Machine Translated by Google

Appl Microbiol Biotechnol (2011) 91:211–218 DOI 10.1007/

s00253-011-3257-8

BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

Biodegradación de sulfametoxazol por bacterias

individuales y mixtas

Simone Larcher y Viviane Yargeau

Recibido: 8 de febrero de 2011 / Revisado: 15 de marzo de 2011 / Aceptado: 16 de marzo de 2011 / Publicado en línea: 16 de abril de 2011
# Springer-Verlag 2011

Resumen Los compuestos antibióticos, como el sulfametoxazol
(SMX), se han convertido en una preocupación en el medio ambiente
acuático debido al desarrollo potencial de resistencias antibacterianas.
Debido a la excreción y eliminación, SMX se ha detectado con
frecuencia en aguas residuales y aguas superficiales. La eliminación
de SMX en las plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR)
convencionales oscila entre el 0 % y el 90 %, y existen resultados
opuestos con respecto a su biodegradabilidad a escala de laboratorio.
El objetivo de esta investigación fue determinar la capacidad de
cultivos puros de consorcios individuales y mixtos de bacterias
(Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida,
Rhodococcus equi, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus
rhodocrous y Rhodococcus zopfii) que se sabe que existen en lodos
activados de PTAR. para eliminar SMX. Los resultados mostraron
que R. equi solo tenía la mayor capacidad para eliminar SMX, lo
resistencias
que condujo a una eliminación del 29 % (con glucosa) y la formación de un metabolito.antibacterianas en las bacterias presentes en el medio
Se han propuesto rutas de degradación y estructuras de metabolitos
basadas en las enzimas potenciales producidas por R. equi. Cuando
R. equi se mezcló con otros microorganismos, no se observó un
efecto sinérgico positivo y la máxima eliminación de SMX alcanzada
fue del 5 %. Esto indica
que los resultados de cultivos puros no pueden extrapolarse a
condiciones de cultivos mixtos, y la metodología desarrollada aquí
para estudiar la biodegradabilidad de los compuestos en condiciones
de cultivos mixtos controlados ofrece una alternativa para convenir
Material complementario electrónico La versión en línea de este artículo (doi:10.1007/
s00253-011-3257-8) contiene material complementario, que está disponible para usuarios
autorizados.
S. Larcher : V. Yargeau (*)
Departamento de Ingeniería Química, Universidad McGill, 3610 University
Street, Montreal, QC H3A 2B2, Canadá Correo electrónico:
viviane.yargeau@mcgill.ca
Correo
electrónico de S. Larcher: simone.larcher@mail.mcgill.ca
estudios tradicionales que utilizan cultivos bacterianos puros o
inóculos de fuentes de lodos activados que consisten en poblaciones
microbianas desconocidas y variables.
Palabras clave Sulfametoxazol (SMX) . Antibióticos.
Biodegradación. R.equi. Culturas mixtas
Introducción
La presencia de compuestos farmacéuticos en el medio ambiente
se ha convertido en un problema cada vez más importante debido
a su uso y eliminación generalizados en todo el mundo.
Los compuestos antibióticos representan una de las mayores
preocupaciones, ya que se cree que su presencia generará
ambiente y en el tratamiento biológico de aguas residuales (lodos
activados) (Andersson 2003; Costanzo et al. 2005; Daughton 2003;
Daughton y Ternes 1999, Goni-Urriza et al.2000 , Jorgensen y
Halling-Sorensen 2000, Reinthaler et al.
2003; Volkmann et al. 2004).
El consumo estimado de antibióticos en todo el mundo oscila
entre 100 000 y 200 000 t anuales, y debido a la excreción (que
puede alcanzar hasta el 90 % de la cantidad ingerida como
compuesto original original o como metabolitos) y eliminación, se
han registrado niveles de hasta microgramos por litro. detectado en
aguas residuales sin tratar (Hirsch et al. 1999; Kümmerer 2009a, b,
c; Perez et al. 2005). El compuesto sintético sulfametoxazol (SMX)
es uno de los antibióticos más utilizados (Cavallucci 2007) y, por lo
tanto, se ha detectado con frecuencia en aguas residuales en niveles
de hasta microgramos por litro y aguas superficiales en niveles de
nanogramos por litro (Batt et al. 2007; Benotti 2009; Joss et al.
2005 ; Kolpin et al. 2002; Miège et al. 2009; Peng et al. 2006;
Yargeau et al. 2007).
Machine Translated by Google
212
Se ha medido que las tasas de eliminación de SMX en plantas de
tratamiento de aguas residuales (EDAR) convencionales oscilan entre 0
% y 90 % (Carballa et al. 2004; Jones et al. 2005; Miège et al. 2009;
Ternes et al. 2006; Xu et al. al. 2007) con una eliminación estimada de
hasta el 60% lograda durante el paso de tratamiento de lodos activados
(Göbel et al. 2007). A escala de laboratorio, ha habido resultados mixtos
con respecto a la biodegradación de SMX desde una eliminación
significativa en lodos activados (Perez et al. 2005) hasta una
biodegradación mínima (Joss et al. 2006).
También hay resultados contradictorios con respecto al efecto de la
presencia de una fuente de carbono más fácilmente degradable, desde
un aumento de más del 30 % en la eliminación de SMX usando la prueba
de botella cerrada de la OCDE (Alexy et al. 2004) hasta ninguna
eliminación de SMX con carbono agregado y nitrógeno utilizando un
reactor por lotes de secuenciación a escala de laboratorio (Drillia et al. 2005). mL) en 6 mL de una solución salina estéril al 0,85 % (8,5 g/L de cloruro
El objetivo de esta investigación fue determinar la capacidad de
cultivos puros de bacterias individuales que se han encontrado en lodos
activados (Benedict y Carlson 1971; Rani et al.
2008; Seviour et al. 2008) , así como mezclas controladas de estos
cultivos bacterianos puros para degradar SMX en presencia y ausencia
de una fuente de carbono fácilmente degradable (glucosa).
Materiales y métodos
quimicos
Todos los productos químicos utilizados eran de grado reactivo o de
grado HPLC. El SMX (CAS 723-46-46), el nitrato de amonio (NH4NO3),
el cloruro de calcio dihidratado (CaCl2·2H2O), el sulfato de magnesio
heptahidratado (MgSO4·7H2O) y el kit de ensayo de glucosa (GAHK-20)
se adquirieron de Sigma-Aldrich. , Canadá. El sulfato de hierro
heptahidratado (FeSO4·7H2O), el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA),
el hidrogenomonofosfato de sodio (Na2HPO4), el dihidrogenofosfato de
sodio (NaH2PO4), el extracto de levadura, el ácido fosfórico y el
acetonitrilo (ACN) se adquirieron de Fisher. Científico, Canadá. El
McFarland Standard No. 2 se obtuvo de Biomérieux, Francia; el agar de
infusión de cerebro y corazón (BHI) se obtuvo de Becton-Dickinson and
Co., Canadá; y la glucosa se obtuvo de A & C American Chemicals Ltd.,
Canadá.
bacterias y cultivo
Los cultivos bacterianos puros utilizados en este estudio se obtuvieron de
Cedarlane® Canada y se almacenaron a -80 °C en una mezcla de glicerol/
BHI. Cada bacteria se descongeló y se cultivó individualmente en caldo
BHI durante 24 h en la oscuridad a 26 °C y 150 rpm (INNOVA® 44
Incubator Shaker Series) y luego se sembró en agar BHI. Después de la
incubación durante 24–48 h a 26 °C en la oscuridad, las placas de agar
que contenían cada crecimiento bacteriano se almacenaron en el
refrigerador a 4 °C.
Appl Microbiol Biotechnol (2011) 91:211–218
Las siete bacterias investigadas fueron (ATCC no.): Bacillus subtilis
(6051), Pseudomonas aeruginosa (PA01), Pseudomonas putida (12633),
Rhodoccocus equi (13557), Rhodoccocus erythropolis (4277),
Rhodoccocus rhodocrous (13808) y Rhodoccocus zopfii (51349).
Pruebas de inhibición
Antes de los experimentos con bacterias mixtas, se realizaron pruebas
de inhibición para determinar si las siete bacterias
crecer juntos con éxito. Los resultados de estas pruebas determinaron
las mezclas bacterianas finales estudiadas.
Para cada bacteria, el crecimiento en placas de agar BHI se usó para
hacer estándares celulares (McFarland Standard No. 2; 3x108 células/
de sodio). Usando una micropipeta automática con puntas desechables
estériles, se dispensaron 100 ÿL de cada solución estándar bacteriana en
placas de agar BHI separadas y luego se esparcieron uniformemente
usando hisopos estériles. Se empaparon papeles de filtro estériles (8 mm
de diámetro) en las otras seis soluciones estándar bacterianas individuales
y se colocaron sobre las placas (espaciadas uniformemente) utilizando
pinzas esterilizadas. Las placas se incubaron en la oscuridad durante 24–
48 h a 26 °C y se monitorearon visualmente para determinar cualquier
inhibición bacteriana.
Experimentos de biodegradación
Los experimentos de biodegradación se llevaron a cabo por duplicado
utilizando cada una de las siete bacterias individualmente y las dos
mezclas bacterianas (grupos 1 y 2) se determinaron mediante pruebas
de inhibición y se describen en la sección "Resultados" . De nuevo, para
cada bacteria individual, se usó el crecimiento en agar BHI a 26 °C para
hacer estándares celulares (McFarland Standard No. 2; 3x 108 células/
ml) en 6 ml de solución salina estéril al 0,85 %. Estos estándares celulares
se usaron luego para preinocular matraces Erlenmeyer de 250 mL
(volumen de trabajo de 100 mL) que contenían un medio mínimo de sal
mineral (MMSM), 6 mg/L de SMX y 0,5 g/L de glucosa (en los casos que
se considerara un medio fácilmente degradable). fuente de carbono) y se
colocaron en una incubadora agitadora oscura (24 h, 26 °C, 150 rpm).
Este preinoculante se preparó para aclimatar a cada una de las siete
bacterias a las condiciones de prueba. El MMSM utilizado estuvo
compuesto por Na2EDTA·2H2O (0,018 g/L), FeSO4·7H2O (0,013 g/L),
CaCl2·2H2O (0,013 g/L), MgSO4·7H2O (0,25 g/L), Na2HPO4 (7,5 g /L),
KH2PO4 (5 g/L), NH4NO3 (5 g/L) y extracto de levadura (0,6 g por litro
del volumen de trabajo).
Para los experimentos de biodegradación de bacterias individuales,
después de 24 h de crecimiento, se transfirieron 70 mL del preinoculante
a un matraz Erlenmeyer experimental de 500 mL (volumen de trabajo de
350 mL); mientras que para los experimentos de bacterias mixtas, se
usaron volúmenes iguales de cada crecimiento bacteriano individual
preinoculante (después de 24 h) para inocular el
Machine Translated by Google
Appl Microbiol Biotechnol (2011) 91:211–218
Matraz Erlenmeyer experimental de 500 mL (volumen de trabajo de
350 mL). El volumen total de los preinoculadores bacterianos mixtos
agregados a cada matraz experimental fue de 70 mL (20 % del
volumen total de trabajo). Cabe señalar que, aunque se mezclaron
volúmenes iguales de cada preinoculador bacteriano, dado que cada
bacteria individual experimentó diferentes tasas de crecimiento
durante las 24 h previas a la inoculación, el número de células por
volumen no fue igual. Para determinar si esta mezcla desigual de las
células bacterianas tenía un impacto significativo en los resultados
observados, se llevaron a cabo experimentos adicionales por
duplicado utilizando preinoculantes bacterianos diluidos con MMSM
estéril para lograr un número idéntico de células en las mezclas
probadas. Los frascos experimentales contenían las mismas
proporciones de MMSM, SMX y glucosa (si era necesario) que los
frascos de preinoculación. El SMX presente en los matraces de
preinoculación se transfirió a los matraces experimentales durante la
inoculación, lo que explica que la concentración inicial de SMX fuera
ligeramente superior a 6 mg/l.
Se llevaron a cabo experimentos de control con las bacterias
individuales y mixtas para verificar que los metabolitos detectados
se debieron únicamente a la transformación SMX. Estos controles
se realizaron realizando los experimentos de biodegradación
descritos anteriormente en MMSM±glucosa sin SMX. Se encontró
que la adsorción en cada bacteria era insignificante, como lo indican
los experimentos realizados con bacterias muertas en autoclave
inmediatamente después de la inoculación previa.
métodos analíticos
El crecimiento bacteriano se midió a través de la densidad óptica a
540 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Visible Thermo Evolution
300. Para cada medición, se tomaron muestras de alícuotas de 3 ml
del matraz experimental a lo largo del tiempo utilizando una pipeta
automática con puntas estériles. También se realizaron diluciones
en serie (hasta 10ÿ8 ) en solución salina estéril (0,85 %) y se
sembraron en agar BHI para confirmar visualmente el crecimiento
(después de 24–48 h de incubación a 26 °C en la oscuridad) de cada
uno de los las siete cepas de bacterias, así como para asegurar que
no hubiera contaminación.
Para controlar la concentración de SMX, se extrajeron alícuotas
de 2 ml de cada matraz experimental a lo largo del tiempo y se
centrifugaron a 10 000 rpm durante 10 min (Thermo IEC MicroCL
21). A continuación, se filtró con jeringa un mililitro del sobrenadante
con un filtro de PVDF de 0,22 ÿm directamente en un vial ámbar
para el análisis por HPLC. La determinación de SMX se llevó a cabo
utilizando un HPLC Agilent 1200 equipado con un detector de matriz
de diodos a una longitud de onda de 273 nm y una columna XDB
Phenyl (150 × 4,6 mm, 3,5 ÿm). Las fases móviles consistieron en
NaH2PO4 20 mM (pH 2,8 usando ácido fosfórico) y ACN usando un
gradiente de 30 % a 45 % de ACN durante 10 min; el método utilizó
una columna
213
temperatura de 40 °C, un volumen de inyección de 10 ÿL y un caudal
de 0,7 mL/min. El límite de detección y el límite de cuantificación del
método HPLC fue de 2 y 7 ÿg/L respectivamente, mientras que la
incertidumbre de medición fue del 2 % (basada en la variación de
las mediciones estándar de SMX).
Resultados
Eliminación de sulfametoxazol por bacterias individuales
Las siete bacterias individuales crecieron en presencia de SMX, por
lo que no se observó inhibición del crecimiento bacteriano debido a
la exposición al compuesto antibiótico. En presencia de glucosa, la
mayoría de las bacterias crecieron hasta una densidad óptica máxima
medida a 540 nm (D.O.540) superior a 1, excepto B. subtilis, que
sólo alcanzó una D.O.540 máxima de aproximadamente 0,4. Tanto
R. equi como R. zopfii mostraron el mayor crecimiento en presencia
de glucosa, alcanzando una D.O.540 máxima de aproximadamente
1,3.
En ausencia de glucosa, la DO540 máxima de la mayoría de las
bacterias estuvo en el rango de 0,5 a 0,6, excepto B. subtilis (0,28) y
R. rhodocrous (0,8). Estos resultados se resumen en la Tabla 1 y
demuestran que la presencia de glucosa resultó en un aumento
promedio en la densidad de células bacterianas del 114 % (mínimo
= 54 %, máximo = 170 %).
Las mediciones de glucosa indican que después de 120 h, quedaba
aproximadamente 1,3 a 2,2 % de los 0,5 g/l iniciales en la solución.
Basado en el crecimiento exitoso de casi todas las bacterias, se
esperaba que las eliminaciones de SMX correspondientes fueran
considerables. Sin embargo, la única eliminación significativa de
SMX después de 120 h ocurrió en presencia de R. equi
(aproximadamente 15 % sin glucosa, 29 % con glucosa), mientras
que la eliminación de SMX lograda por las otras seis bacterias
individuales osciló entre 0 % y 6,6 %.
Teniendo en cuenta la incertidumbre de la medición (2 %), la
mayoría de las bacterias no fueron eficaces para eliminar el SMX.
Las curvas de crecimiento (duplicados para cada condición probada)
de R. equi y las eliminaciones de SMX correspondientes se ilustran
en la Fig. 1a, b, y en la Tabla 1 se describe un resumen de todos los
resultados de los experimentos de bacterias individuales .
Los experimentos realizados con R. equi dieron como resultado
la formación de un metabolito (en presencia de glucosa) que se
eluyó 0,3 min antes que SMX durante el análisis de HPLC (Fig. 1b);
esto también se observó que ocurría en los experimentos realizados
con P. aeruginosa con y sin glucosa (Tabla 1).
Determinación de grupos bacterianos mixtos
Como se describe en la sección "Materiales y métodos" , las pruebas
de inhibición se llevaron a cabo con los siete individuos
Machine Translated by Google

214 Appl Microbiol Biotechnol (2011) 91:211–218

Tabla 1 Resumen de los resultados de bacterias individuales: crecimiento máximo (densidad óptica medida a 540 nm) y porcentaje de eliminación de SMX

bacterias Máximo crecimiento (O.D540)

un
SMX porcentaje de eliminaciónb Detección de metabolito

SMX SMX+glucosa MXN (%) SMX+glucosa (%)

B. subtilis 0,28 0,43 <1 2,8±0,03 No

0,24 0,40

P. aeruginosa 0,48 1.07 1,3±0,15 5,6±0,15 Sí (con y sin glucosa)

0,47 1.07

P. putida 0,46 1.25 0 0 No

0,46 1.25

R.equi 0,64 1.36 15±1,6 29±2 Sí (con glucosa)

0,61 1.33

R. eritrópolis 0,60 1.10 2,9±0,15 2,6±0,12 No

0,60 1.00
R. rodocrosa 0,53 1.10 6,6±0,9 4±0.2 No
0,51 1.03

R. zopfii 0,53 1,30 <1 <1 No

0,50 1,29

un
Valores máximos de densidad óptica medidos a 540 nm (O.D540) para cada experimento duplicado
b
Eliminación porcentual promedio de SMX de experimentos duplicados ± rango de valores (después de 120 h)

bacterias para determinar si podrían crecer con éxito

2 juntos. Observaciones visuales del crecimiento de bacterias en
un SMX (1) SMX+0,5 g/L de glucosa (1)
SMX (2) SMX+0,5 g/L de glucosa (2) las placas de agar BHI demostraron que P. aeruginosa

1.5 inhibió el crecimiento de B. subtilis y R. zopfii (es decir, en

(540
nm)
DE
las placas cubiertas uniformemente con B. subtilis y R. zopfii,
se observaron anillos de "ausencia de crecimiento" alrededor de los papeles de filtro
1
empapado en estándar de P. aeruginosa). Basado en la inhibición
resultados de la prueba, se estudiaron dos mezclas bacterianas diferentes.
0.5 El grupo 1 estuvo formado por P. aeruginosa, P. putida, R. equi, R.
erythropolis y R. rhodocrous. El grupo 2 estaba formado por B.
subtilis, P. putida, R. equi, R. erythropolis, R. rhodocrous,
0
0 20 40 60 80 100 120 y R. zopfii.
Tiempo (horas)
Eliminación de sulfametoxazol por mezclas bacterianas
8 9
b
Los resultados de los experimentos con bacterias mixtas se muestran en
Fig. 2a–d. La Figura 2a (grupo 1) yb (grupo 2) muestra que
7
ambas mezclas bacterianas experimentaron un crecimiento similar alcanzando
SMX
(mg/
L) 6
una D.O.540 máxima de aproximadamente 1,2 (SMX+glucosa)
6 y 0,65 (SMX solo). Esto demuestra la misma tendencia
subproductos
máxima
HPLC
Área
de
de

observado con las bacterias individuales de aumento celular

3 densidad en presencia de glucosa. Similar al individuo
5 experimentos con bacterias, la glucosa inicial de 0,5 g/L no fue
SMX (1) SMX (2)
SMX+0,5 g/L de glucosa (1) SMX+0,5 g/L de glucosa (2)
completamente consumido; 7-10% permaneció después de 120 h, y
Subproducto con glucosa (1) Subproducto con glucosa (2) 1.6–2.2% permanecieron después de 300 h.
4 0
0 20 40 60 80 100 120 En el grupo 1 (Fig. 2c), se produjo hasta un 5% de eliminación de SMX en
Tiempo (horas) la presencia de glucosa y también hubo la formación de
un metabolito que se eluyó al mismo tiempo de retención
Fig. 1 Biodegradación de sulfametoxazol (SMX) por R. equi con
durante el análisis de HPLC como el subproducto formado durante
y sin glucosa por duplicado un crecimiento bacteriano; eliminación de b
SMX con el tiempo Eliminación de SMX por R. equi (Fig. 1b) y P. aeruginosa
Machine Translated by Google

Appl Microbiol Biotechnol (2011) 91:211–218 215

2 8 9
SMX (1)
un SMX (2) C
1.5 SMX+0,5 g/L de glucosa (1) SMX
(mg/
L)

(540
nm)
DE
7
SMX+0,5 g/L de glucosa (2)
6

1 6
subproductos
máxima
HPLC
Área
de
de

SMX (1)
SMX (2) 3
0.5 5 SMX+0,5 g/L de glucosa (1)
SMX+0,5 g/L de glucosa (2)
Subproducto con glucosa (1)
Subproducto con glucosa (2)
0 4 0
0 50 100 150 200 250 300 0 50 100 150 200 250

Tiempo (horas) Tiempo (horas)

2 8
SMX (1)
b SMX (2)
d
1.5 SMX+0,5 g/L de glucosa (1) SMX
(mg/
L)

7
SMX+0,5 g/L de glucosa (2)
(540
nm)
DE

1 6

SMX (1)
0.5 5
SMX (2)
SMX+0,5 g/L de glucosa (1)
SMX+0,5 g/L de glucosa (2)
0 4
0 50 100 150 200 250 300 0 50 100 150 200 250 300

Tiempo (horas) Tiempo (horas)

Fig. 2 Biodegradación de sulfametoxazol (SMX) por bacterias mixtas erythropolis, R. rhodocrous y R. zopfii) por duplicado. Crecimiento
grupo 1 (P. aeruginosa, P. putida, R. equi, R. erythropolis y R. bacteriano con y sin 0,5 g/L de glucosa a grupo 1 yb grupo 2; eliminación
rhodocrous) y grupo 2 (B. subtilis, P. putida, R. equi, r. de SMX con el tiempo c grupo 1 y d grupo 2

(Cuadro 1). En ausencia de glucosa, esta eliminación no cambió
pero no se formó ningún metabolito. Los experimentos realizados
con MMSM+glucosa solo confirmaron que este metabolito era el
resultado de SMX y no de la degradación de la glucosa.
Estos resultados demuestran que, en general, hubo una eliminación
mínima de SMX a través de la biodegradación (en ausencia y
presencia de glucosa) por la mezcla de bacterias en el grupo 1.
En el grupo 2 (Fig. 2d), la eliminación máxima de SMX fue de
aproximadamente el 5 % (en presencia de glucosa); sin glucosa, la
eliminación de SMX se redujo a la mitad. No se observó formación
de metabolitos con esta mezcla de bacterias con o sin glucosa.
dilución del inoculante, y en presencia de glucosa, la eliminación de
SMX fue de aproximadamente el 5% para ambos grupos 1 y 2 (con
la formación de un subproducto observada solo en el grupo 1 sin
diluir). En ausencia de glucosa, la dilución redujo ligeramente la
remoción de SMX observada en 1,6 % (grupo 1) y 1,1 % (grupo 2),
lo que está dentro de la incertidumbre en la medición (2 %); por lo
tanto, esencialmente no hubo cambios como resultado de la dilución
previa al inoculante.
Discusión

R. equi, P. aeruginosa y P. putida fueron consistentemente las bacterias individuales

bacterias de crecimiento más rápido durante la preinoculación y,
por lo tanto, fueron los microorganismos dominantes en cada grupo
mixto. Como se discutió anteriormente, se llevaron a cabo
experimentos adicionales utilizando preinoculantes bacterianos
diluidos con MMSM estéril para lograr un número idéntico de células
de las cinco bacterias en el grupo 1 y las seis bacterias en el grupo
2. Los resultados de estos experimentos (Tabla 2, Material
suplementario electrónico) muestran que la dilución de los
crecimientos de preinoculantes bacterianos antes de mezclarlos no
alteró significativamente las tendencias observadas anteriormente.
El crecimiento máximo (medido a través de O.D540) logrado por
ambos grupos mixtos fue prácticamente idéntico independientemente delasí
precomo experimentos a escala de laboratorio . utilizando inóculos de lodos activa
Los resultados de los experimentos de degradación de SMX
llevados a cabo utilizando especies bacterianas individuales
comunes al lodo activado (B. subtilis, P. aeruginosa, P. putida, R.
equi, R. erythropolis, R. rhodocrous y R. zopfii) demostraron que
existe fue solo una ligera eliminación de SMX por parte de seis de
las siete bacterias estudiadas (0–6.6%, Tabla 1). Esto concuerda
con los resultados publicados anteriormente que demuestran que
SMX no es fácilmente biodegradable a través de estudios que
utilizan las pruebas de evolución de CO2, Zahn-Wellens y botella
cerrada de la OCDE (Al Ahmad et al. 1999; Gartiser et al. 2007) ,
Machine Translated by Google
216
(Joss et al. 2006). R. equi fue la única bacteria que se observó que
eliminó efectivamente SMX del 15 % al 29 % con la adición de
glucosa (Fig. 1a, b). La presencia de glucosa no solo aumentó el
crecimiento de R. equi en un 125 %, lo que resultó en casi el doble
de eliminación de SMX, sino que también resultó en la formación
de un subproducto de degradación.
Aunque parece que existe una relación directa entre la presencia
de glucosa que conduce a un aumento de la densidad celular y la
eliminación de SMX, una inspección más detallada de los
resultados en la Tabla 1 muestra que, si bien hubo un aumento
promedio del 114 % en la densidad celular debido a la presencia
de glucosa para todos los experimentos con bacterias individuales,
solo tres de ellos dieron como resultado una mayor eliminación de
SMX (R. equi, P. aeruginosa y B. subtilis). Además, P. putida
exhibió el mayor aumento en la densidad celular debido a la
presencia de glucosa (170 %), pero no hubo eliminación detectable
de SMX con o sin glucosa. El aumento del crecimiento bacteriano
en presencia de glucosa sin un aumento correspondiente en la
eliminación de SMX puede ser el resultado de que estas bacterias
consuman preferentemente esta fuente de carbono fácilmente
degradable, como se ha observado en investigaciones anteriores
con inóculo de lodo activado (Drillia et al. 2005). P. aeruginosa fue
la única otra bacteria cuya degradación SMX resultó en la formación
de un metabolito con y sin glucosa; el aumento del 130 % en la
densidad celular debido a la glucosa resultó en más de tres veces
más eliminación de SMX y una mayor formación de metabolitos (el
área del pico de HPLC se duplicó). Cabe señalar que los
experimentos de control se realizaron como se describió
anteriormente para garantizar que los metabolitos formados fueran
el resultado de la transformación SMX.
Se sabe que el género Rhodococcus está formado por bacterias
capaces de degradar compuestos orgánicos que no son fácilmente
biodegradables y que las bacterias del género Pseudomonas
pueden tener capacidades similares (Larkin et al.
2005; Martínková et al. 2009). Por lo tanto, el éxito de R. equi y P.
aeruginosa no es del todo inesperado, pero las razones de su éxito
en comparación con otras bacterias individuales no están claras.
Se cree que el
la degradación de SMX y la formación de metabolitos se deben a
las enzimas producidas por estas bacterias que no son producidas
en gran medida por las otras bacterias individuales estudiadas.
Utilizando la base de datos de enzimas BRENDA (BRENDA The
Comprehensive Enzyme Information System), se determinaron las
diferentes enzimas producidas por la bacteria y sus características.
Se descubrió que
la arilamina N-acetiltransferasa es producida por las especies de
P. aeruginosa y Rhodococcus en general y que esta enzima tiene
especificidad por las aminas aromáticas y puede utilizar SMX como
sustrato. Se supone que la cepa de R. equi utilizada en este
estudio produjo más arilamina N-acetiltransferasa que cualquiera
de las otras especies de Rhodococcus probadas, lo que resultó en
una mayor eliminación de SMX. Aunque esta hipótesis puede explicar microbiana ( Janke y Fritsche 1985). Sin embargo, esta tendencia esperada no fu
Appl Microbiol Biotechnol (2011) 91:211–218
por qué R. equi fue la especie de Rhodococcus más exitosa, no
explica por qué P. aeruginosa tuvo menos eliminación de SMX
(hasta 5,6 %) y, al mismo tiempo, resultó en la formación de metabolitos.
Esto puede deberse a otra enzima producida por P. aeruginosa:
dihidropteroato sintetasa (DHPS). La función antibiótica de SMX
es la inhibición competitiva de DHPS, que interrumpe la formación
de ácido fólico a partir del ácido 4-amino-benzoico en el cuerpo
humano. Dado que P. aeruginosa produce DHPS, competirá con
la arilamina N-acetiltransferasa que también se produce, lo que
puede haber resultado en la baja eliminación de SMX observada.
Mientras que la arilamina N-acetiltransferasa ataca la amina
aromática de SMX produciendo un subproducto, la DHPS se une
a SMX. Esto puede explicar la detección de un diminuto
subproducto por parte de P. aeruginosa, aunque se observó una
menor eliminación de SMX. El metabolito propuesto tendría una
estructura que contiene un grupo acetilo unido a la amina aromática
en SMX.
También es posible que enzimas adicionales producidas por R.
equi puedan conducir a la hidrólisis del subproducto SMX acetilado.
Se ha encontrado que una cepa de R. equi era capaz de producir
una amidasa que degradaba la lisergamida a ácido lisérgico
(Martínková et al. 2000) y esto pudo haber ocurrido con el
metabolito acetilado de SMX para formar un derivado alcohólico.
R. equi también puede producir uretanasa, que hidroliza anilidas,
y N-acetil-feniletilamina hidrolasa, que hidroliza compuestos N-
acetilados (BRENDA The Comprehensive Enzyme Information
System). El aumento del crecimiento de R. equi en presencia de
glucosa puede haber provocado una mayor producción de estas
enzimas y la formación de un derivado alcohólico del metabolito
acetilado. La similitud de estructura entre el metabolito acetilado y
su derivado alcohólico habría dado como resultado tiempos de
elución de HPLC similares, lo que explica el tiempo de retención
de los subproductos que fue 0,3 min antes que el de SMX. Además,
estos dos metabolitos propuestos son más polares que SMX, lo
que conduciría a la elución observada antes que SMX durante el
análisis HPLC. La Figura 3 (material suplementario electrónico)
ilustra la estructura de SMX y el metabolito acetilado propuesto y
su derivado alcohólico.
bacterias mixtas
Como resultado de las pruebas de inhibición, los consorcios mixtos
estudiados estaban formados por dos grupos diferentes de
bacterias. Se anticipó que los consorcios mixtos de bacterias
podrían tener más éxito en la degradación de SMX, ya que
comúnmente se piensa que los productos químicos sintéticos
resistentes a la degradación por un microorganismo individual
pueden mineralizarse a través de reacciones de transformación
complementarias debido a la participación de más de una especie
Machine Translated by Google
Appl Microbiol Biotechnol (2011) 91:211–218
observado en los experimentos de bacterias mixtas incluso después
de 300 h (Fig. 2c, d). De hecho, los resultados demostraron que R.
equi solo tuvo más éxito (en menos de la mitad del tiempo) que
cualquier grupo de bacterias mixtas para eliminar el sulfamo toxazol
en presencia y ausencia de glucosa. En general, ya sea que se
combinaran o no concentraciones celulares iguales de soluciones
bacterianas para formar un grupo mixto de bacterias (Tabla 2 Material
complementario electrónico), la eliminación máxima de SMX lograda
fue del 5 % después de 300 h. Esto es pobre en comparación con
los resultados de R. equi solo, que logró una eliminación de SMX del
5 % después de solo 24 h y una eliminación del 15 % (sin glucosa)
al 29 % (con glucosa) después de 120 h.
Cabe señalar que el grupo bacteriano mixto en el que se detectó
un metabolito (grupo 1) contenía ambas especies que producían el
metabolito individualmente (P. aeruginosa y R. equi), mientras que
el grupo 2, en el que no se detectó metabolito, solo contenía R.equi.
Por lo tanto, parece que ambas especies individuales capaces de
producir el metabolito debían estar presentes en las mezclas
estudiadas para que el metabolito se produjera y detectara.
Estos resultados demuestran que la capacidad de una bacteria
individual para degradar un compuesto no representa con precisión
lo que ocurre con cultivos bacterianos mixtos, por lo que se ha
desarrollado un método para estudiar la biodegradación de
compuestos usando mezclas controladas de cultivos bacterianos
puros. Esto proporciona una alternativa al uso tradicional de inóculos
de lodos activados de PTAR que contienen comunidades microbianas
desconocidas e inconsistentes. Las eliminaciones contradictorias de
SMX observadas a escala de laboratorio (0–80 %) son el resultado
de esta naturaleza inconsistente del lodo activado, lo que indica que
la composición de un cultivo bacteriano mixto afecta fuertemente los
resultados obtenidos. El método propuesto en este estudio que
utiliza una mezcla controlada de cultivos bacterianos puros
proporciona una técnica de laboratorio para modelar la degradación
biológica de compuestos que se pueden repetir con precisión.
Esto permite la comparación directa de los resultados de los
experimentos que prueban condiciones variables, lo que no es
posible usando lodo activado debido a la naturaleza poco confiable
de la población microbiana.
Agradecimientos Este trabajo fue financiado por el Premio de Doctorado en
Ingeniería McGill (MEDA), la Fundación JW McConnell, el Consejo de
Investigación de Ingeniería y Ciencias Naturales de Canadá (NSERC) y Health
Canada.
Referencias
Al-Ahmad A, Daschner FD, Kümmerer K (1999) Biodegradabilidad de cefotiam,
ciprofloxacina, meropenem, penicilina G y sulfamo toxazol e inhibición de
bacterias de aguas residuales. Arch Environ Contam Toxicol 37(2):158–163
217
Alexy R, Kumpel T, Kummerer K (2004) Evaluación de la degradación de 18
antibióticos en la prueba de botella cerrada. Quimiosfera 57(6): 505–512
Andersson DI (2003) Persistencia de bacterias resistentes a antibióticos. Curr
Opin Microbiol 6(5):452–456 Batt AL, Kim S, Aga DS (2007) Comparación
de la aparición de antibióticos en cuatro plantas de tratamiento de aguas
residuales a gran escala con diferentes diseños y operaciones.
Chemosphere 68(3):428–435 Benedict RG, Carlson DA (1971) Bacterias
heterótrofas aeróbicas en lodos activados. Water Res 5(11):1023–1030 Benotti
MJ, Trenholm RA, Vanderford BJ, Holady JC, Stanford BD, Snyder SA
(2009) Productos farmacéuticos y compuestos disruptores endocrinos en el
agua potable de EE. UU. Environ Sci Technol 43(3): 597–603. doi:10.1021/
es801845a
BRENDA Sistema integral de información sobre enzimas http://www.brenda-
enzymes.org/index.php4 . Consultado el 27 de febrero de 2011 Carballa
M, Omil F, Lema JM, Llompart M, Garcia-Jares C, Rodriguez I, Gomez M,
Ternes T (2004) Comportamiento de productos farmacéuticos, cosméticos
y hormonas en una planta de tratamiento de aguas residuales.
Water Res 38(12):2918–2926
Cavallucci S (2007) Top 200: ¿qué encabeza las listas de medicamentos
recetados este año? Práctica de farmacia, Canadian Healthcare Network.
http://www.imshealthcanada.com/vgn/images/portal/
cit_40000873/13/31/8286270612-TOP200-07-final.pdf .
Consultado el 26 de febrero de 2008
Costanzo SD, Murby J, Bates J (2005) Respuesta del ecosistema a los
antibióticos que ingresan al medio ambiente acuático. Mar Pollut Bull 51(1–
4):218–223 Daughton CG (ed) (2003) Químicos de productos farmacéuticos
y de cuidado personal, vol 1. Agua: ciencias y problemas.
Referencia de MacMillan, Nueva York
Daughton CG, Ternes TA (1999) Productos farmacéuticos y de cuidado personal
en el medio ambiente: ¿agentes de cambios sutiles? Environ Health
Perspect Suppl 107(S6):907–938 Drillia P, Dokianakis SN, Fountoulakis
MS, Kornaros M, Stamatelatou K, Lyberatos G (2005) Sobre la biodegradación
ocasional de productos farmacéuticos en el proceso de lodos activados: el
ejemplo del antibiótico sulfametoxazol . J Hazard Mater 122(3):259–265
Gartiser S, Urich E, Alexy R, Kümmerer K (2007) Última biodegradación y
eliminación de antibióticos en pruebas inherentes.
Chemosphere 67(3):604–613
Göbel A, McArdell CS, Joss A, Siegrist H, Giger W (2007) Destino de las
sulfonamidas, macrólidos y trimetoprima en diferentes tecnologías de
tratamiento de aguas residuales. Sci Total Environ 372(2–3):361–371 Goni-
Urriza M, Capdepuy M, Arpin C, Raymond N, Caumette P, Quentin C (2000)
Impact of an urban efluent on antibiotic resistance of riverine
Enterobacteriaceae and Aeromonas spp. Appl Environ Microbiol 66(1):125–
132. doi:10.1128/ aem.66.1.125-132.2000
Hirsch R, Ternes T, Haberer K, Kratz KL (1999) Ocurrencia de antibióticos en el
ambiente acuático. Ciencia Total Medio Ambiente 225(1–2):109–118
Janke D, Fritsche W (1985) Naturaleza y significado del cometabolismo
microbiano de los xenobióticos. J Basic Microbiol 25(9):603–619 Jones O,
Voulvoulis N, Lester JN (2005) Productos farmacéuticos humanos en los
procesos de tratamiento de aguas residuales. Crit Rev Environ Sci Tech
35(4):401–427 Jorgensen SE, Halling-Sorensen B (2000) Drogas en el
medio ambiente.
Chemosphere 40(7):691–699
Joss A, Keller E, Alder AC, Göbel A, McArdell CS, Ternes T, Siegrist H (2005)
Eliminación de productos farmacéuticos y fragancias en el tratamiento
biológico de aguas residuales. Water Res 39(14):3139–3152 Joss A,
Zabczynski S, Gobel A, Hoffmann B, Loffler D, McArdell CS, Ternes TA,
Thomsen A, Siegrist H (2006) Degradación biológica de productos
farmacéuticos en el tratamiento de aguas residuales municipales: proponer
un esquema de clasificación. Agua Res 40 (8): 1686–1696
Machine Translated by Google
218
Kolpin DW, Furlong ET, Meyer MT, Thurman EM, Zaugg SD, Barber LB, Buxton
HT (2002) Productos farmacéuticos, hormonas y otros contaminantes
orgánicos de aguas residuales en las corrientes de los EE. UU., 1999–2000:
un reconocimiento nacional. Environ Sci Technol 36 (6):1202–1211 Kümmerer
K (2009a) Antibióticos en el medio ambiente acuático: una revisión, parte I.
Chemosphere 75(4):417–434 Kümmerer K (2009b) Antibióticos en el medio
ambiente acuático: una revisión -Parte II. Chemosphere 75(4):435–441
Kümmerer K (2009c) La presencia de productos farmacéuticos en el medio
ambiente debido al uso humano: conocimientos actuales y desafíos futuros.
J Environ Manage 90(8):2354–2366 Larkin MJ, Kulakov LA, Allen CCR (2005)
Biodegradación y Rhodococcus: maestros de la versatilidad catabólica. Curr
Opin Biotechnol 16(3):282–290. doi:10.1016/j.copbio.2005.04.007 Martínková
L, Kren V, Cvak L, Ovesná M, Prepechalová I (2000)
Hidrólisis de lisergamida a ácido lisérgico por Rhodococcus equi A4. J
Biotechnol 84(1):63–66. doi:10.1016/s0168-1656(00) 00332-1
Martínková L, Uhnáková B, Patek M, Nesvera J, Kren V (2009)
Potencial de biodegradación del género Rhodococcus. Environ Int 35(1):162–
177. doi:10.1016/j.envint.2008.07.018 Miège C, Choubert JM, Ribeiro L,
Eusèbe M, Coquery M (2009) Destino de los productos farmacéuticos y de cuidado
personal en las plantas de tratamiento de aguas residuales: concepción de
una base de datos y primeros resultados.
Contaminación ambiental 157(5):1721–1726
Peng X, Wang Z, Kuang W, Tan J, Li K (2006) Un estudio preliminar sobre la
aparición y el comportamiento de los antimicrobianos sulfonamidas, ofloxacina
y cloranfenicol en las aguas residuales de dos plantas de tratamiento de
aguas residuales en Guangzhou, China. Ciencia Total Medio Ambiente
371(1–3):314–322
Appl Microbiol Biotechnol (2011) 91:211–218
Pérez S, Eichhorn P, Aga DS (2005) Evaluación de la biodegradabilidad de
sulfametazina, sulfametoxazol, sulfatiazol y trimetoprim en diferentes etapas
del tratamiento de aguas residuales. Environ Toxicol Chem 24(6):1361–1367
Rani A, Porwal S, Sharma R, Kapley A, Purohit HJ, Kalia VC (2008)
Evaluación de la diversidad microbiana en plantas de tratamiento de efluentes
mediante enfoques dependientes e independientes del cultivo. Bioresour
Technol 99(15):7098–7107 Reinthaler FF, Posch J, Feierl G, Wust G, Haas
D, Ruckenbauer G, Mascher F, Marth E (2003) Resistencia a los antibióticos de E.
coli en aguas residuales y lodos. Water Res 37(8):1685–1690 Seviour R,
Kragelund C, Kong Y, Eales K, Nielsen J, Nielsen P (2008) Ecofisiología de
las actinobacterias en sistemas de lodos activados. Antonie Leeuwenhoek 94(1):21–
33 Ternes T, Janex-Habibi ML, Knacker T, Kreuzinger N, Siegrist H (2006)
Evaluación de tecnologías para la eliminación de productos farmacéuticos y
de cuidado personal en instalaciones de alcantarillado y agua potable para mejorar
la reutilización indirecta de agua potable (POSEIDON Final Report-EU
Research Programme) http://poseidon.bafg.de/servlet/is/2888/ . Consultado
el 1 de febrero de 2008 Volkmann H, Schwartz T, Bischoff P, Kirchen S, Obst
U (2004)
Detección de genes de resistencia a antibióticos clínicamente relevantes en
aguas residuales municipales mediante PCR en tiempo real (TaqMan). J
Microbiol Met 56(2):277–286
Xu W, Zhang G, Li X, Zou S, Li P, Hu Z, Li J (2007) Ocurrencia y eliminación de
antibióticos en cuatro plantas de tratamiento de aguas residuales en el delta
del río Pearl (PRD), sur de China. Agua Res 41(19):4526– 4534
Yargeau V, Lopata A, Metcalfe C (2007) Productos farmacéuticos en el río
Yamaska, Quebec, Canadá. Calidad del agua Res J Bote 42(4): 231–239