Microbiología y Química Biológica 2023 3V1

Trabajo Práctico de Laboratorio N°4

CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE BACTERIAS Y HONGOS

Realizaremos 2 técnicas de siembra:
Siembra por agotamiento en la superficie de un medio con agar:
• En pico de flauta (agar inclinado)
• En placa que contiene Agar manitol Salado

Siembra por extensión para el recuento de células viables (UFC/ml)

• En placas que contienen Agar Recuento en Placa (o PCA)
Antes de la siembra se deben preparar las diluciones del inóculo
previamente preparado por la cátedra:
-Colocar 9 ml de caldo estéril en 5 tubos de ensayos y rotularlos
-Rotular las placas de pretri con PCA con los mismos números que los
tubos
-Para realizar la dilución del inóculo se debe tomar 1 mL de la muestra a la
cual se le quiere realizar el recuento, y se lo coloca en el primer tubo de ensayo
que contiene 9 mL de caldo estéril (tubo A), de este tubo se toma 1mL y se lo
coloca en otro tubo conteniendo 9 mL de caldo estéril (tubo B), y así
sucesivamente se realizan las 5 diluciones.
-Siembra por extensión
Se toma una determinada cantidad (generalmente 1 mL) del caldo
conteniendo los microorganismos del tubo A, B, etc. y se lo coloca en la placa de
Petri conteniendo agar sólido como medio de cultivo, se realizan movimientos
suaves con la espátula de Drigalsky para lograr un esparcimiento homogéneo de
la muestra.
-Llevar a incubar a 37°C por 24hs.

Visualización de Hongos y Levaduras al Microscopio

TINCIÓN CON AZUL DE LACTOFENOL
-Colocar en un porta objetos una gotita de azul de lactofenol
-Con una cinta o una pinza colocar en el porta objetos una porción del
hongo/levadura a visualizar
 -Colocar un cubre objetos
-Visualizar al microscopio probando los distintos aumentos

TINCION DE GRAM
Si bien la coloración no requiere de esterilidad, es importante mantener la
esterilidad cuando extraemos microorganismos vivos para no contaminar la
muestra a partir de la cual se realiza la coloración.
---Recordar esterilizar el ansa inmediatamente después de usar---

Realizar el frotis o extendido del material sobre un portaobjeto y secar/fijar a la llama por
tres pasajes sobre ella.
Se cubre la preparación con unas gotitas de solución de Cristal Violeta durante 3
minutos.
Se lava con agua destilada.
Se cubre la misma con unas gotas de Lugol por 2 minutos.
Lavar con agua destilada.
Decolorar con alcohol o alcohol-acetona, no más de 10 segundos.
Lavar con agua destilada.
Colorear con unas gotitas del colorante de contraste (Fucsina o Safranina) por 1 minuto.
Lavar con agua destilada y dejar secar
Colocar una gotita de Aceite de Inmersión y observar en Microscopio.