Técnicas aplicadas en

biotecnología
Ing. Lorena Oña, M.Bio.Mol
Ing. forestal
Biotecnología y otras ciencias

 Apoyo de otras ciencias:

 Biología Molecular
 Bioquímica
 Microbiología
 Estudio de ADN, ARN, proteínas u organismos vivos
 Técnicas desarrolladas para el estudio de biomoléculas y organismos vivos
 Tecnología y Bioinformática
 TÉCNICAS MOLECULARES: PCR

 Reacción en cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction)

 Objetivo: Sintetizar una cadena nueva de ADN a partir de una
cadena molde. Copiar o amplificar ADN.
 Requiere:
 ADN polimerasa
 Cadena de ADN molde o templado
 Polinucleótidos
 Primer o iniciador
 Buffer
 Iones Magnesio
 EQUIPO: Termociclador, cámara de flujo y juego de micropipetas
TÉCNICAS MOLECULARES: PCR

 Numerosos ciclos de 3 etapas:

 Denaturación: separa la doble hélice (94 - 98˚C, 30 - 60 seg.)
 Unión del primer: Primer se une al templado por complementaridad (50 - 65˚C, 20
- 50 seg.)
 Extensión: ADN polimerasa añade nucleótidos al primer para formar una cadena
nueva (72˚C, 1000 nucleótidos/min)
 Primer ciclo diferente, requiere:
 Activación de la enzima (95˚C, 2min)
 Último ciclo diferente, requiere:
 Extensión final (72˚C, 2 – 5min)
TÉCNICAS MOLECULARES: ELECTROFORESIS

 OBJETIVO: Separar fragmentos de ADN de

acuerdo a su tamaño
 Agarosa es un polímero extraído de algas,
forma una matriz agujerada
 ADN tiene carga negativa, en presencia de
un campo eléctrico migran al polo positivo
 Distancia recorrida es inversamente
proporcional al tamaño de la molécula de
ADN
 TÉCNICAS MOLECULARES: ELECTROFORESIS
 La migración de ADN depende de:
 Tamaño de la molécula
 Concentración del gel
 Voltaje
 Tipo de agarosa
 Buffer de electroforesis
 Requiere:
 Gel de agarosa más Bromuro de etidio
 Muestras de ADN más buffer de carga
 EQUIPO: Cámara de electroforesis horizontal,
micropipetas
 Detección: exposición a luz UV del gel después de la
corrida
 TÉCNICAS MOLECULARES: SOUTHERN BLOT
 OBJETIVO: Identificar secuencias de ADN,
determinar su tamaño y la cantidad presente en
la muestra
 Incluye 5 etapas:
 Electroforesis
 Transferencia a una membrana de nylon cargada
positivamente
 Hibridación con secuencia marcada
radioactivamente
 Lavado para eliminar moléculas no ligadas
 Detección mediante rayos X
 Previamente, ADN se extrae y se podría digerir
con enzimas de restricción
TECNICAS MOLECULARES: NORTHERN BLOT
 OBJETIVO: Identificar secuencias de ARN, determinar su tamaño y la cantidad
presente en la muestra
 Incluye 6 etapas:
 Extracción de ARN, molécula sensible e inestable
 Producción de sondas, ADN o ARN con nucleótidos marcados radioactivamente
 Electroforesis
 Transferencia a una membrana de nylon cargada positivamente
 Hibridación con sondas, ADN previamente denaturado
 Lavado y detección con rayos X