PRÁCTICA MICROBIOLOGÍA VACIADO EN PLACA.

Preparación del área de trabajo y lavado del material:

1. Lavar perfectamente con detergente y secar con una franela limpia el área
en que se trabajará.

Preparación del material:

El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve

sin contaminar una vez esterilizado hasta el momento de usarlo.

ESTERILIZACIÓN.

1.- Agregar agua a la autoclave hasta donde indique el nivelador.

2.- Introducir el material a esterilizar en la autoclave, de tal forma que queden

ordenados en su interior. Cerrar adecuadamente la tapa (con las llaves
encontradas).
3.- Conectar la autoclave y encenderla.

4.- Esperar que la salida de vapor a través de la válvula sea un flujo

constante, antes de cerrarla.

5.- Esperar que se alcance una temperatura de 121°C (15 lb/pulg2) y a partir
de allí cronometrar 15 mín. (tiempo de esterilización).

6.- Apagar la autoclave antes de desconectar; dejar que salga todo el vapor
lentamente por medio de las válvulas. Verificar que el manómetro marque
cero, antes de abrir la tapa.

7.- Esperar unos minutos para que se enfríe, y sacar el material.

8.- Tener cuidado de no romper el papel húmedo al momento de sacar el

material. Cerrar perfectamente los tubos con tapón de rosca.

9.- Dejar que el material se enfríe antes de guardarlo o usarlo.

Todo el material de vidrio se suele esteriliza con calor seco, generalmente en un

horno, aunque también puede utilizarse el autoclave. Una vez preparadas, se
introducen en estuches o cajas metálicas y se esterilizan en calor seco a 180 °C
durante una hora

Análisis Microbiológicos UJAT-DAMR Elaboro: IBQ Francisco Rodríguez Flores

 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS

OBJETIVOS

 Conocer las condiciones de preparación y esterilización de los medios de

cultivo.

MATERIALES

- Cajas de petri.
- Tubos de ensayo
- Matraz Erlenmeyer 125ml
- Probeta de 100 ml.
- Espátula.
- Placa de calentamiento con sistema de agitación.
- Balanza.
- Imanes.
- Papel estraza.
- Cerillos.
- Autoclave.

MEDIOS DE CULTIVO

- Agar papa dextrosa (PDA).

PROCEDIMIENTO

1.- Realizar los cálculos para determinar la cantidad de agar que se empleará, de
acuerdo a las instrucciones del laboratorio que lo produce (los frascos que contienen
los agares tiene un instructivo donde se indica la cantidad de agar que se debe
preparar por cada litro de agua).

2.- Después de realizar los cálculos pertinentes, pesar las cantidades obtenidas de
agar papa dextrosa en un papel encerado o de aluminio, colocar cada medio en un
matraz Erlenmeyer.

Análisis Microbiológicos UJAT-DAMR Elaboro: IBQ Francisco Rodríguez Flores

3.- Medir en la probeta la cantidad de agua destilada necesaria (según cálculos)
para disolver el medio e introducirla al matraz Erlenmeyer y después agregar el
polvo del agar pesado.

4.- Agitar y calentar en una placa de calentamiento hasta disolver el agar.

5.- Esterilizar el agar en el matraz, a 15 lb/pulg2 durante 15 minutos en

AUTOCLAVE.

6.- Una vez esterilizado, sacar los materiales del autoclave, y dejar enfriar hasta
45°C temperatura en la cual se pueda sostener, sin dejar que se enfrié demasiado
para que no se solidifique el agar utilizar baño maria.

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 SIEMBRA EN PLACA POR HOMOGENIZACIÓN

1.- Se pesa o se mide 10 gr o 10 ml de la muestra analizar y se coloca en el matraz

EM de 150 ml que contiene 90 ml de solución NaCl al 0.9 % para obtener la dilución
madre o dilución 1:10 (10-1). Se homogeniza perfectamente la muestra y se deja
en reposo a temperatura ambiente por 10 min.

10gr De Muestra 10ml De Muestra 90ml de Sol Salina

Solida Liquida (cloruro de sodio al 0.9%)

2.- Transferir, con una pipeta estéril, 100µ de cada dilución de la muestra a placas
de Petri vacías y estériles (Nota: sembrar al menos dos placas por cada dilución).

Trasladar 100 µ
Muestra

Muestra

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3.-Vaciar en condiciones estériles el agar papa dextrosa colocando
aproximadamente de 15 a 20 mLl en cada caja de petri. Dejar solidificar a
temperatura ambiente sobre una superficie plana.

Agar
Papa
Dextrosa
45°C

4.- Homogenizar el agar con el inóculo imprimiendo a la placa suaves movimientos

circulares y de vaivén.

6 Vueltas a la 6 Vueltas a la 6 Vueltas de

Izquierda Derecha vaivén

5.- Esperar a que el agar solidifique en las placas.

6.- Incubar a 35°C por 24hrs.

Incubar cajas
invertidas

Análisis Microbiológicos UJAT-DAMR Elaboro: IBQ Francisco Rodríguez Flores

Realizar el recuento de las colonias en la dilución elegida.

Terminado el tiempo de incubación se cuentan las colonias de cada placa. Cada

colonia se considera como una Unidad Formadora de Colonia (UFC., considerando
como valor total el promedio de colonias contadas entre las dos repeticiones.
Se consideran las placas que tengan de 25 a 250 colonias como las adecuadas
para el informe.

Calculo:
Se informa en UFC/g o ml, se aplica la siguiente formula:

𝐴∗𝐵
- 𝑈𝐹𝐶 ⁄𝑚𝑙 = 𝐶

Dónde:
A: Número promedio de colonias observadas en las dos repeticiones
elaboradas.
B: Factor de dilución (inverso de la dilución) (ID).
C: Volumen de siembra en ml o gr según sea el caso.

Este procedimiento es para cada equipo de trabajo.

Reportar las observaciones de forma, tamaño y agrupación de cada uno de los

cultivos bacterianos de las cajas de Petri en el siguiente cuadro

Nombre de la Medio de Microorganismo Dilución 10-1 10-2 10-3

Muestra Cultivo

UFC
totales/g
UFC
totales/g
UFC
totales/g
UFC
totales/g
UFC
totales/g
UFC
totales/g

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