambin es tropical, pero con lluvias intensas en verano. Al norte, el clima es de sabana con lluvias peridicas e invierno seco. La temperatura media anual es de 26 C. Su

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precipitacin promedio anual flucta entre 1061 mm a 1393mm. La poca seca es de febrero a mayo y la lluviosa de mayo a octubre, aunque con frecuencia se prolonga hasta enero en forma de chubascos procedentes del norte. La flora vara de acuerdo con el clima, entre selva baja a alta (Campillo, 1988; INEGI, 1998).

16.3 CHIAPAS, MEXICO Chiapas est ubicada al norte 17 59', al sur 1432' de latitud norte; al este 90 22', al oeste 94 14' de longitud oeste. Su territorio est conformado con zona de montaa y de planicie. En la sierra de Chiapas existen grandes extensiones de terreno pobladas por bosques y selvas con plantas y animales de clima templado hmedo. La parte baja de Chiapas est compuesta de bosques caducifolios y praderas y la zona costera de manglares. En general, su clima es tropical hmedo y sub-hmedo, debido a que este cambia dependiendo de la altura del lugar. En Los Altos es templado hmedo y con muchas lluvias en verano. En las localidades de lugares bajos, como Tapachula, tienen clima clido con una temperatura media anual de 27.8 C. En Chiapas llueve en los meses ms calurosos y las lluvias disminuyen en los meses fros. Su precipitacin promedio es muy variable, dependiendo de la localidad, siendo entre 3,977.5 mm para la zona ms lluviosa (Pichucalco) a 1,105.5 mm en San Cristobal de las Casas (Gordillo y Ortz, 1977; SEP, 1997; INEGI, 2000).
0 0

UNIVERSIDAD DB PANAMA

BIBLIOTECA

36

16.4 OESTE DE SAN JOSE, COSTA RICA Las colectas de la cepa de Costa Rica se llev a cabo en el oeste de San Jos, donde se encuentra el territorio de San Ramn de Tres Ros y Coronado presentando una latitud de 9 53'13.70" Norte y una longitud 83 59' 4.95" Este. Esta regin se caracteriza por tener una altitud de 1500 msnm. Pertenece a la zona de vida Bosque Pluvial Montano Bajo. Su precipitacin media anual de 1834.5 mm con una temperatura promedio anual de 19.1 C. Esta regin posee suelos volcnicos con pendientes de 15% a 60%, topografia bastante accidentada. La poca lluviosa est comprendida ente mayo a noviembre y la poca seca de diciembre a abril (Herrera y Gmez, 1985; Gmez y Herrera, 1986; Annimo 1988; Herrera y Gmez, 1993).

16.5 NORTE DE LA CIUDAD DE PANAMA, PANAMA La ciudad de Panam est ubicada a los 9 00' 53" de latitud Norte y 79 31' 02" de longitud Oeste. Su altitud oscila entre 0 y 125 msnm. Presenta clima tropical con una temperatura promedio de 27.7C y humedad relativa promedio anual 70%. El clima en el entorno del distrito y en el rea de la ciudad es lluvioso durante los meses de mayo a diciembre y cuenta con una temporada seca de enero a abril. El viento norte veraniego mantiene el clima fresco constantemente. Esta regin presenta una precipitacin media diaria de 5.1 mm y una humedad relativa media anual de 75%. La temperatura a lo largo del ao oscila entre 25 C y 35 C, dependiendo del mes. La precipitacin anual promedio es de 1900 mm (Diccionario Geogrfico de Panam, 2001; Hidromet, 2006).

37

17. DESCRIPCION DE LA CRIANZA DE LAS CEPAS Cada una de las cepas del gusano barrenador del ganado fueron criadas en laboratorio como poblaciones aisladas. El laboratorio actualmente se encuentra en la planta productora de moscas estriles ubicada en Pacora, Panam. Estas instalaciones cumplen con las caractersticas de un laboratorio de bio-seguridad de nivel 2 (BSL2), siendo apropiado para trabajar fluidos corporales y tejidos que presentan un agente de infeccin que podra ser desconocido. Si el laboratorio es usado correctamente funciona como una barrera primaria. Su uso correcto implica el empleo de mascarillas protectoras, guantes, batas o uniforme especial para el laboratorio. El personal y visitantes deben baarse antes y despus de accesar a eI. Las instalaciones del laboratorio cuentan con las siguientes reas relacionadas con la cra de las moscas:

Cuarto de preparacin de la dieta para las larvas. Lugar donde se tiene los ingredientes y equipo para prepara las dietas. Cuarto de crecimiento larvario, apareamiento y oviposicin. Lugar que posee bandejas plsticas que contienen las dietas. Cuarto de eclosin: en este cuarto las pupas han sido colocadas en pequeos vasos de plstico dentro de una jaula para esperar que las pupas eclosionen. Un cuarto caliente para guardar equipo de trabajo (esterilizacin).

38

a.

b.

Figura 2. a. Jaulas de reproduccin de las moscas, Laboratorio ARS-USDA, Pacora Panam. . b. Bandejas con pupas, Laboratorio de ARS-USDA, Pacora, Panam.

18. CARACTERISTICAS DE REA DE COLECTA DE C. macellaria

La colecta fue realizada en el corregimiento de Pacora, el cual se encuentra dentro del permetro de la ciudad de Panam, a una latitud de 9 04' 59" norte y una longitud de 79 17' 27" oeste. Presenta una altitud entre 20 a 199 msnm. Su temperatura promedio en los meses de colecta (15 de marzo 15 mayo) es de 27.4 C y precipitacin promedio anual 1300 mm. Se ubica en la zona de vida segn Holdridge de Bosque hmedo tropical, aunque parte de ese bosque ha sido deforestado por el crecimiento urbano (Diccionario Geogrfico de Panam, 2001; Hidromet, 2006).

MATERIALES Y MTODOS

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1. MATERIAL BIOLGICO Se utilizaron especimenes de 6 cepas del gusano barrenador del ganado Cochliomyia hominivorax y la especie Cochliomyia macellaria. Las cepas, fueron colectadas en Mxico, Costa Rica y Panam, en las localidades descritas en el cuadro 2 y figura 4. Posteriormente se levant un pie de cra, donde hasta la fecha se mantienen en laboratorio como poblaciones aisladas en jaulas. El cuadro 3 muestra las principales caractersticas morfolgicas que diferencian a cada cepa del gusano barrenador en este estudio.

Cuadro 2. Latitud, Longitud y ao de colecta de las cepas de C. hominivorax y la especie C. macellaria.

Especie Cepa LH P-95 CECH PA-34 CR-92 Limn Lugar de Procedencia Oaxaca, Mxico Norte de la ciudad de Panam, Panam Quintana Roo, Mxico Chiapas, Mxico Oeste de San Jos, Costa Rica Chiapas, Mxico Pacora, Panam Latitud 17.05 9.3333 19.6667 16.5 10 16.5 8.41667 Longitud -96.7167 -82.25 -88.5 -92.5 -84.25 -92.5 -81.67 Ao 1983 1995 1983 1983 1992 1993 2006

C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax C. macellaria

Cuadro 3. Principales caractersticas de las cepas de C. hominivorax. Especie C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax Principales caratersticas LH ojos amarillos CECH ojos rojos LIMON ojos verde claro PA-34 ojos anaranjados P-95 tipo salvaje CR-92 tipo salvaje Cepa

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2. COLECTA DE C. macellaria Durante dos meses (15 marzo 15 mayo de 2006) se realiz la colecta en el campo, iniciando la actividad con la seleccin del sitio adecuado. Estas actividades se realizaron en los campos de Pacora, Panam. Para esto se utiliz como atrayente hgado de pollo, que fueron colocados en un recipiente plstico con tapadera y dejado en un cuarto a temperatura ambiente durante 3 das previos al inicio de la colecta para que se iniciara el proceso de descomposicin y sirviera como atrayente de las moscas. Se coloc el hgado en una bandeja de plstico a un lado del cerco de los potreros, se capturaron las moscas con la ayuda de una red entomolgica. Estas se identificaron y se colocaron en viales. Para la identificacin de la mosca en el campo se usaron los criterios que aparecen en el cuadro 4. Cuadro. 4. Principales caractersticas para diferenciar a los adultos de C. hominivorax de C. macellaria en el campo (lvarez, 1996).
Caractersticas C. hominivorax C. macellaria

Cabeza

Vista dorsal: punto rojo entre los ojos en las hembras. Vista frontal: con pelos frontales

Vista dorsal: sin punto rojo en hembras y machos. Vista frontal: con pelos frontales NO entrecruzados Vista dorsal: con 3 lneas oscuras (las tres del mismo tamao). Pigmento caf claro Vista ventral: pubescencia blanca muy notoria.

entrecruzados. Trax Vista dorsal: con 3 lneas oscuras (las dos externas de iguales y la interna ms corta). Ala: Basicosta ABDOMEN Pigmento caf oscuro Vista ventral: pubescencia blanca poco notoria,

Los viales que contenan las moscas vivas se llevaron al laboratorio, donde se colocaron en un congelador con una temperatura de -26C para que murieran congeladas.

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Luego de un periodo de 4 horas de permanecer en el congelador se sacaron del mismo y se le aplic a cada vial alcohol al 95%. De esta forma, las moscas estaban listas para ser llevadas al laboratorio de Biologa Molecular del Instituto Smithsonian en Naos, Panam.

3. EXTRACCIN DEL mtADN

El ADN se extrajo utilizando CTAB (bromuro de 6,10,3 metilamonio) como extraccin inicial. El trax de cada mosca de las cepas en estudio se macer en la solucin de 2X CTAB (500 l) y se le agreg 10 l de proteinasa K (20p.gli), luego se incub a 55 C por toda la noche. Posteriormente, la mezcla se lav con 5O01 de fenol: cloroformo: alcohol isoamilico (PCI) y mezcl por 5 minutos. Luego se centrifug a 14,000 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se coloc en un tubo nuevo y limpio. Posteriormente, la mezcla se lav nuevamente con 500pl de fenol: cloroformo: alcohol isomilico (PCI) y mezcl por 5 minutos. Despus esta se centrifug a 14,000 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante de estas muestras se extrajo con 500 pl de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) y se mezcl a mano por 5 minutos y se centrifug a 14,000 rpm durante 3 minutos. Posteriormente, el sobrenadante de esta mezcla se extrajo con 500 l de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) y se mezcl a mano por 5 minutos y se centrifug a 14,000 rpm durante 3 minutos. Finalmente el sobrenadante de esta ltima mezcla se agreg 1000 p.l de etanol al 100% y dej precipitar el ADN toda la noche a -20C. Luego de la precipitacin, la mezcla se centrifug a 12,000 rpm durante 45 minutos a 4 C para formar un pellet con el ADN en el fondo del tubo, al cual se le decant el etanol. Posteriormente se agreg 1000 ji1 de etanol 70% a -20C para lavar el

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pellet de ADN y se centrifug a 14,000 rpm durante 15 minutos, este etanol se decant y se con la mquina "Speed Vac" o en la incubadora a 55C. Finalmente, a esta muestra se le agreg 100 l de buffer TE para resuspender el ADN. Al ADN extrado se verific la calidad mediante electroforesis en agarosa.

4.

AMPLIFICACIN DE PCR

Los cebadores rediseados fueron apareados y utilizados en la amplificacin del mt ADN. La reaccin de PCR que se estableci para iniciar la investigacin fue la propuesta por Maliphan et al. (2006). Las reacciones de PCR fueron conducidas en una mezcla de PCR de 25p.l conteniendo 2 g del stock de ADN extrado anteriormente; 2.5 l de la solucin buffer lI T OX PCR; 0.25 pi de Qiagen Taq DNA polimerasa; 2 l de 200 M de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; 0.2 M de cada cebador; 2.5 l de 2.5 mM de MgC12 y agua doblemente destilada para completar el volumen. La mezcla de PCR se coloc en el termociclador PTC-200 Peltier Thermal Cycler.

La reaccin que fue desarrollada en el termociclador emple como base una desnaturalizacin inicial del DNA a 94C por tres minutos. Posteriormente, 94C por un minuto. Despus se dio el reconocimiento de cada cebador de la cadena de DNA a una temperatura entre 50C 60C por 30 segundos (ms adelante se especifica para cada cebador). Luego se pas a la etapa de alargamiento de la nueva hlice de DNA a 72C por un minuto. Despus de 35 termociclos, se hizo un alargamiento final a 72C por dos minutos. Algunos de estos pasos fueron optimizados para lograr la amplificacin,

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procedimiento que se detalla mas adelante. Finalmente, una muestra de los productos amplificados fue visualizada en electroforesis de gel de agarosa. El residuo de la muestra fue almacenado a 4C para futuros anlisis. Los cebadores que fueron evaluados y sus regiones de amplificacin son descritas en el cuadro 5.

Cuadro No. 5 Cebadores utilizados en la investigacin (Maliphan et al. 2006).

CDIGO NOMBRE SECUENCIAS TAMAO (

h)

3F 3R 4F
4R 7F

N2-J-1480
C2-N-3793 C2-J-3662 N3-N-5942 N5-J-7660

7R 8F 8R 9F 9R IOF 1 OR

N5-N-8853 N5-J-8621 N4-N-9676 N4-J-9580 NL-N-10740 NL-J-1075 CR-N- 11872

TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC GAGACCATTACTTGCTTTCAGTCATCT GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG TGATTTCATTCATGATATAAGTCC TTCTGATCATCCCTGATC GTAAAATCTTATAATGCTGG GCTATAGCAGCTGGCAATCAAG CTTATGAACGGATGGGGAGTC TAGGAGGAGCAGCCATATTTGGC GAAGGTCTTGGGCTTTCT AAGCCCAAGACCTTC GATGCACCATTGGCATGT

2450
2320

1194 1076 1161 1148

5. EVALUACIONES PARA CADA CEBADOR 5.1 CEBADOR 3

Primero se us como base el protocolo de Maliphan et al. (2006), al cual se le hicieron las siguientes modificaciones: 2.5 pl de la solucin 1X buffer, 0.75 l de 25 mM de MgC12, 2 l de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 p.l de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 l de 0.025 U/ tl de Taq, 2l de la extraccin del ADN. A partir de este protocolo fueron variando las concentraciones hasta optimizar el protocolo como se describe a continuacin. Las concentraciones del cebador evaluadas para este anlisis fueron de 0.2

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mM y 0.5 mM. Para este cebador tambin se evaluaron dos concentraciones de ADN, el ADN concentrado de la extraccin original y diluido en una relacin 1:10. Para el MgCl2 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.OmM, 1.25mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM. Con respecto a dNTPs, adems de 0.1 mM, se evaluaron las concentraciones de 0.15mM y 0.2mM. Adicionalmente, se evaluaron diversas enzimas Taq procedentes de distintas casas comerciales: Amplitaq, Qiagen Taq y TaqGold. En el buffer tambin se evalu una concentracin adicional a 0.73X.

Se realiz la prueba de gradientes de temperatura utilizando un rango de 48C 60C. Para este cebador tambin se evaluaron algunos cambios en el programa para correr la PCR en el alargamiento de la nueva hlice de ADN a 72C por dos minutos y luego de los 35 termociclos un alargamiento final por 10 minutos.

El protocolo siguiente fue el mejor para obtener amplificaciones: Taq buffer MgCl2 dNTPs Primer QiagenTaq 0.73X 2.0 mM 0.15 mM 0.5 mM 1 U/l

Sin embargo estas fueron inconsistentes entre las cepas de C. hominivorax, por lo que se recomienda a partir del mismo iniciar nuevos estudios. El programa de PCR qued definido como: paso inicial de 94C por un minuto, extensin de 94C por un minuto, 60C por 30 segundos, 72C por dos minutos, 34 termociclos, 72C por 10 minutos.

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5.2 CEBADOR 4 En este cebador, adems del protocolo inicial descrito en el cebador 3, se evaluaron las de 0.2 mM y 0.5 Mm de cada cebador. Para este no fue necesario evaluar las dos concentraciones del ADN, emplendose nicamente el ADN concentrado de la extraccin original. Para el MgC12 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.OmM, 1.25mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM. Para la concentracin de dNTP's adems de 0.1 mM se evaluaron las concentraciones de 0.15mM y 0.2mM. Adems, fueron evaluados diversas enzimas Taq procedentes de distintas casas comerciales: Amplitaq, Qiagen Taq, TaqGold. En el buffer, tambin se evalu una concentracin a 0.73X. Se realiz la prueba de gradientes de temperatura utilizando un rango de 48C 50C. A este cebador, al igual que el cebador 3, tambin fue necesario realizar algunas evaluaciones en el programa para correr el PCR. Los cambios evaluados fueron en el alargamiento de la nueva hlice de ADN a 72C por dos minutos y luego de los 35 termociclos un alargamiento final por 10 minutos.

Luego de todas estas evaluaciones se logr amplificar con el siguiente protocolo: Taq buffer MgC12 dNTPs Primer QiagenTaq 1X 2.0 mM 0.15 mM 0.5 mM 1 U/l

Sin embargo, la amplificacin no fue consistente para todas las cepas, por lo que al igual que el cebador 3, se recomienda a partir del anterior protocolo iniciar las futuras evaluaciones. El programa de PCR que qued finalmente para este cebador fue:

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temperatura inicial 94C por un minuto, temperatura de extensin 94C por un minuto, 51C por 30 segundos, 72C por dos minutos, 34 termociclos, 72C por 10 minutos.

5.3 CEBADOR 7 Para este cebador se realiz inicialmente el protocolo de Maliphan et al. (2006) realizando las siguientes modificaciones: 2.5 l de la solucin 1X buffer, 0.75 pl de 25 mM de MgC12. 2 l de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 l de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 l de 0.025 U/l de Taq, 2l de la extraccin del ADN. La concentracin del cebador evaluada para este fue 0.5 mM. Se emple el ADN concentrado de la extraccin original. Para el MgC12 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM. Para la concentracin de dNTPs, adems de 0.1 mM, se evalu la concentracin de 0.2mM. A este cebador no fue necesario realizar la prueba de gradientes de temperatura, debido a que se utiliz la recomendada por Maliphan et al. (2006) a 52C y funcion perfectamente.

El protocolo qued optimizado de la siguiente forma: Taq buffer MgCl2 DNTPs Primer QiagenTaq 1X 2.0 mM 0.2 mM 0.5 mM 1 U/l

El programa de PCR quedo definido con los siguientes pasos: temperatura inicial de 94 C por 3 minuto, una temperatura de extensin de 94 C por un minuto, 52C por 30 segundos, 72C por un minutos, 34 termociclos, 72C por 2 minutos.

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5.4 CEBADOR 8 Al igual que los cebadores anteriores se utiliz el protocolo de Maliphan et al. (2006), con las mismas modificaciones: 2.5 pi de la solucin 1X buffer, 0.75 pl de 25 mM de MgCl2. 2 pl de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 l de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 pl de 0.025 U/pl de Taq, 2l de la extraccin del ADN. La concentracin de cebador evaluada para este fue 0.5 mM. Para este cebador tampoco fue necesario evaluar dos concentraciones del ADN, emplendose nicamente el ADN concentrado de la extraccin original. Para el MgCl2 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.25mM, 1.5 mM y 2.5mM_ Para la concentracin de dNTPs adems de 0.1 mM se evalu la concentracin de 0.2mM. Se realiz la prueba de gradientes de temperatura utilizando un r an go de 54C 60C. El protocolo final para este cebador qued optimizado de la siguiente forma: Taq buffer MgCl2 dNTPs Primer QiagenTaq 1X 1.25 mM 0.2 mM 0.5 niM 1 U/l

y el programa de PCR qued de fi nido con los siguientes pasos: temperatura inicial 94C por 3 minuto, temperatura de extensin 94C por un minuto, 60C por 30 segundos, 72C por un minutos, 34 termociclos, 72C por 2 minutos.

5.5 CEBADOR 9 Se utiliz el protocolo de MaIiphan et al. (2006) con las siguientes

modificaciones: 2.5 pl de la solucin IX buffer, 0.75 l de 25 mM de MgCl2. 2 pl de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 pl de 0.2 mM de cada echador, 0.25 pl de 0.025 U/pl de Taq, 2p.1

11I^11L1QUu uc la extraccion original. Con respecto aI MgCl2, se evaluaron las

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de la extraccin del ADN. La concentracin de cebador evaluada para este fue 0.5 mM. Se emple nicamente el ADN concentrado de la extraccin original. Con respecto al MgCl2 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.5 mM, 2.5mM, 3.OmM, 3.5mM y 4mM. Para la concentracin de dNTPs adems de 0.1 mM se evalu la concentracin de 0.2mM. No fue necesario realizar la prueba de gradientes de temperatura, debido a que la temperatura propuesta por Maliphan et al. (2006) funcion muy bien. El protocolo final qued optimizado de la siguiente forma: Taq buffer MgC12 dNTPs Primer QuigenTaq 1X 3.0 mM 0.2 mM 0.5 mM 1 U/1

y el programa de PCR qued definido con los siguientes pasos: temperatura inicial de 94C por 3 minuto, temperatura de extensin de 94C por un minuto, 57C por 30 segundos, 72C por un minutos, 34 termociclos, 72C por 2 minutos.

5.6 CEBADOR 10

Se utiliz inicialmente el protocolo de Maliphan et al. (2006), con algunas modificaciones: 2.5 pl de la solucin 1X buffer, 0.75 l de 25 mM de MgC12, 2 l de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 ul de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 l de 0.025 Ulp.l de Taq, 2d de la extraccin del ADN. Se utiliz 0.5 mM de cada cebador. Se emple el ADN concentrado de la extraccin original. Con respecto al MgC12, se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.5 mM, 2 mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM y 4mM, tambin se realiz la prueba de gradientes de temperatura utilizando un rango de 50C 60C.

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El cebador 10 no se logr optimizar, fue inconsistente al amplificar todas las cepas en estudio, sin embargo el protocolo que amplific para algunas cepas fue: Taq buffer MgC12 dNTPs Primer QuigenTaq IX 2.0 mM 0.2 mM 0.5 mM l Ull

y el programa de PCR que se utiliz para este protocolo fue: temperatura inicial 94C por un minuto, temperatura de extensin 94C por un minuto, 59C por 30 segundos, 72C por dos minutos, 34 termociclos, 72C por 10 minutos.

6.

PCR PARA CADA CEBADOR Luego de establecido el protocolo ptimo para cada cebador se realiz el PCR,

utilizando el ADN extrado de dos individuos de cada cepa de C. hominvorax y de C.

macellaria.

7.

VISUALIZACIN DE PCR Para la visualizacin del producto del PCR se corri la electroforesis con gel de

agarosa a una concentracin de 1.5 a 98v. por aproximadamente 45 minutos. Luego se visualiz con luz ultravioleta y se fotografi el gel.

_._4.^. .. v vrauucuvLL 1.7

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8.

PREPARACIN PARA CORTAR BANDAS El producto de la PCR se coloco en un gel de "Low Melting temperature agarose"

a una concentracin de 2.0%. La cmara de electroforesis se carg con el producto del PCR. Esta se dej correr a 98v. aproximadamente por 45 minutos. Luego se visualiz con luz ultravioleta y se fotografi el gel. Posteriormente, el gel se llev a una mesa con luz ultravioleta Foto/Prep I by Fotodyne para cortar las bandas de cada individuo amplificado. Cada una de estas se coloc en un tubos que se llevaron a la mquina termocicladora Perkin Elmer Cetus DNA Therma Cycler 480 en donde permanecieron por 5 minutos a 70C. Luego, se colocaron a 45C, dejndolos por 15 minutos. Despus de transcurrido este tiempo, se les agreg a cada tubo 1.2 l de gelasa y se dejaron en la mquina a 45C.

9. SECUENCIACIN EN CICLO (CYCLE SEQUENCING) La secuenciacin en ciclo se realiz utilizando el siguiente protocolo: 2l de agua doble destilada, 3l de buffer BD 5X, lp.l del cebador "F"/"R", 1 l de big dye y 3l de la banda cortada y tratada con gelasa. Luego la mezcla se centrifug por 30 segundos. Despus de centrifugada se llevaron al termociclador PTC-200 utilizando el programa CS3 100, el cual consisti en una temperatura inicial de 96 C por un minuto, luego 96 C por 10 segundos, seguido de 50 C por 5 segundos, luego a 60 C por 4 minutos, y finalmente 24 ciclos desde el segundo paso. Al terminar este proceso, a los tubos se les agreg 10 l de agua doblemente destilada.

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10. COLUMNAS DE SEPHADEX Las columnas se prepararon con Sephadex G-50. A cada columna se le agreg 780 pl de Sephadex. Luego se colocaron en una centrifugadora a 400 rpm, por dos minutos. A cada columna se le agreg la reaccin de secuenciacin. Luego se colocaron en una centrifugadora a 3,600 rpm por 3 minutos. La reaccin que qued se llev a la mquina Speed vac, se centrifug por 30 minutos para secarlos. A los tubos secos se les agreg 10 pl de diformamida y se corrieron las secuencias en una secuenciadora Applied Biosystem 3130x1 Genetic Analyzer (Hitachi) con un lectura del fragmento del 98.5% de exactitud.

11. OPTIMIZACION DE PROTOCOLOS DE PCR PARA Cochliomyia macellaria Para C. macellaria, se evaluaron nicamente los 3 cebadores que se lograron optimizar para C. hominivorax, los cuales son: a. cebador (7) b. cebador (8) c. cebador (9) F: N5-J-7660; R: N5-N-8853 F: N5-J-8621; R: N4-N-9676 F: N4-J-9580; R: NL-N-10740

11.1. CEBADOR 7 Varias pruebas se realizaron para optimizar este cebador, sin embargo, no se logr la amplificacin. Todas estas pruebas efectuadas se describen en el anexo 1.

11.2. CEBADOR 8 Inicialmente se realiz el protocolo que haba sido optimizado para C. hominivorax. A partir de este protocolo se vari las concentraciones hasta optimizarlo. Las siguientes concentraciones de MgC12 fueron evaluadas: 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y

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3mM. A cada una de ellas se les realiz una prueba de gradiente de temperatura de 50 C a 60 C. Finalmente qued optimizado con el siguiente protocolo: Taq buffer MgClz dNTPs Primer QiagenTaq 1X 1.25 mM 0.2 mM 0.5 mM 1 Ull

El programa de PCR qued definido con los siguientes pasos: temperatura inicial 94C por un minuto, extensin 94C por un minuto, 52C por 30 segundos, 72C por dos minutos, 34 termociclos, 72C por 2 minutos.

11.3 CEBADOR 9 Inicialmente se realiz el protocolo para C. hominivorax que haba sido optimizado. A partir de este protocolo se evaluaron las siguientes concentraciones de MgC12 : 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM. A cada una de ellas se les realiz una prueba de gradiente de temperatura de de 50 C a 60 C. El protocolo que qued optimizado fue: Taq buffer MgCl2 dNTPs Primer QiagenTaq 1X 2.0 mM 0.2 mM 0.5 mM 1 Ull

El programa de PCR qued definido con los siguientes pasos: temperatura inicial 94C por un minuto, de extensin 94C por un minuto, 52C por 30 segundos, 72C por dos minutos, 34 termociclos, 72C por 2 minutos.

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12. REGIONES AMPLIFICADAS A partir de los protocolos definidos se hicieron las PCRs para cada una de las regiones que amplifica cada cebador. Posteriormente, se realiz la secuenciacin en ciclo para obtener las secuencias de cada una de las regiones amplificadas para las dos especies en estudio: C. hominivorax y C. macellaria, lo que permiti obtener el genoma de las regiones NADH4 NADH5 para C. hominivorax y NADH4 para C. macellaria ms una pequea regin de NADH5 que se logr amplificar con el cebador 8.

13. ANALISIS FILOGENETICOS

Las secuencias obtenidas fueron comparadas y corregidas en el programa Sequencher 6.4. Luego fueron alineadas y se prepararon las matrices NEXUS en PAUP*4.Ob10(Altivez). Cada una de las tres regiones secuenciadas fueron analizadas independientemente. Para cada una de las regiones se realizaron anlisis utilizando los criterios de distancias (NJ) y de Parsimonia con el programa PAUP*4.Ob10(Altivez). Para determinar si se poda realizar una anlisis combinado de las tres regiones se realiz un anlisis de Particin en el programa PAUP*4.Ob10(Altivez). Adems se realiz el anlisis de Mxima Verosimilitud (Maximum Likelihood, ML). Luego se realiz el anlisis en MrModeltest y posteriormente se realiz el anlisis Bayesiano. El anlisis de Parsimonia fue realizado utilizando heuristic searches con TBR Branch Swapping. Para conocer el grado de soporte de las ramas se utiliz el anlisis de Bootstrap (1000 replicas). Para el anlisis ML se utiliz Modeltest 3.6 para elegir el mejor modelo de

56

sustitucin en los datos. Los modelos que se utilizaron para el anlisis fueron HKY+1 y GTR+G. El anlisis filogentico Bayesiano fue conducido utilizando MrBayes 3.1.

Todos los anlisis mostraron rboles con similar topologas. Se eligi el rbol filogentico del anlisis Bayesiano para presentarlo en los resultados de la investigacin debido a que este proporciona al mismo tiempo un rbol filogentico con soporte, el cual segn Harrison y Langdale (2006) es conceptualmente equivalente a Maximum Likelihood (ML) con Bootstrapping. Los rboles filogenticos obtenidos de estos anlisis fueron editados en el programa Canvas
9TM.

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RESULTADOS

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1.

OPTIMIZACION DE LOS CEBADORES PARA C. hominivorax

Cuadro 6. Protocolos optimizados de cada cebador evaluado.

C.hominivorax Cebador 7 Buffer MgC12 dNTPs "primer" QiagenTaq 1X 2 mM 0.2 mM 0.5 mM 1 U/ Cebador 8 1X 1.25 mM 0.2 mM 0.5 mM 1 U/ C. macellaria

Cebador 9
IX 3 mM 0.2 mM 0.5 mM 1 J/ji

Cebador 8 IX 1.25mM 0.2 mM 0.5 mM 1 Ul

Cebador 9
1X 2 mM 0.2 mM 0.5 mM 2 U1

Inicialmente se hicieron las pruebas para optimizar los protocolos para las mezclas de la PCR y para el programa del termiciclador. Tres pares de cebadores se Iograron optimizar para C. hominivorax: 7, 8 y 9. Sin embargo no se logr amplificar los cebador: 3, 4 y 10.

2.

OPTIMIZACION DE LOS CEBADORES PARA C. macellaria Debido a que los cebadores 7, 8 y 9 fueron los que se lograron optimizar para C.

hominivorax, estos tambin se eligieron para el caso de C. macellaria. De los cuales se lograron optimizar el 8 y 9.

3.

TAMAO DE LAS REGIONES AMPLIFICADAS El tamao de las regiones amplificadas del cebador 7 fue de 1,110 pb (abarca la

regin NADH4), para el cebador 8 fue de 1,000 pb (abarca parte de las dos regiones NADH4 y NADH5 y el lis ARN). Finalmente el cebador 9 fue de 1,038 pb (abarca la regin NADH5) (Anexo 2).

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4.

RELACIONES FILOGENETICAS DE LAS CEPAS Como se explic en la metodologa, debido a que todos los anlisis (N3,

Parsimonia, Mxima Verosimilitud, Bayesiano) mostraron la misma tendencia, los rboles que se presentan en la investigacin son los obtenidos con el anlisis Bayesiano. A continuacin se describen los resultados obtenidos por cada regin evaluada y el consenso.

4.1. Cebador 7 Los resultados de anlisis de las secuencias obtenidas con el cebador 7 muestran un rbol con una politoma basal para cuatro clados. El primer ciado formado por las cepas de Quintana Roo (CECH) y Oaxaca (LH) presenta un soporte Bayesiano de 86. El segundo ciado, formado por las cepas procedentes de Chiapas (PA-34 y Limn) posee un soporte Bayesiano de 83. El tercer ciado, present un soporte Bayesiano dbil, de 66, constituido por las cepas de Panam (P95) y Costa Rica (CR-92) y finalmente el cuarto ciado comprendiendo solo la poblacin de Brasil. En general, estos resultados indican que a nivel de la regin mitocondrial que abarca principalmente el gen NADHS las relaciones filogenticas muestran una slida tendencia monofiltica entre los clados de Oaxaca y Quintana Roo con el ciado de las cepas de Chiapas. A pesar que el tercer elado est bien definido, como se haba mencionado, su soporte es un poco dbil en esta regin (Figura 4).

60

4.2.

Cebador 8 Los anlisis de las secuencias obtenidas con el cebador 8 muestra un rbol con

poca variabilidad entre las cepas. Se observ una politoma a nivel basal y de caldos. Uno formado por las cepas de Quintana Roo (CECH) y Oaxaca (LH) con un soporte Bayesiano de 99. El segundo est formando por las cepas de Chiapas (Limn y PA-34) con un soporte Bayesiano de 6I (Figura 5).

4.3.

Cebador 9 El rbol filogentico de las secuencias obtenidas del cebador 9, que amplifica

principalmente la regin NADH4, presenta un nodo basal de donde nacen dos dados bien definidos, el primero que agrupa a las cepas de Oaxaca (LH) y Quintana Roo (CECH), presenta un soporte Bayesiano de 84. El segundo nace de una rama de donde salen dos grupos, el primero formado nicamente por la poblacin de Brasil, mientras que el segundo presenta un soporte Bayesiano de 77, de donde nacen nuevamente dos ramas, la primera formando un grupo con las cepas de Chiapas (Limn y PA-34) con un soporte Bayesiano de 96, siendo este tambin un grupo monofiltico slido. El segundo grupo esta formado por las cepas de Panam (P-95) y Costa Rica (CR-(92) (Figura 6).

4.4. Consenso Finalmente se unieron las tres regiones amplificadas, abarcando completamente NADH4 His tRNA NADH5, mostrando consistencia. Este rbol form los mismos cuatro dados de los cebadores 7 y 9, pero con un mayor soporte, siendo estos: el primero formado por las cepas de Quintana Roo (CECH) y Oaxaca (LH) con un 100 de soporte

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Bayesiano, el segundo con un soporte Bayesiano de 91 y est comprendido por tres ramas de donde nacen tres grupos. El primero formado nicamente por la poblacin de Brasil, el segundo un con soporte Bayesiano de 100, formando por las cepas de Chiapas (Limn y PA-34) y el tercero con un soporte Bayesiano de 94 formado por las cepas de Panam (P-95) y Costa Rica (CR-92) (Figura 7).

62
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Figura 4. Arbol filogentico de las cepas C. horinivorax de la regin NAD1i5, mtADN

63

"ya

la Roo, MX

6) la Ro o, MX

W4

MX

5 changos

^R - ^ i QUA Costa Rica

Figura 5. rbol hiogentico de las cepas C. hoi yzinivorcrx de la regin NADH4/NADI I5, mtADN

64

Chrysarnya

1'-95 (2() Panam

5(25) iam

2 (65) . Rica

2 (66) . Rica

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t ipas, MX

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5 changcs

&-^ I Quintana Roo, MX

Figura 6. rbol filogentico de las cepas C. hominivorax de la regin NADI-14 mtADN

65

Chrtnonya

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Lim (56) Chiapas, MX

Lirv --fl (55) Chiapas, MX

?A-34 (36) Chiapas, MX

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hiapas, MX .95 (26) unan*

)5 (25)

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ta Rica
92 (65)

ta Rica H(5) 'aria Roo, MX

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aca, MX

45) 3ca, MX (6) Quintara Roo, MX

10

th uiges

Figura 7. rbol filogentico del consenso de las cepas C. hnniinriorrr.x: regin NADH4 - NAD1T5, rntADN

DISCUSIN

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1. Regiones Amplificadas Los cebadores 7 y 9 muestran la misma topologa formando cuatro clados definidos. Sin embargo, el cebador 8, corno se explic anteriormente, amplifica una pequea regin de los genes NADH 4 y NADHS y la regin completa del tRNA. Los resultados obtenidos con el cebador 8 demuestran una politoma para las muestras procedentes de Panam, Costa Rica y Brasil. Esto puede darse debido a una baja variabilidad en la secuencia de esta regin.

2. Caracterizacin molecular de las cepas de C. hominivorax y C. macellaria

Las secuencias obtenidas de las distintas cepas de C. honainnivorax de las regiones amplificadas pertenecen al ADN mitocondrial, que representa la expresin gentica de la lnea maternal y es considerada como una herramienta muy importante para realizar estudios de poblaciones intraespecificas. En estas secuencias se pueden observar la existencia de un polimorfismo a travs de los cambios que se presentaron en las bases nitrogenadas entre las cepas; as copio los sitios en donde se dan dichos cambios.

Estos cambios son importantes porque son la principal fuente de informacin que se utiliz para realizar los anlisis filogenticos que permitieron demostrar la relacin entre las cepas, tornando en cuenta que estas proceden de zonas actualmente erradicadas, las cuales fueron colectadas y reproducidas en laboratorio.

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La variacin gentica que se observ en los fragmentos amplificados del mtADN permite aplicar otros mtodos, tales como: PCR-RFLP. Este mtodo permite una rpida identificacin de los diversos haplotipos que puedan estar presentes y establecer relaciones entre poblaciones.

Como se ha mencionado, C. macellaria es considerada una plaga secundaria del gusano barrenador del ganado y es morfolgicamente muy similar a este, principalmente en los primeros estados larvales. Uno de los requisitos indispensables para la eficiencia del programa de erradicacin del gusano barrenador del ganado es la correcta identificacin de las especies en los sitios muestreados, debido a que un error puede llevar a liberaciones innecesarias, adems del alto costo de las mismas para la erradicacin de reas errneamente identificadas como infestadas o el diagnstico errneo de una re-infestacin. El aporte de las secuencias de la regin amplificada para C. macellaria y C. hominivorax proporciona informacin gentica para diferenciarlas entre s, principalmente en los muestreos realizados por el programa de erradicacin del gusano barrenador del ganado.

El desarrollo de estas secuencias en la presente investigacin aportan informacin i mportante para estas regiones del genoma (NADH4/NADH5), permitiendo la comparacin entre cepas y poblaciones. Adems, estas ayudarn para futuras comparaciones con otros estudios entre especies del orden Diptera. Por ejemplo, la regin NADH4, has sido estudiada y comparada entre especies del gnero Drosophila por Yu, eta!. (1999).

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Para el caso de C. macellaria, el aporte tambin es muy importante debido a que GenBank reporta secuencias de los genes tRNA Ile, 28S rRNA, subunidad I de Citocromo Oxidasa B, Subunidad I de Citocromo Oxidasa (COI), tRNA-Leu y Citocormo Oxidasa II (COII). Las regiones secuenciadas en esta investigacin es una contribucin que ayuda a incrementar la informacin de su genoma.

3. Relacin molecular entre las 6 cepas de Cochliomyia hominivarax (Coquerel). El anlisis de los resultados muestra que las cepas de Quintana Roo y Oaxaca son genticamente muy similares y forman un solo ciado. Mientras que las cepas procedentes de Chiapas forman un ciado separado y muestran una mayor divergencia gentica con respecto a las cepas de Quintana Roo y Oaxaca (Figura 9). De manera que es muy importante sealar que a pesar que los estados de Oaxaca, Chiapas y Quintana Roo son geogrficamente cercanos en el territorio del rea sur de Mxico, las cepas de estas regiones se separan filogenticamente.

Una estrecha relacin entre las dos cepas de Chiapas podra esperarse debido a la cercana territorial entre ellas, factor que permite su posible apareamiento y retrocruza. Adems, puede considerarse el movimiento interno del ganado en el territorio de Chiapas. Adicional a esto, el territorio de Chiapas est ubicada en un rea montaosa, lo que podra limitar la dispersin de las moscas a otros territorios, principalmente a la planicie del norte de territorio de Chiapas. Por otro lado, el estado de Oaxaca est ubicado ms cercano al territorio de Chiapas que al de Quintana Roo. Sin embargo, en el rbol del consenso, las cepas de Oaxaca (LH) y Quinta Roo (CECH) forman un ciado

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bien definido. Esto pudo haberse debido a un movimiento migratorio de los animales domsticos, principalmente el ganado, ya sea por comercializacin o por pertenecer a fincas afines. La facilidad de dispersin de las propias moscas es relativamente limitada, debido a que el territorio de Oaxaca est localizado en un rea ampliamente montaosa, lo que puede funcionar como una barrera natural para la dispersin de las moscas. Aunque, este territorio tambin presenta una planicie que se extiende hacia Quintana Roo, pudiendo facilitar esta va para su dispersin entre ambos territorios.

Con respecto al ltimo ciado, conformado por las cepas de Costa Rica (CR-92) y Panam (P-95). Esta relacin filogentica pudo haberse debido a las mismas razones que el ciado formado por las dos cepas de Chiapas, ambos pases estn territorialmente cercanos. Adems, es muy probable que se diera el movimiento del ganado, as como la migracin de las moscas entre zonas fronterizas entre los dos pases.

En el rbol filogentico del consenso, se observa una relacin entre el ciado formado por las dos cepas de Chiapas y el constituido por las cepas de Panam y Costa Rica. Esto indica una relacin monofiltica ms cercana. Debido a esto, es posible considerar que el territorio de Chiapas, la ciudad de San Jos, Costa Rica y la Ciudad de Panam tienen en comn la cercana con la carretera Panamericana. Por lo que se puede suponer que este parentesco se deba al trnsito o migracin del ganado. Este movimiento vehicular pudo haber contribuido de alguna manera a que se diera esta relacin gentica. Pese a esto, los clados se dividen conservando claramente su relacin anteriormente mencionada.

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Sin embargo, en el estado de Oaxaca, tambin pasa la carretera Panamericana. Entonces, por qu no existe relacin entre estas cepas con Chiapas? Para contestar esto hay que tomar en cuenta que el territorio de Chiapas est estrechamente cercano con los pases centroamericanos, por lo que la comercializacin ganadera es ms fcil que se llevara a cabo entre Chiapas y Guatemala (reas fronterizas) y los dems pases de Centro Amrica que con los de Quintana Roo (que se encuentra lejos de la carretera Panamericana) y Oaxaca. Adicional a esto, el departamento de Petn, Guatemala, que est muy cercano a Quintana Roo, es un departamento de reas boscosas con una cobertura de 1,880,000 Ha. perteneciente a la Reserva de la Biosfera Maya, pudiendo representar una barrera natural entre el territorio de Quintan Roo con Guatemala (Lpez y Vliz, 1999).

Esta misma cercana entre Chiapas y Guatemala pudo influir en su relacin filogentica, debido a que se ha reportado que la capacidad de dispersin de las moscas ha alcanzado hasta los 290 Km en dos semanas (Jasiorowski, 1993). Esta distancia

abarca territorialmente desde Chiapas hasta las fronteras con Guatemala, El Salvador y Honduras. Adicional a esto el territorio de Chiapas tiene 653.55 Km de frontera con Guatemala, convirtindolo en la puerta de entrada y salida con el mercado Centroamericano (Secretaria de Desarrollo Econmico del Estado de Chiapas, 2006; Rodrguez, 1996).

En cuanto a la relacin filogentica entre las seis cepas evaluadas con la poblacin de Brasil se observ una relacin ms cercana con el ciado formado por las cepas de

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Chiapas, Panam y Costa Rica. En relacin a las reas fronterizas de Panam con Amrica del Sur, la provincia de Darin es limtrofe con Colombia, donde se encuentra el Tapn del Darin, que se extiende a lo largo de la frontera en un 90%. Esta regin, alberga una rica biodiversidad de flora y fauna, que incluye muchas especies endmicas y en peligro de extincin. Adems de su riqueza biolgica, presenta una gran extensin de reas protegidas (Conte, 2006). A pesar de la existencia de esta barrera natural, en 1972 fue firmado un acuerdo cooperativo entre Panam y Estados Unidos, crendose para ello la Comisin para la Prevencin de la Fiebre Aftosa (COPFA), donde se prohibe la cra, ceba, compra o venta de ganado vacuno y porcino en una franja de 20 millas (32 Km) paralela a la frontera con Colombia que Iimit las explotaciones a las existentes a la fecha de la ley en el resto de la provincia (Secretara General de la Organizacin de los Estados Americanos, 1978). Tomando en cuenta que la capacidad de dispersin de mosca del gusano barrenador del ganado es hasta 290 Km en dos semanas, es posible la dispersin y migracin de la mosca entre Panam y Colombia. Debido a lo anterior es i mportante considerar la implementacin de una barrera permanente de liberacin de moscas estriles en toda el rea fronteriza de Panam con Colombia.

Adicional a todos los factores anteriormente mencionados, tambin puede considerarse aI istmo de Panam como un puente biogeogrfico. En Panam, conjuntamente con Colombia y Ecuador se localiza una de las biotas ms abundantes de tierras bajas, de excepcional riqueza y endemismo, con un amplio rango de especies. Las caractersticas fisiogeogrficas del istmo de Panam, tambin han generado una riqueza faunstica que lo ubica como una de las regiones de mxima diversidad biolgica del

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planeta y ha facilitado el intercambio de especies entre el continente americano (Autoridad Nacional del Ambiente, 2003).

Para poder hacer una discusin ms precisa de la relacin filogentica entre las cepas de Costa Rica, Panam y Brasil, es importante conocer la caracterizacin molecular de otras poblaciones de Amrica del Sur. Ya se han realizado estudios moleculares entre poblaciones de Brasil, por ejemplo Azeredo-Espin (1993) realiz una caracterizacin molecular de doce poblaciones de C. hominivorax procedentes de siete localidades de Brasil, demostrando alta variabilidad. Vargas y Azeredo-Espin (1995) encontraron 15 haplotipos entre cuatro poblaciones de C. hominivorax procedentes de So Paulo, los cuales fueron interpretados como un resultado que reduce el flujo de genes entre estas poblaciones. El cladograma de la distribucin geogrfica de los haplotipos observados sugiere que las muestras del barrenador probablemente pertenecen a un mismo linaje evolutivo. Estos patrones que indican polimorfismo intraespecfico entre distintas poblaciones de Brasil lo demostraron Litjens et al, (2001) con el estudio de cinco poblaciones de Brasil.

Por otro lado Lyra et al. (1995) realizaron estudios en siete poblaciones de C. hominivorax, procedentes de Uruguay donde tambin demostraron un alto polimorfismo. El ndice de similaridad, la divergencia promedio de nucletidos y la varianza del anlisis molecular demostraron que no hay evidencia de diferenciacin entre subpoblaciones indicando que las poblaciones de Uruguay forman una panmixia. A pesar de que todas estas investigaciones han sido realizadas en algunos pases de Amrica del Sur; no se

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conocen las relaciones filogenticas de toda la regin sur americana y su relacin con las de Norte Amrica, Centro Amrica y el Caribe.

Otro factor muy importante que hay que considerar en las poblaciones sur americanas, es que durante muchos aos han sido controladas por varios mtodos, principalmente con insecticidas, los cuales con el tiempo pueden llegar a obtener resistencia selectiva, producto de mutaciones. En 1962, LaChance y Hopkins

realizaron estudios en mutaciones de C. hominivorax, considerando que estas podran desarrollar efectos como: desigualdad en la proporcin del sexo en la progenie, causar la muerte de los homocigotos, afectando a un solo sexo de la especie o produciendo otras caractersticas genticas tiles en programas de entomologa. Ellos encontraron nueve mutaciones, que afectan principalmente el color de cuerpo y la venacin de las alas. En Brasil, C. hominivorax ha sido controlada mayormente con insecticidas organofosforados y su uso inadecuado pudo dar lugar a resistencia por seleccin de las moscas. Cambios en la actividad de la carboxilesterasa han sido asociados con el insecticida

organofosforado. Por ejemplo, Carvalho et al. (2006) aislaron y caracterizaron el gen E3 en C. hominivorax, el cual present similares substituciones responsables por estar sometidos al organofosforado, como lo present la especie Lucilia cuprina (Calliphoridae).

En general, una relacin filogentica similar a nuestros resultados ha sido reportada en estudios con C. hominivorax en otras poblaciones. Por ejemplo, Roehrdanz (1989) demostr que dentro de los 16 haplotipos encontrados se present una relacin de

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parentesco entre las cepas de Oaxaca con las de Quintana Roo, mientras que las cepas de Chiapas, Costa Rica y Jamaica formaban haplotipos distintos. Skoda et al. (2002), estudiaron las poblaciones de C. hominivora, procedentes de Mxico (Chiapas, cepa PA34), Costa Rica, Brasil y Jamaica. Ellos demostraron la existencia de un polimorfismo intraespecfico entre las poblaciones, obteniendo a travs del anlisis de agrupamiento UPGMA y posteriormente bootstrapping cuatro dados definidos. Asimismo, estos investigadores obtuvieron un ciado formado por las poblaciones procedentes de Mxico, otro formado por las poblaciones procedentes de Costa Rica. Un tercero constituido por las poblaciones procedentes de Brasil y un ltimo con las poblaciones procedentes de Jamaica. Adicional a estos dados, ellos demostraron una relacin entre la cepa de Mxico (Chiapas, PA-34) con la de Costa Rica, aunque con un soporte de 54%.

Con todos estos anlisis se puede conocer parte de la biogeografia histrica de C.

hominivorax, debido a sus consistencia en la formacin de los dados. A pesar de su

capacidad de dispersin, las cepas demuestran su procedencia filogentica claramente. Tambin, con esta investigacin se aporta informacin de las regiones del ADN mitocondrial estudiadas previamente estudiadas, las que pueden ser comparadas con poblaciones de sur Amrica, que actualmente son una plaga. Es importante continuar con estudios en el genoma del C. hominivorax en reas donde actualmente es una plaga establecida, debido a que en un futuro puede entrar el programa de erradicacin a Sur Amrica. De esta manera se asegurar el xito de las liberaciones de moscas estriles producidas en laboratorio para la erradicacin, as como evitar la re-infestacin en las reas erradicadas.

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CONCLUSIONES

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1.

Se optimizaron tres cebadores para C. hominivorax: el cebador 7 (F: N5-J-7660; R: N5-N-8853), el cebador 8 (F: N5-J-8621; R: N4-N-9676) y el cebador 9 (F: N4-J9580; R: NL-N-10740). Amplificando las regiones del mtADN NADH4 tRNANADH5.

2.

Para C. macellaria se lograron optimizar nicamente dos "primers": el primer 8 (F: N5-J-8621; R:N4-N-9676) y el primer 9 (F: N4-J-9580; R: NL-N-10740) amplificando la regin del mtADN NADH4 ms una pequea regin de NADH5.

3. Se present un evidente polimorfismo que agrupa a las cepas en 3 clados definido y la poblacin de Brasil obtenida del Genbank queda fuera de estos tres clados. Los clados son: 1. 2. 3. 4. Las dos cepas de Chiapas (Limn y PA-34) Las cepas de Panam y Costa Rica (P-95 y CR-92) Las cepas de Quintana Roo y Oaxaca (CECH y LH) Poblacin de Brasil

4.

Las diferencias genticas encontradas entre C. macellaria y C. hominivorax permite distinguirlas molecularmente.

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RECOMENDACIONES

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Optimizar los dems cebadores que quedaron sin amplificar en este estudio, tanto para C. hominivorax como para C. macellaria debido a que esta informacin permitir las comparaciones de otras regiones del genoma entre ambas especies, lo que facilitar la separacin entre ellas a nivel del genoma mitocondrial.

Continuar con los estudios de las cepas trabajadas, incluyendo las moscas estriles producidas en laboratorio y su comparacin con cepas actualmente establecidas como especies nativas procedentes de Sur Amrica e islas del Caribe. Informacin que permitir conocer las relaciones tlogenticos entre ellas lo que aportar conocimientos que contribuirn al xito del programa.

Dentro de los estudios genticos tambin se recomienda incluir los estudios con genes nucleares de C. hominivorax.

Compararlas tambin con poblaciones controladas con insecticidas y reas reinfectadas tomando en cuenta la posible resistencia a ciertos insecticidas.

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88

Anexo

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ANEXO 1 EVALUACIONES REALIZADAS PARA EL PRIMER 7 EN LA ESPECIE

Cochliomyia macellaria

Se realiz inicialmente el protocolo optimizado en la investigacin para C.

hominivorax. Posteriormente se evaluaron las siguientes concentraciones de MgC12: 1.5

mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM, a cada una de ellas se les realiz una prueba de gradiente de temperatura de de 50 C a 60 C. Luego se evaluaron dos concentraciones de MgCl2: 1.5mM y 2.5 mM, con gradiente de temperatura de 40 C a 50 C. Todas estas pruebas descritas fueron corridas con eI programa de PCR siguiente: Una desnaturalizacin inicial del DNA a 94 C, por tres minuto, luego 94 C por un minuto, entre 50 C 60 C por 30 segundos (o de 40 a 50, dependiendo del gradiente evaluado). Un alargamiento de 72 C por un minuto. Despus de 35 termociclos ser hizo un alargamiento final a 72 C por dos minutos.

Posteriormente se evaluaron las concentraciones MgCl2 de 1.5 mM, 2 mM, 2.5mM y 3mM, con el mismo programa de PCR pero con eI nico cambio del tiempo del alargamiento de la nueva hlice de DNA a 72 C por 10 minutos, en dnde tampoco se tuvo xito por Io que fue necesario evaluar dos concentraciones de MgC12: 1.5 y 2.5 mM con los siguientes programas de PCR:

n Una desnaturalizacin inicial del DNA a 94 C, por tres minuto, luego 94 C por un minuto, 45 C por 30 segundos, 72 C por un minuto y luego cuatro termociclos; luego un paso de 94 C por un minuto, 50 C por 30 segundos. Un alargamiento de

72 C por un minuto. Despus de 30 termociclos ser hizo un alargamiento final a 72 C por dos minutos.

n Una desnaturalizacin inicial del DNA a 94 C, por tres minuto, luego 95 C por dos minutos, 50 C por dos minutos, 72 C por cuatro minutos y luego dos termociclos; luego un paso de 93 C por un minuto, luego 50 C por un minuto. Un alargamiento de 72 C por cuatro minutos. Despus de 32 termociclos, 93 C por un minuto, 50 C por un minuto y finalmente 72 C por diez minutos.

Posteriormente se hicieron evaluaciones utilizando el mismo protocolo donde se evaluaron las siguientes concentraciones de MgCl2: 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM, a las que se Ie hizo prueba de gradiente de temperatura de de 50 C a 60 C. Tambin se evaluaron las enzimas TagGold, Amplitaq y Qiagen.

Se evaluaron con el protocolo inicial 3 diluciones diferentes de ADN: 1:10, 1:50 y 1:100. Posteriormente se hicieron evaluaciones utilizando el mismo protocolo, y adems donde se evaluaron las siguientes

adicionndole DMSO al 5%

concentraciones de MgC12: 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM, a cada una de ellas se les realiz una prueba de gradiente de temperatura de de 50 C a 60 C.

A pesar de todas estas evaluaciones realizadas el primer no trabajo.

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